［KH－*3D］王帥，賈琦珍，陳根元，王連群，張玲*

(1．塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響

［KH－*3D］王帥1，2，賈琦珍2，陳根元2，王連群1，2，張玲1，2*

(1．塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300)

研究小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步探討小花棘豆的中毒機(jī)理。將24只雄性家兔隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，試驗(yàn)組分別按照Ⅰ組15%(苦馬豆素含量30 mg/kg)、Ⅱ組30%(苦馬豆素含量60 mg/kg)、Ⅲ組45%(苦馬豆素含量90 mg/kg)的比例添加小花棘豆，對(duì)照組僅飼喂苜蓿干草，試驗(yàn)期70 d。分別于攻毒后第14、35、70天每次每組隨機(jī)采集2只家兔的睪丸，通過(guò)TUNEL法定位，Hoechst 33258熒光染色細(xì)胞核，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。從第35天開(kāi)始，試驗(yàn)組家兔生精細(xì)胞凋亡率均極顯著升高(P﹤0．01)，表現(xiàn)為細(xì)胞膜下陷，細(xì)胞器濃縮，細(xì)胞核碎裂等，并出現(xiàn)凋亡小體。試驗(yàn)組家兔睪丸單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞凋亡率均極顯著升高(P﹤0．01)，但四倍體細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著變化。與對(duì)照組相比，中毒家兔睪丸生精細(xì)胞G0/G1期數(shù)量升高，S期細(xì)胞數(shù)量降低，而且G1期與S期細(xì)胞數(shù)量呈顯著的負(fù)相關(guān)。小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔睪丸組織生精細(xì)胞凋亡，且與小花棘豆毒性成分呈現(xiàn)一定的時(shí)間－劑量效應(yīng)。

小花棘豆;苦馬豆素;生精細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期

小花棘豆(Oxytropis glabra DC)為豆科棘豆屬植物，是南疆阿克蘇、克州、和田等地區(qū)分布最廣泛，危害最嚴(yán)重的有毒植物。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，南疆地區(qū)已有近15%的天然草場(chǎng)中廣泛叢生小花棘豆，其蓋度均在50%左右，嚴(yán)重的蓋度可達(dá)95%以上;放牧家畜每年采食小花棘豆中毒的數(shù)量約為50 000～100 000只(頭)，其中50%以上的中毒家畜死亡［1］。中毒家畜主要表現(xiàn)為繁殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損傷，其中睪丸、卵巢、腦組織等器官均出現(xiàn)細(xì)胞空泡變性、細(xì)胞核萎縮等病理變化［2］。王帥等［3－4］研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆的主要毒性成分是苦馬豆素(Swainsonine，SW)，可導(dǎo)致中毒動(dòng)物睪丸萎縮、精子數(shù)量與活性降低，最終導(dǎo)致雄性動(dòng)物生精功能障礙。龐龍［5］通過(guò)建立大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元體外培養(yǎng)模型，檢測(cè)了SW對(duì)大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。其研究發(fā)現(xiàn)SW對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存在明顯的劑量－效應(yīng)毒性作用，并導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡率顯著增加。張樑［6］進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SW可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞胞核濃縮，DNA片段化，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。其作用機(jī)理為SW可影響caspase-8和caspase-3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，而不是經(jīng)線粒體通路介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。目前有關(guān)SW對(duì)細(xì)胞凋亡的影響的試驗(yàn)主要集中于其對(duì)癌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的作用上，對(duì)生精細(xì)胞的凋亡及基因表達(dá)未見(jiàn)報(bào)道。生精細(xì)胞正常情況下可通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式清除異常細(xì)胞，但外源毒素誘導(dǎo)的生精細(xì)胞大量凋亡會(huì)導(dǎo)致睪丸細(xì)胞退化，其繼發(fā)性損害可嚴(yán)重影響動(dòng)物的生殖能力。本課題組前期研究［2］發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒家兔睪丸指數(shù)極顯著升高，HE染色后鏡檢發(fā)現(xiàn)中毒家兔睪丸間質(zhì)細(xì)胞、生精上皮細(xì)胞等出現(xiàn)空泡變性，但其中毒的分子作用機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)通過(guò)制備亞慢性小花棘豆中毒家兔模型，探討小花棘豆中毒誘導(dǎo)家兔生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

