盧文麗 宋秋佳 潘志強(qiáng) 方肇勤

上海中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 (上海, 201203)

原發(fā)性肝癌(PLC)是我國難治性惡性腫瘤之一，病死率高，腫瘤引發(fā)的侵襲、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)是致死的主要原因[1]。在針對PLC的多種治療方法中，基于辨證論治理論的中醫(yī)藥療法，如健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治則治法及方藥，在預(yù)防和降低肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率等方面具有一定的優(yōu)勢[2～6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)：行氣活血中藥預(yù)知子(又名八月札)具有抑制肝癌細(xì)胞增殖作用，且影響到HepG2肝癌細(xì)胞眾多基因，如整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附通路基因表達(dá)。因此，我們擬進(jìn)一步獲得預(yù)知子籽乙醇提取物(ATKS)，設(shè)置不同的濃度和時間節(jié)點干預(yù)HepG2肝癌細(xì)胞，以觀察對其增殖和形態(tài)的影響；同時篩選該通路上的高表達(dá)基因SEPP1及其上游基因CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5，觀察藥物作用后mRNA表達(dá)變化，以及SEPP1蛋白表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 HepG2人肝癌細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所。細(xì)胞置于含10% 胎牛血清、100U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2充分濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d 傳代一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2 藥物與試劑 預(yù)知子購自上?？禈蛑兴庯嬈邢薰?。RPMI 1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素-鏈霉素(100×)、0.25%胰酶-EDTA和Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自Thermo Fisher Scientific公司；四甲基偶氮哇藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司；Trizol購自Invitrogen 公司。鼠抗人SEPP1單克隆抗體購自Abcam公司，兔抗人GAPDH單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、BeyoECL Plus(超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒)等均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq均購自Takara公司。

1.3 PCR引物設(shè)計及序列 引物由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物序列見表1。

表1 SEPP1等基因引物序列(5’-3’)

1.4 主要儀器設(shè)備 R-220 SE旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI )；YJ-875G凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)；Model 310 二氧化碳培養(yǎng)箱(ThermoFisher)；CKX41 熒光倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)；ELX-800 全自動酶標(biāo)儀(BioTek Synerge 2，BioTek Instruments)；7500 fast 實時熒光定量PCR 系統(tǒng)(Life Technologies)；WB小型垂直電泳槽(Bio-rad)、化學(xué)發(fā)光高靈敏度凝膠成像與分析系統(tǒng)FLuorChem E(Protein Simple)。

1.5 中藥預(yù)知子乙醇提取物制備 乙醇回流法，從飲片中挑選出預(yù)知子的籽部分，60℃ 干燥過夜，粉碎；以10 倍量體積75%乙醇浸泡2h，80℃回流2 次，2h/次；合并回流液，過濾，濃縮，定容至0.5g /ml 濃度；濾過除菌，分裝標(biāo)記，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 MTT法檢測細(xì)胞存活率 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種入3 塊96 孔板中，過夜后待細(xì)胞融合率在50%作用，以不同濃度的預(yù)知子籽藥液(0.9mg/ml、1.2mg/ml、1.5mg/ml、1.8mg/ml、2.1mg/ml、2.4mg、2.7mg/ml、3.0 mg/ml)分別作用于細(xì)胞，另設(shè)空白組(無細(xì)胞及藥物)和對照組(含細(xì)胞，無藥物干預(yù))，每組設(shè)8個復(fù)孔。24 h、48 h 和72 h 后，分別進(jìn)行MTT 檢測(72h檢測前于顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)并快速拍照)，吸棄原培養(yǎng)液后加入200μl /孔0.5 mg /ml MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄MTT 溶液，加入150μl /孔DMSO 溶液，避光振搖10 min 后，在全自動酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測各孔的吸光度。計算細(xì)胞成活率(%) =(用藥孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)×100%。

