［KH－*D］杜金梁，曹麗萍，賈睿，徐跑，*，殷國(guó)俊，*

(1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081;2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部魚類免疫藥理學(xué)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081;3．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081)

澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)建鯉脂肪肝細(xì)胞損傷中生化指標(biāo)及CYP1A蛋白表達(dá)的影響

［KH－*3D］杜金梁1，2，曹麗萍1，2，賈睿3，徐跑1，2，3*，殷國(guó)俊1，2，3*

(1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081;2．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)部魚類免疫藥理學(xué)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214081;3．南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫214081)

為了研究中藥澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)建鯉脂肪肝變性細(xì)胞的保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)以0．4 mmol·L－1油酸來構(gòu)建建鯉原代脂肪肝細(xì)胞損傷模型，然后用不同濃度的澤瀉提取物處理肝細(xì)胞24和48 h后，分別收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)液，然后測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、堿性磷酸酶(AKP)、膽堿酯酶(CHE)、細(xì)胞色素酶P4501A1(CYP1A1)和細(xì)胞色素酶P4502E1(CYP2E1)的含量等生化指標(biāo)以及CYP1A的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示，0．4 mmol· L－1的油酸與原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)48 h可以顯著提高肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中GPT、GOT、TG、TC、AKP、CHE、LDH、CYP1A1和CYP2E1的含量(P＜0．01或者P＜0．05)，可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞中CYP1A的蛋白表達(dá)。將不同濃度的澤瀉提取物(0、1、5、10、20、50 μg·mL－1)與脂肪肝細(xì)胞共培養(yǎng)24～48 h發(fā)現(xiàn)，澤瀉提取物能不同程度抑制油酸誘導(dǎo)的GOT、GPT、TG、TC、LDH、AKP、CHE水平和CYP1A1、CYP2E1含量的升高(P＜0．01或者P＜0．05)，不同程度降低肝細(xì)胞中CYP1A蛋白表達(dá)，以作用時(shí)間48 h效果較好。研究證實(shí)了澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)的魚類脂肪肝細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，而澤瀉提取物作為魚類脂肪肝的防治藥物還需要進(jìn)一步的在體研究。

建鯉;肝細(xì)胞;油酸;澤瀉提取物

隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，脂肪肝類疾病在魚類養(yǎng)殖中普遍發(fā)生，有報(bào)道稱此病不僅僅在淡水魚類中發(fā)生，也存在于海水養(yǎng)殖魚類中，給養(yǎng)殖戶造成了很大困擾［1］。發(fā)生脂肪肝疾病魚類，其肌肉當(dāng)中脂肪含量也會(huì)升高，影響了魚類肉質(zhì)品質(zhì)，如果此病發(fā)生在夏季，還會(huì)造成魚類的死亡，給養(yǎng)殖戶造成不小的經(jīng)濟(jì)損失，影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［2］。國(guó)內(nèi)外關(guān)于魚類脂肪肝疾病有了一定數(shù)量的研究報(bào)道，在治療和預(yù)防脂肪肝方面也取得了一定成效［3－5］，但是，到目前為止還沒有發(fā)現(xiàn)有效的治療藥物，因此，探尋治療魚類脂肪肝疾病的有效藥物成為研究者面臨的主要挑戰(zhàn)。

由于離體培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞具有培養(yǎng)條件易控制且可以精確模擬在體肝臟生理活動(dòng)等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物代謝、脂質(zhì)代謝、肝癌研究等方面［6－7］。關(guān)于原代肝細(xì)胞在魚類上面應(yīng)用［8－9］，還主要是用于藥理學(xué)方面，也就是通過用化學(xué)藥物建立肝細(xì)胞損傷模型來進(jìn)行后續(xù)篩選保肝藥物研究。如曹麗萍等利用四氯化碳構(gòu)建原代肝細(xì)胞損傷來篩選保肝中藥［10］，盧榮華等用脂肪乳劑來構(gòu)建草魚脂肪肝脂變模型［11］，而關(guān)于利用原代培養(yǎng)的魚類肝細(xì)胞來構(gòu)建脂肪肝變性模型，尤其是鯉魚方面還未見相關(guān)報(bào)道。在本實(shí)驗(yàn)中，選用原代培養(yǎng)的建鯉肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料有助于研究肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝過程及保肝藥物的篩選。