原位凋亡檢測(cè)試劑盒，德國(guó)Boechringer Mannheim公司;Hoechst 33258染液，Beyotime(中國(guó))公司;Annexin V-FITC Apoptsis Detection KIT，美國(guó)BD公司，DNA-PERP STAIN細(xì)胞周期試劑盒，美國(guó)Beckman Coulter公司。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CKX41型倒置相差顯微鏡，IX71型倒置熒光顯微鏡，日本Olympus株式會(huì)社;FAC Scam型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司;5810 R型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorff公司;DSC型切片機(jī)，HI1220型溫控烤片臺(tái)，德國(guó)Leica公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

雄性家兔24只，體質(zhì)量(2．0±0．1)kg，平均分為對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組，分籠飼養(yǎng)。對(duì)照組僅飼喂青苜蓿干草，3個(gè)試驗(yàn)組分別飼喂摻入小花棘豆15 %、30%和45%(按氣相色譜法計(jì)算苦馬豆素含量分別為30、60和90 mg/kg［7］)的混合干草，試驗(yàn)期70 d。試驗(yàn)第14、第35和第70天各組分別剖殺2只家兔取睪丸，將家兔睪丸組織在4℃下沿橫斷面劈開(kāi)，部分置于Bouin’s液中后固定24 h后常規(guī)方法脫水、透明，石蠟包埋后制作切片，片厚4 μm。切片貼于涂有3-氨丙基三乙氧基硅烷的載玻片上，37℃過(guò)夜后用于TUNEL染色;部分睪丸組織剪成1～2 mm大小，置于5 mL PBS液(pH 7．4)中，渦旋振蕩3 min后使用200目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，1500 r/min離心5 min后棄去上清，再置于5 mL PBS液中混勻。相同條件下重復(fù)3次即得到單細(xì)胞懸液，用于Hoechst 33258染色和細(xì)胞周期比例的檢測(cè)。

1．3 TUNEL法檢測(cè)小花棘豆中毒家兔生精細(xì)胞凋亡

將組織切片依次使用二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇和75%乙醇洗滌;然后使用3%H2O2處理10 min，去離子水洗滌;然后利用Proteinase K 37℃消化10 min，0．01 mol/L TBS洗滌;每個(gè)切片加標(biāo)記緩沖液18 μl，TDT 1 μl，DIG-d-UTP1 μl，混勻后甩去切片上液體，加標(biāo)記液20 μl，37℃反應(yīng)2 h;0．01 mol/L TBS洗滌后加封閉液50 μl，室溫反應(yīng)30 min;棄去封閉液，用抗體稀釋液將生物素化抗地高辛抗體稀釋至1∶100，每片加50 μl，37℃反應(yīng)30 min;0．01 mol/L TBS洗滌后加1∶100 SABC 50 μl，37℃反應(yīng)30 min;然后DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片。以細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為凋亡的細(xì)胞。

1．4 Hoechst 33258染色檢測(cè)小花棘豆中毒家兔生精細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化

總之，本文首先分析了初中英語(yǔ)閱讀教學(xué)中存在的問(wèn)題，然后從注重提高英語(yǔ)閱讀材料的新穎性，組織學(xué)生靈活學(xué)習(xí)英語(yǔ)閱讀以及科學(xué)合理地安排英語(yǔ)閱讀時(shí)間幾個(gè)方面，提出了初中英語(yǔ)閱讀教學(xué)的提升策略，希望本文的研究能夠有助于初中英語(yǔ)閱讀教學(xué)水平的提升。當(dāng)然，由于本人的研究水平有限，本文的論述難免存在一定的不足，還希望相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜覍W(xué)者給與本人批評(píng)與指正。