1.7 分組及預(yù)知子提取物(ATKS)處理細(xì)胞 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種入6 孔板中，過夜后待細(xì)胞融合率70～80%，以MTT檢測72h 致細(xì)胞抑制率約為50%的藥物濃度(即2.0mg/ml)作用于細(xì)胞，對照及中藥組均各設(shè)4個復(fù)孔。72h后，采用1×PBS漂洗各孔1次，再收集細(xì)胞，其中2孔用于提取RNA進(jìn)行RT-qPCR，另2孔用于提取蛋白進(jìn)行Western Blot實驗。

1.7.1 RTqPCR方法檢測SEPP1 基因表達(dá)量 按Trizol 說明書抽提細(xì)胞總RNA，并按PrimeScript RTreagent Kit 和SYBR Premix Ex Taq說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄RT和實時熒光定量PCR，PCR反應(yīng)程序均為95℃×1min→95℃×30S，60℃×30s(40個循環(huán))。采用ΔΔCT法計算SEPP1基因mRNA相對表達(dá)量，以ACTB作為內(nèi)參基因。結(jié)束后取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳。

1.7.2 Western Blot檢測SEPP1 蛋白表達(dá)量 以RIPR裂解液[50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1% NP-40，0.5% sodium deoxycholate，0.1% SDS]收獲細(xì)胞，4℃條件下12000rpm離心15min，取上清液并測定蛋白濃度；蛋白上樣量為20μg，SDS-PAGE膠濃度為8%，蛋白被轉(zhuǎn)移至0.45 μm PVDF膜上，SEPP1一抗(1：2000)4℃條件下?lián)u床孵育過夜，二抗(1:2000)室溫孵育1h，BeyoECL 顯色后采用成像與分析系統(tǒng)獲得條帶，以GAPDH作為內(nèi)參。采用Image J圖像軟件進(jìn)行灰度值計算。

2 結(jié)果

2.1 ATKS對HepG2肝癌細(xì)胞存活率的影響 ATKS對HepG2肝癌細(xì)胞增殖存在抑制作用，且呈時效和量效關(guān)系，隨著時間延長，劑量加大，抑制作用越強(qiáng)。ATKS作用48h對HepG2肝癌細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度約為2.3mg/ml；72h時間節(jié)點的半數(shù)抑制濃度約為2.0mg/ml，取該劑量用于后續(xù)實驗，見圖1。

圖1 不同濃度和時間點ATKS對HepG2細(xì)胞的抑制作用

2.2 ATKS干預(yù)72h對HepG2肝癌細(xì)胞形態(tài)的影響 在0.9mg/ml、1.2mg/ml等較低濃度ATKS作用下，細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量幾乎沒有什么變化；隨著ATKS濃度的升高(1.5mg/ml～2.1 mg/ml)，HepG2細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞形態(tài)開始受到影響；ATKS 2.4 mg/ml以上時細(xì)胞數(shù)量銳減，狀態(tài)變差，HepG2細(xì)胞所特有的重疊生長特征基本消失，藥物細(xì)胞毒作用凸顯，見插頁圖2。

2.3 ATKS對SEPP1等基因表達(dá)量的影響 2.0mg/ml ATKS作用72h后，與對照組比較，SEPP1基因mRNA表達(dá)量明顯降低，其余5個基因卻出現(xiàn)上調(diào)趨勢，見表2和圖3。

表2 ATKS作用72h后各基因表達(dá)量變化

與對照組比較，*P< 0.05

圖3 ATKS作用72h后各基因表達(dá)量變化

2.4 ATKS對SEPP1蛋白表達(dá)量的影響 2.0mg/ml ATKS作用于HepG2細(xì)胞72h后，SEPP1蛋白表達(dá)量明顯降低，其相對表達(dá)量(SEPP1/GAPDH)為0.642±0.070(P< 0.05)。與mRNA表達(dá)量變化趨勢存在一致性。見圖4，圖5。