近年來，通過臨床試驗(yàn)以及藥理學(xué)研究，已經(jīng)篩選了一大批具有保肝作用的中藥［12］，澤瀉提取物就是其中一種。有報(bào)道稱澤瀉提取物具有很好的降血脂作用和保護(hù)肝臟的功效［13－14］。在哺乳動(dòng)物中，澤瀉提取物對(duì)于化學(xué)藥物引起的肝損傷具有一定的治療效果，如朱深銀報(bào)道澤瀉提取物對(duì)二甘醇致小鼠肝臟損傷具有明顯的保護(hù)作用［15］。王振海等報(bào)道澤瀉對(duì)DL-乙硫氨酸引起的大鼠急性肝損傷也具有明顯的保護(hù)作用［16］。但對(duì)于澤瀉提取物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物脂肪肝疾病方面的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用油酸誘導(dǎo)建鯉原代肝細(xì)胞脂肪變性，通過western blotting方法檢測(cè)CYP4501A蛋白表達(dá)和一些生化指標(biāo)的變化來探討澤瀉提取物對(duì)建鯉脂肪肝細(xì)胞變性的保護(hù)作用，為水產(chǎn)保肝藥物的篩選提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)供試魚建鯉(Cyprinus carpio var．Jian)來自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng)，體質(zhì)健康無病，取回后飼養(yǎng)于循環(huán)水系統(tǒng)中一周，水溫設(shè)定為27℃，每天投喂2次商品飼料。

1．1．2 藥品和試劑L-15培養(yǎng)基、二甲基亞砜(DMSO，細(xì)胞級(jí))、0．4%臺(tái)盼藍(lán)染液、鏈霉素/青霉素(Streptomycin/penicillin)、0．25%胰蛋白酶及PBS緩沖液購(gòu)自于Sigma公司(美國(guó));新生胎牛血清(FCS)購(gòu)自于杭州四季青生物工程材料有限公司公司(中國(guó)杭州);谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamatepyruvate transaminase，GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamate oxalate transaminase，GOT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)等試劑盒購(gòu)自于南京建成生物工程研究所科技有限公司(中國(guó)南京);CYP2E1、CYP1A1試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物研究所(中國(guó)上海);細(xì)胞裂解液及免疫印跡(Western blotting)所需試劑購(gòu)自于碧云天生物技術(shù)研究所(中國(guó)南通);澤瀉提取物購(gòu)自南通四海植物提取有限公司(中國(guó)南通)。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 建鯉原代肝細(xì)胞的分離和培養(yǎng)無菌條件下于超凈臺(tái)內(nèi)取建鯉肝臟，用含雙抗的PBS緩沖液進(jìn)行漂洗，修剪，加入濃度為0．125%的胰蛋白酶消化液，27℃水浴條件下消化10～15 min。過濾，濾液用PBS緩沖液洗3次，采用梯度離心法進(jìn)行離心5 min，離心轉(zhuǎn)數(shù)分別為1100、900和800 r·min－1。離心結(jié)束后棄上清，用含有10%新生小牛血清(FCS)的L-15培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞存活率檢測(cè)，計(jì)數(shù)結(jié)束后將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，27℃條件下培養(yǎng)。

1．2．2 澤瀉提取物處理脂肪變性肝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組分別設(shè)定空白對(duì)照組、模型組、澤瀉提取物對(duì)照組以及澤瀉提取物處理組。用L-15培養(yǎng)基將澤瀉提取物稀釋為0、1、5、10、20、50 μg·mL－1等濃度，具體分組情況如下。

(1)空白對(duì)照組:不添加任何藥物處理肝細(xì)胞，直接用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)24和48 h后，分別收集24和48 h 2個(gè)時(shí)間段細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

(2)油酸造模組:用含濃度為0．4 mmol·L－1油酸的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

(3)澤瀉提取物對(duì)照組:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的肝細(xì)胞換用含質(zhì)量濃度50 μg·mL－1澤瀉提取物的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)24和48 h，然后分別收集2個(gè)時(shí)間段細(xì)胞及培養(yǎng)上清液。

(4)澤瀉提取物處理組:先將貼壁生長(zhǎng)良好的肝細(xì)胞與0．4 mmol/L油酸共培養(yǎng)48 h造成脂肪肝變性細(xì)胞后，再加入含濃度分別為0、1、5、10、20、50 μg·mL－1澤瀉提取物的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)24和48 h，培養(yǎng)結(jié)束后分別收集2個(gè)時(shí)間段細(xì)胞及上清培養(yǎng)液。