去除單細(xì)胞懸液中的PBS，加入4%甲醛1 mL固定15 min，然后棄去固定液，PBS洗滌3次，每次3 min，加入0．5 mL Hoechst 33258染色液，染色2 min，棄去染色液，加入1 mL PBS后于熒光顯微鏡下觀察。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，參比波長(zhǎng)460 nm。

1．5 小花棘豆中毒對(duì)家兔生精細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

使用PBS沖洗單細(xì)胞懸液1～2次，加入質(zhì)量濃度為0．125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS漂洗3次后收集細(xì)胞于離心管中。4℃、2000 r/min離心10 min后棄去上清，加入1 mL 75%乙醇4℃固定過(guò)夜。然后4℃、2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，PBS漂洗3次后再于4℃、2000 r/min條件下離心10 min，將細(xì)胞重懸于200 μl PBS液中，加入5 μl RnaseA，37℃反應(yīng)1 h，再加入10 μl Triton-X-100和5 μl PI，4℃下避光孵育30 min，1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1．6 小花棘豆中毒家兔生精細(xì)胞凋亡率的測(cè)定

使用PBS沖洗單細(xì)胞懸液1～2次，加入質(zhì)量濃度為0．125%的胰蛋白酶消化2 min，含血清培養(yǎng)液終止消化后棄去上清，PBS漂洗3次后收集細(xì)胞于離心管中。4℃、2000 r/min離心10 min后棄去上清，加入1 mL PBS重懸細(xì)胞，使用250目尼龍濾網(wǎng)過(guò)濾，然后4℃、2000 r/min條件下離心10 min后棄去上清，將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，4℃下避光孵育30 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1．7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 16．0軟件中One-Way ANOVA方法進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 小花棘豆中毒家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照家兔睪丸生精細(xì)胞排列整齊，清晰明顯，各時(shí)期生殖細(xì)胞如精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞和精子均清晰可辨;TUNEL染色顯示僅有極少數(shù)的生精細(xì)胞的凋亡(圖1-A)。試驗(yàn)Ⅰ組家兔睪丸組織出現(xiàn)曲精細(xì)管排列不規(guī)則，生精細(xì)胞輕度異型，部分細(xì)胞核濃染，精子減少;凋亡細(xì)胞多表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)空泡(圖1-B)，其數(shù)量明顯升高。試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組家兔睪丸組織均出現(xiàn)曲精細(xì)管排列極度紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞明顯減少，異型細(xì)胞和凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞膜下陷，細(xì)胞器濃縮，細(xì)胞核碎裂等，并形成凋亡小體，部分凋亡小體被鄰近細(xì)胞吞噬(圖1-C、D)。

2．2 小花棘豆中毒家兔睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照家兔睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形及卵圓形，且染色質(zhì)均勻分布(圖2-A)。小花棘豆中毒家兔生精細(xì)胞細(xì)胞核縮小，呈新月形或染色質(zhì)濃縮。試驗(yàn)Ⅰ組家兔出現(xiàn)核固縮為均質(zhì)團(tuán)塊(圖2-B)，試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組家兔生精細(xì)胞胞體也明顯縮小，細(xì)胞核多碎裂，并伴有凋亡小體出現(xiàn)(圖2-C，2-D)。

圖1 對(duì)照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細(xì)胞凋亡TUNEL染色Fig．1Spermatogenic cells apoptosis in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by TUNEL

圖2 對(duì)照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化Fig．2The change of spermatogenic cells nucleus in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)