圖4 ATKS作用72h后SEPP1蛋白表達(dá)量變化

圖5 ATKS作用72h SEPP1蛋白條帶

3討論

我們早期針對肝癌臨床辨證論治的流行病學(xué)調(diào)查研究[2-4]，以及相應(yīng)中藥復(fù)方用藥規(guī)律的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，各治法下所使用藥物及頻次有其客觀規(guī)律[5，6]：行氣活血藥中，預(yù)知子(又名八月扎)、丹參、赤芍、桃仁、柴胡、郁金使用較多，其中預(yù)知子的用藥頻次接近43%，提示其在肝癌治療用藥中的重要性。但是，以往預(yù)知子在腫瘤抑制方面的機(jī)制研究較少，推測與預(yù)知子多以組分的形式出現(xiàn)在腫瘤治療的復(fù)方中有關(guān)。僅有少量研究報導(dǎo)，預(yù)知子水提物、預(yù)知子籽醇提物、以及從預(yù)知子中提取的木通皂苷類成分具有抗腫瘤活性[13,15]。因此，預(yù)知子的藥效及作用機(jī)制存在較大的研究空間，涉及單味藥、聯(lián)合用藥以及有效成分等多個方面。

因此，我們采用健脾益氣、行氣活血、清熱解毒等治法代表性復(fù)方制劑，進(jìn)行體外實驗，觀察其對肝癌細(xì)胞惡性增殖作用的影響，發(fā)現(xiàn)行氣活血復(fù)方對肝癌細(xì)胞惡性增殖具有一定的抑制作用，且隨著劑量的加大，其抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用顯著增強(qiáng)[7]。我們進(jìn)一步在行氣活血復(fù)方中篩選可能起著主要作用的藥物，發(fā)現(xiàn)預(yù)知子的抑制作用值得關(guān)注[8]。之后，進(jìn)一步分拆預(yù)知子的不同部位，發(fā)現(xiàn)預(yù)知子籽的藥效最為顯著[9，10]。預(yù)知子籽的正丁醇萃取物影響到HepG2細(xì)胞眾多通路基因表達(dá)，其中整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附通路(KEGG PATHWAY Database)值得關(guān)注，而前期芯片結(jié)果顯示，藥物未作用前，SEPP1及其上游的CAPNS1、ITGA2、ITGAV、ITGB1和ITGB5等6個基因是該通路中最高及較高的差異表達(dá)基因[11]。SEPP1基因與多種腫瘤相關(guān)，涉及細(xì)胞黏附、轉(zhuǎn)移、增殖等[12～16]。在涉及腫瘤組織SEPP1的表達(dá)及調(diào)控機(jī)制時，多圍繞抗氧化應(yīng)激展開，但許多內(nèi)在機(jī)制仍未被闡明。

在此背景下，我們進(jìn)一步設(shè)置了不同的濃度和時間節(jié)點，觀察到預(yù)知子籽的乙醇提取物(ATKS)確實能有效抑制HepG2肝癌細(xì)胞增殖，并具有量效和時效關(guān)系；ATKS處理后SEPP1基因表達(dá)明顯下調(diào)，CAPNS1、ITGA2、ITGAV、和ITGB1等基因表達(dá)上調(diào)，與前期芯片結(jié)果一致；但是ITGB5的上調(diào)趨勢與前期芯片結(jié)果相反，可能是由于預(yù)知子籽的正丁醇萃取物和乙醇萃取物中有效成分差異所致。此外，鑒于SEPP1是該通路中的最高表達(dá)基因，且與其他基因存在不同的變化趨勢，我們進(jìn)一步觀察了其在蛋白層面上的變化，發(fā)現(xiàn)與其mRNA水平的變化存在一致性的下調(diào)?？傮w上認(rèn)為，以上基因或蛋白層面上的變化，體現(xiàn)了ATKS對HepG2細(xì)胞增殖抑制作用的部分機(jī)制。

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