以上每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)6個(gè)重復(fù)孔。收集各組上清液及細(xì)胞用于后續(xù)生化指標(biāo)檢測(cè)及蛋白表達(dá)研究。

1．2．3 肝細(xì)胞上清培養(yǎng)液中生化指標(biāo)測(cè)定GOT、GPT、TG、TC等試劑盒的測(cè)定參照南京建成科技有限公司說明書進(jìn)行操作。

1．2．4 Elisa法測(cè)定肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CYP2E1、CYP1A1含量水平采用雙抗體夾心法測(cè)定魚肝臟中CYP2E1、CYP1A1水平。分別設(shè)定空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。所加樣品要加于酶標(biāo)孔板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)均勻。經(jīng)過孵育、洗滌、加酶標(biāo)試劑、顯色、終止等步驟后，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中CYP2E1、CYP1A1含量。

1．2．5 Western blotting方法檢測(cè)澤瀉提取物對(duì)脂肪變性肝細(xì)胞CYP1A蛋白表達(dá)的影響將培養(yǎng)結(jié)束后的肝細(xì)胞先用PBS清洗后，加入細(xì)胞裂解液，震蕩混勻，凍融(－20℃)，12 000 r·min－1離心10 min，吸取上清液，用于后續(xù)免疫印跡實(shí)驗(yàn)研究。將待測(cè)樣本取出后，用雙蒸水稀釋到相同濃度，然后加入5×蛋白上樣緩沖液，于95℃變性儀上變性5 min，冷卻后備用。

12%SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)印好的NC膜放入封閉液中4℃過夜，加入一抗CYP1A孵育2 h，洗滌液洗滌3次，每次10 min，然后加入含有堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗繼續(xù)孵育2 h，結(jié)束后洗滌液洗滌3次，每次10 min，NBT/BCIP顯色。

1．2．6 數(shù)據(jù)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS16．0軟件包進(jìn)行處理。采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，以P＜0．05為差異顯著，P＜0．01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT、GPT、LDH、AKP活性的影響

如圖1所示，油酸與原代肝細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，GOT、GPT、LDH和AKP幾個(gè)經(jīng)典酶學(xué)指標(biāo)活性值與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(P＜0．01)。經(jīng)過藥物澤瀉提取物處理后，幾個(gè)藥物濃度組均可以不同程度降低GOT、GPT、LDH和AKP酶的活性值，效果以處理48 h為最佳。澤瀉提取物對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞中TG和TC含量的影響

由圖2所示，油酸作用于肝細(xì)胞48 h，肝細(xì)胞中TG、TC含量明顯升高，與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(P＜0．01)。經(jīng)澤瀉提取物作用24和48 h后，TG、TC含量得到不同程度抑制，治療效果以48 h為佳。其中，澤瀉提取物濃度在5 μg·mL－1時(shí)降低TC含量，澤瀉提取物濃度在20 μg·mL－1時(shí)降低肝細(xì)胞中TC含量較好。澤瀉提取物對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，無差異顯著性。

2．3 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CHE活性的影響

由圖3所示，油酸處理后的肝細(xì)胞內(nèi)CHE活性與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(P＜0．01)。加入澤瀉提取物與肝細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，各處理組澤瀉提取物均可不同程度降低其活性值，但以作用48 h效果較好。澤瀉提取物與空白對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．4 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CYP1A1含量的影響

由圖4所示，油酸與肝細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞內(nèi)CYP1A1含量顯著升高，與空白對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0．05)。加入澤瀉提取物處理肝細(xì)胞后，各濃度處理組在24 h可以降低肝細(xì)胞內(nèi)CYP1A1含量，但與空白對(duì)照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。澤瀉提取物處理48 h，濃度為10、20、50 μg· mL－1時(shí)，可以顯著降低CYP1A1含量，但與空白對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0．05)。澤瀉提取物對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無明顯變化。

圖1 澤瀉提取物對(duì)油酸致建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中GOT(A)、GPT(B)、LDH(C)和AKP(D)活性的影響Fig．1Effects of RAE on the activities of GOT(A)，GPT(B)，LDH(C)and AKP(D)in primary hepatocytes culture medium of Jian Carp

圖2 澤瀉提取物對(duì)油酸致建鯉肝細(xì)胞中TG和TC含量的影響Fig．2Effects of RAE on the contents of TG(A)and TC(B)in primary hepatocytes culture medium of Jian carp