2．3 小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

由圖3可知，小花棘豆中毒家兔睪丸生精細(xì)胞與對(duì)照家兔相比，G0/G1期細(xì)胞數(shù)量逐漸升高，S期細(xì)胞數(shù)量逐漸降低，而且G1期與S期細(xì)胞數(shù)量呈顯著的負(fù)相關(guān)。其中高劑量小花棘豆中毒組家兔的變化最為明顯。

圖3 對(duì)照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測(cè)Fig．3The cell cycle of spermatogenic cells nucleus in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by FCM

2．4 小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡率的影

家兔睪丸生精細(xì)胞主要分為單倍體細(xì)胞、二倍體細(xì)胞和四倍體細(xì)胞。與對(duì)照組相比，第14天時(shí)試驗(yàn)組家兔單倍體細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照家兔(P﹤0．05)，但僅試驗(yàn)Ⅲ組家兔生精細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照家兔(P﹤0．05)。第35 d時(shí)試驗(yàn)組單倍體細(xì)胞凋亡率和生精細(xì)胞凋亡率均極顯著高于對(duì)照家兔(P﹤0．01)，但二倍體細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照家兔(P﹤0．05)。第70 d時(shí)試驗(yàn)組單倍體細(xì)胞凋亡率、二倍體細(xì)胞凋亡率和生精細(xì)胞凋亡率均極顯著高于對(duì)照家兔(P﹤0．01)，但整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)四倍體細(xì)胞凋亡率與對(duì)照差異不顯著(P﹥0．05)。

表1 小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡率的影響(%)Table 1The effect of apoptosis index of O．glabra DC poisoning on spermatogenic cells

圖4 對(duì)照家兔(A)與小花棘豆中毒家兔(B、C、D)生精細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)Fig．4The apoptosis index of spermatogenic cells in control rabbit testis(A)and poisoning rabbit testis(B，C，D)by FCM

3 討論

細(xì)胞凋亡在細(xì)胞發(fā)育及疾病發(fā)生過(guò)程中均起著重要的作用。凋亡過(guò)程中，細(xì)胞不僅發(fā)生了生化變化，而且還具有凋亡的特征性形態(tài)和亞微結(jié)構(gòu)。有核細(xì)胞凋亡的重要特征是DNA斷裂，TUNEL法能特異性的標(biāo)記斷裂DNA，可有效檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡，是目前應(yīng)用較廣、可靠較高的標(biāo)記凋亡細(xì)胞的方法。正常情況下，睪丸的精原細(xì)胞在促性腺激素和雄性激素作用下，依次經(jīng)過(guò)精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞，最后轉(zhuǎn)變成為高度分化的精子。張先平等［8］研究發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂前的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞有較高的自發(fā)凋亡現(xiàn)象，但精子細(xì)胞很少發(fā)生凋亡，這是保證隨后的精子正常生長(zhǎng)所必需的。其意義在于維持成熟精子的質(zhì)量和數(shù)量，清除染色體異常的生精細(xì)胞，保持生精細(xì)胞與支持細(xì)胞數(shù)量上的平衡。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，小花棘豆中毒主要影響動(dòng)物的繁殖和神經(jīng)系統(tǒng)，其中雄性中毒動(dòng)物表現(xiàn)為性欲低下，無(wú)配種能力;雌性動(dòng)物可造成流產(chǎn)、死胎、弱胎、畸形等。丁伯良等［9］研究發(fā)現(xiàn)甘肅棘豆(主要毒性物質(zhì)SW)中毒山羊睪丸的精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞空泡化，次級(jí)精母細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量減少，附睪、精囊、輸精管數(shù)量明顯降低。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒家兔睪丸組織曲精細(xì)管排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，并可見(jiàn)凋亡小體形成及凋亡小體被吞噬細(xì)胞吞噬的現(xiàn)象。TUNEL染色發(fā)現(xiàn)小花棘豆中毒可顯導(dǎo)致家兔生精細(xì)胞凋亡率極顯著升高(P＜0．01)，Hoechst 33258染色發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞細(xì)胞核的染色質(zhì)濃縮，核碎裂，并出現(xiàn)凋亡小體。其結(jié)果與丁伯良等的研究一致，表明小花棘豆毒性成分可誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡。