2．5 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CYP2E1含量的影響

由圖5所示，經(jīng)過油酸處理后，建鯉肝細(xì)胞內(nèi)CYP2E1含量明顯升高，與空白對(duì)照組相比，差異極顯著(P＜0．01)。加入澤瀉提取物與肝細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，各濃度處理組均可不同程度降低CYP2E1含量，以作用時(shí)間48 h效果最好。澤瀉提取物對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無明顯變化。

2．6 澤瀉提取物對(duì)建鯉肝細(xì)胞CYP1A蛋白表達(dá)的影響

由圖6所示，加入不同濃度的澤瀉提取物處理脂肪肝變性細(xì)胞24 h，CYP1A蛋白表達(dá)隨著藥物濃度的增加減弱，在濃度為10 μg·mL－1時(shí)，明顯降低。澤瀉提取物作用48 h，濃度為在1、5、10 μg· mL－1時(shí)，CYP1A表達(dá)明顯降低。

3 討論與結(jié)論

3．1 利用魚類肝細(xì)胞進(jìn)行抗脂肪肝藥物篩選研究

魚類脂肪肝的發(fā)生原因比較復(fù)雜，飼料中營(yíng)養(yǎng)失衡、抗生素藥物的濫用等均可導(dǎo)致本病的發(fā)生［17－18］。魚類脂肪主要蓄積在皮下、肝臟等部位，當(dāng)肝臟不能夠及時(shí)將多余脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)出去，就會(huì)造成肝臟的代謝功能出現(xiàn)紊亂，引起魚類脂肪肝疾病的發(fā)生。發(fā)生脂肪肝疾病的魚肉品質(zhì)以及在高溫季節(jié)魚類的抗應(yīng)激能力都會(huì)出現(xiàn)下降，嚴(yán)重影響到了魚類養(yǎng)殖戶的效益以及養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展［19］，因此，魚類脂肪肝的防治研究引起了廣泛關(guān)注。利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞來模擬魚類脂肪肝損傷，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如細(xì)胞的培養(yǎng)條件可控、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低、能有效避免外界因素對(duì)實(shí)驗(yàn)所造成的影響，而且可以比較準(zhǔn)確模擬在體魚生理狀態(tài)。在國(guó)內(nèi)外關(guān)于藥物篩選以及動(dòng)物發(fā)病機(jī)制方面研究，細(xì)胞培養(yǎng)得到了廣泛應(yīng)用［20－23］。本實(shí)驗(yàn)旨在利用油酸作為脂肪肝細(xì)胞變性誘導(dǎo)劑，探究澤瀉提取物對(duì)原代脂肪肝細(xì)胞變性的保護(hù)作用。

圖3 澤瀉提取物對(duì)油酸致建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CHE活性的影響Fig．3Effects of RAE on the activity of CHE in primary hepatocytes culture medium of Jian carp

圖4 澤瀉提取物對(duì)油酸致建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CYP1A1含量的影響Fig．4Effects of RAE on the amounts of CYP1A1 in primary hepatocytes culture medium of Jian Carp

圖5 澤瀉提取物對(duì)油酸致建鯉肝細(xì)胞培養(yǎng)液中CYP2E1含量的影響Fig．5Effects of RAE on the amounts of CYP2E1 in primary hepatocytes culture medium of Jian Carp

3．2 澤瀉提取物對(duì)原代肝細(xì)胞GPT、GOT、LDH、AKP活性的影響

GOT、GPT、LDH、AKP是肝臟疾病檢查過程中常用指標(biāo)，正常情況下，其活性值很低，當(dāng)肝臟呈現(xiàn)病理狀態(tài)時(shí)，肝細(xì)胞膜的通透性就會(huì)增加，這幾個(gè)酶指標(biāo)就會(huì)從肝細(xì)胞分泌出來［24－25］。由于肝細(xì)胞膜受損，細(xì)胞膜的正常功能受到影響，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)失衡，尤其是細(xì)胞內(nèi)鈣離子失衡，鈣離子在肝細(xì)胞過多聚集，導(dǎo)致了肝細(xì)胞的脂肪變性，甚至壞死的發(fā)生。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)油酸作用后，肝細(xì)胞上清培養(yǎng)液中GOT、GPT、LDH、AKP4種酶活性值顯著升高，說明油酸成功誘導(dǎo)了脂肪肝細(xì)胞變性。加入澤瀉提取物后，四種酶活性值升高趨勢(shì)得到抑制。類似結(jié)果在大鼠中也有相關(guān)報(bào)道，王振海等［16］在研究澤瀉對(duì)DL-乙硫氨酸引起大鼠肝臟損傷的保護(hù)作用中發(fā)現(xiàn)，澤瀉可以降低肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶的升高。這說明澤瀉提取物可以提高肝微粒體膜的活性，修復(fù)受損傷的肝細(xì)胞膜，恢復(fù)細(xì)胞膜的正常功能。