睪丸細(xì)胞主要包括單倍體細(xì)胞(精子細(xì)胞和精子)、二倍體細(xì)胞(G0期精原細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞)以及四倍體細(xì)胞(粗線期、細(xì)線期、雙線期的初級(jí)精母細(xì)胞和G2期的精原細(xì)胞等)，另外還有一些較為分散的細(xì)胞由進(jìn)行DNA合成的精原細(xì)胞和細(xì)線前期精母細(xì)胞組成。其中四倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞的比率反映了精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為初級(jí)精母細(xì)胞的效率，單倍體細(xì)胞與四倍體細(xì)胞的比率顯示了減數(shù)分裂的效果，單倍體細(xì)胞與二倍體細(xì)胞的比率反映了精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為精子細(xì)胞的效率。Jyothi等［10］研究表明睪丸生精細(xì)胞凋亡時(shí)精原細(xì)胞的凋亡比較嚴(yán)重，即多數(shù)生殖毒性物質(zhì)的靶細(xì)胞是精原細(xì)胞。本試驗(yàn)通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)了家兔睪丸內(nèi)各種生精細(xì)胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，小花棘豆中毒家兔睪丸單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞凋亡率均極顯著升高，但四倍體細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯變化;說(shuō)明小花棘豆中毒可顯著影響家兔減數(shù)分裂及精原細(xì)胞轉(zhuǎn)化為初級(jí)精母細(xì)胞的效率，即小花棘豆毒性成分主要影響精原細(xì)胞和次級(jí)精母細(xì)胞。

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸生精細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，中毒家兔睪丸生精細(xì)胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量降低。表明小花棘豆毒性成分可能抑制了S期DNA的合成與修復(fù)過(guò)程，從而使S期細(xì)胞數(shù)量降低，并抑制了S期細(xì)胞進(jìn)入G2/M期，另外還對(duì)細(xì)胞進(jìn)入G1期有一定的促進(jìn)作用。凋亡率檢測(cè)發(fā)現(xiàn)處于分裂增殖階段的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞對(duì)小花棘豆的毒性作用較為敏感。其原因可能為精原細(xì)胞和精母細(xì)胞分別處于有絲分裂和減數(shù)分裂期，在S期需打開(kāi)DNA雙鏈以合成新的DNA，而裸露的DNA對(duì)小花棘豆毒性成分的作用較為敏感，容易產(chǎn)生DNA損傷［11］。當(dāng)DNA損傷超過(guò)自身的修復(fù)能力時(shí)，將導(dǎo)致同源染色體配對(duì)、交換和分離的紊亂，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡。但龐龍［4］研究發(fā)現(xiàn)SW主要抑制大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的G0/G1期數(shù)量，與本研究結(jié)果不太一致。表明小花棘豆中毒導(dǎo)致家兔睪丸生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

通過(guò)TUNEL染色、Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，小花棘豆中毒可導(dǎo)致家兔睪丸生精細(xì)胞、單倍體細(xì)胞和二倍體細(xì)胞凋亡率極顯著升高，且與小花棘豆毒性成分呈現(xiàn)一定的時(shí)間－劑量效應(yīng)。凋亡細(xì)胞出現(xiàn)胞核縮小、碎裂，染色質(zhì)濃縮等，高劑量中毒組出現(xiàn)凋亡小體。與對(duì)照組相比，中毒家兔睪丸生精細(xì)胞G0/G1期數(shù)量增多，S期細(xì)胞數(shù)量降低，表明小花棘豆中毒可能抑制了S期DNA的合成與修復(fù)過(guò)程。

［1］王帥，賈琦珍，陳根元，等．不同生長(zhǎng)時(shí)期小花棘豆?fàn)I養(yǎng)成分與苦馬豆素含量比較［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52(8):1505－1509．

［2］賈琦珍，陳根元，廖秋萍，等．小花棘豆中毒對(duì)家兔臟器指標(biāo)的影響［J］．湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53(12):2584－2586．

［3］王帥，吳書(shū)奇，胡建軍，等．南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的分離與鑒定［J］．草業(yè)科學(xué)，2011，28(6):1194－1197．

［4］王帥，陳根元，賈琦珍，等．小花棘豆中毒對(duì)家兔睪丸α-甘露糖苷酶的影響［J］．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35(4):640－644．

［5］龐龍．苦馬豆素體外誘導(dǎo)SD大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡研究［D］．陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2012．

［6］張樑．苦馬豆素誘導(dǎo)新生SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡機(jī)制研究［D］．陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué)，2013．

［7］王帥，陳根元，胡建軍，等．氣相色譜內(nèi)標(biāo)法測(cè)定南疆地區(qū)小花棘豆中苦馬豆素的含量［J］．新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，48(4):723－728．

［8］張先平，才秀蓮，王乾興，等．錳對(duì)大鼠生精細(xì)胞凋亡與增殖的影響［J］．毒理學(xué)雜志，2007，21(3):176－179．

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(責(zé)任編輯 李潔)

Effect of Oxytropis glabra DC Poisoning on Spermatogenic Cells Apoptosis in Rabbit

WANG Shuai1，2，JIA Qi-zhen2，CHEN Gen-yuan2，WANG Lian-qun1，2，ZHANG Ling1，2*
(1．College of Animal Science，Tarim University，Xinjiang Alar 843300，China;2．Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology，Xinjiang Production＆Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China)

The aim of this study was to investigate the effects of Oxytropis glabra DC poisoning on spermatogenic cells apoptosis in rabbit testis，and reveal the toxicity mechanism of O．glabra DC in future．24 male rabbits were randomly and equally divided into blank control group and experimental groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ，the dried plant of O．glabra DC was comminnuted，then different amounts of the grass powder(15%，30 %and 45%the corresponding swainsonine content was 30，60，90 mg/kg)were mixed with the forage in 3 experimental groups．The rabbits consumed the forages freely until typical symptoms were observed，the test period was 70 days．2 rabbits were selected randomly from each group on the 14th，35thand 70thday，respectively，the testis were collected and apoptosis of cardiomyocyte were measured by insitu end-labeled DNA(TUNEL)，nuclear staining techniques by Hoechst 33258，flow cytometry determination of apoptosis rate and cell cycle．The results indicated that the apoptosis index of spermatogenic cell increased in experimental groups were very significantly higher than control group(P﹤0．01)，with increasing concentration of swainsonine，the spermatogenic cell membrane caveolated，cell organelles narrow and cell nucleus broken，and in severe apoptotic bodies．The apoptosis index of haploid cells and diploid cells in test rabbit testis were very significantly higher than control group(P﹤0．01)from 35 d，but the contents of four times the somatic cells in test rabbit testis had no significant difference with control group．The G0/G1of the cell increased and S phase cells gradually decreased，there were significantly negative correlation with G1phase cells and S phase cells．The results showed that O．glabra DC has remarkable effects on spermatogenic cells apoptosis in rabbit testis，in a time-effect as a dose-effect relationship．

Oxytropis glabra DC;Swainsonine;Spermatogenic cell;Apoptosis;Cell cycle

S816．1

A

1001－4829(2017)1－0209－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．036

2016－02－25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460678);國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2015GA891015);兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(HS201409)

王帥(1984－)，男，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，山西長(zhǎng)治人，主要從事動(dòng)物中毒病及毒理學(xué)方面的研究，E-mail:wangshuaidky@126．com;*為通訊作者:張玲(1966－)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，本科，河北河間人，主要從事牧草生產(chǎn)與牧草加工方面的研究，E-mail:1044763025@qq．com。