3．3 澤瀉提取物對(duì)原代肝細(xì)胞TG、TC含量的影響

肝臟是脂質(zhì)代謝的重要場(chǎng)所，能夠合成和儲(chǔ)存各種脂類，滿足機(jī)體需要。在哺乳動(dòng)物脂肪肝研究方面，有研究證明，動(dòng)物脂肪肝疾病發(fā)生，主要是由于體內(nèi)脂質(zhì)代謝失衡導(dǎo)致大量甘油三酯在肝臟內(nèi)聚集而發(fā)?。?6］。將肝細(xì)胞中TG、TC含量測(cè)定作為油酸誘導(dǎo)脂肪肝細(xì)胞變性以及藥物治療脂肪肝療效判定的指標(biāo)，可直接反映脂類物質(zhì)在肝臟內(nèi)代謝、沉積的情況，通過觀察這兩個(gè)指標(biāo)可以客觀、合理地反映出澤瀉提取物對(duì)油酸誘導(dǎo)的脂肪肝細(xì)胞變性真實(shí)的保護(hù)作用效果。在本實(shí)驗(yàn)中，油酸與肝細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝細(xì)胞TG、TC含量與空白對(duì)照組相比差異極顯著(P＜0．01)。加入澤瀉提取物后，澤瀉提取物可以不同程度降低肝細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量，這說明澤瀉提取物在降低血脂和治療脂肪肝變性方面具有較好的效果。其具體保護(hù)作用機(jī)制可能與其含有的膽堿以及卵磷脂等成分有關(guān)系［27］。

3．4 澤瀉提取物對(duì)原代肝細(xì)胞CHE含量的影響

膽堿酯酶(cholinesterase)是一類由肝臟合成而分泌入血的糖蛋白，主要分為乙酰膽堿酯酶和羥基膽堿酯酶。在臨床中，測(cè)定血清中膽堿酯酶活性是診斷和評(píng)估肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞損害的重要手段，發(fā)生脂肪肝疾病會(huì)使乙酰膽堿在肝臟內(nèi)過多聚集，導(dǎo)致膽堿酯酶水解乙酰膽堿出現(xiàn)障礙［28］。有報(bào)道稱，脂肪肝患者CHE平均水平較正常對(duì)照組比較顯著升高，是脂肪肝患者又一突出的生化指標(biāo)［29］。在本實(shí)驗(yàn)中，油酸處理后的肝細(xì)胞膽堿酯酶水平較空白對(duì)照組相比極顯著升高，與前人報(bào)道結(jié)果相同。加入中藥澤瀉提取物后48 h，肝細(xì)胞內(nèi)膽堿酯酶水平出現(xiàn)了顯著下降。這說明澤瀉提取物恢復(fù)了膽堿酯酶活性，抑制了乙酰膽堿在肝細(xì)胞內(nèi)的聚集。

圖6 澤瀉提取物對(duì)肝細(xì)胞中CYP1A蛋白表達(dá)的影響Fig．6CYP1A expression in primary hepatocytes of Jian Carp induced by RAE

3．5 澤瀉提取物對(duì)原代肝細(xì)胞CYP1A1和CYP2E1含量及CYP1A1蛋白表達(dá)的影響

細(xì)胞色素酶P450是存在于肝臟內(nèi)重要的藥物代謝酶，主要參與了內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)在肝臟內(nèi)的代謝，在新藥研發(fā)方面發(fā)揮著重要作用，而CYP1A1和CYP2E1其中2個(gè)主要的亞型［30－31］。有國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道稱，在非酒精性脂肪肝發(fā)病過程中CYP1A1經(jīng)游離脂肪酸誘導(dǎo)活性會(huì)有升高趨勢(shì)［32］;有文獻(xiàn)報(bào)道稱，發(fā)生肝臟損傷和脂肪肝疾病時(shí)，CYP2E1的表達(dá)與活性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化［33］，這說明CYP1A1和CYP2E1參與了脂肪肝疾病的形成。有研究表明脂肪肝的形成主要是由于機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化過程的影響，CYP450酶系統(tǒng)參與了此過程，抑制抗氧化酶系發(fā)揮保護(hù)作用［34］。在本實(shí)驗(yàn)中，油酸處理過后的CYP1A1和CYP2E1含量顯著升高，CYP1A1蛋白表達(dá)也相應(yīng)增強(qiáng)，這說明油酸誘導(dǎo)脂肪肝損傷后，導(dǎo)致了細(xì)胞色素酶P450含量的增加。加入澤瀉提取物后，CYP1A1和CYP2E1含量以及CYP1A1蛋白表達(dá)，均不同程度出現(xiàn)了降低現(xiàn)象，這說明藥物抑制了機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物以及脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，保護(hù)肝臟受到外界物質(zhì)的損害。

當(dāng)前，魚類脂肪肝疾病是我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)多發(fā)病之一，是我國(guó)水產(chǎn)科技工作者面臨的一項(xiàng)重要課題。本研究利用油酸成功復(fù)制了脂肪肝細(xì)胞損傷模型，并以此模型開展了抗脂肪肝藥物篩選工作，經(jīng)澤瀉提取物處理后，肝臟中轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)、甘油三酯、總膽固醇以及細(xì)胞色素酶P450含量及蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度升高或降低，以48 h處理效果最佳，分析其保護(hù)機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)肝微粒體膜活性，修復(fù)油酸對(duì)肝細(xì)胞膜造成的損害，調(diào)節(jié)藥物代謝酶P450水平，使肝細(xì)胞恢復(fù)對(duì)脂肪的代謝功能等有關(guān)，關(guān)于中藥澤瀉提取物的具體保護(hù)機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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(責(zé)任編輯 李潔)

Effects of Rhizoma Alismatis Extract on Biochemical Index and CYP1A Protein Expression of Hepatocyte Steatosis Injury Induced by Oleic Acid in Jian Carp(Cyprinus carpio var．Jian)

DU Jin-liang1，2，CAO Li-ping1，2，JIA Rui3，XU Pao1，2，3*，YIN Guo-jun1，2，3*
(1．Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization，Ministry of Agriculture，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Jiangsu Wuxi 214081，China;2．International Joint Research Laboratory for Fish Immunopharmacology，F(xiàn)reshwater Fisheries Research Center，Chinese Academy of Fishery Sciences，Jiangsu Wuxi 214081，China;3．Wuxi Fisheries College，Nanjing Agricultural University，Jiangsu Wuxi 214081，China)

Fish fatty liver is one of increasingly serious diseases in aquaculture，it has become more and more serious in China aquaculture，In recent years，the incidence of fatty liver in fish had an increasing trend，but the occurrence mechanism of the fatty liver was still not very clear．Cytochrome P450 enzymes were the main oxidases metabolic enzymes in the liver microsome and played a very important role in the liver metabolism．However，no effective methods have been found for the prevention and treatment of this disease．The present study aimed to develop an in vitro model of hepatocyte steatosis using oleic acid as hepatotoxicant and evaluate the protective effects of Rhizoma Alismatis extracts against oleic acid induced hepatocyte steatosis in Jian carp．The primary cultured hepatocytes in Jian Carp were isolated and purified by trypsin digestion，cultured in vitro．The activities of glutamatepyruvate transaminase(GPT)，aspertate aminotransferase(GOT)，triglycerides(TG)，total cholesterol(TC)，alkaline phosphatase(AKP)，cholinesterase(CHE)，lactate dehydrogenase(LDH)were detected．The content of enzyme cytochrome P4501A1(CYP1A1)and enzyme cytochrome P4502E1 were detected by double antibody sandwich ELISA method．CYP1A expression in the hepatocytes was analyzed by Western blot method．The results showed，the hepatocytes of Jian Carp grew well and had a good morphology，and they could be used for investigation of lipid metabolism．Exposure of the hepatocytes to 0．4 mmol/L oleic acid for 48 h，significantly elevated the levels of glutamatepyruvate transaminase(GPT)，aspertate aminotransferase(GOT)，triglycerides (TG)，total cholesterol(TC)，alkaline phosphatase(AKP)，cholinesterase(CHE)，lactate dehydrogenase(LDH)，the enzyme cytochrome P4501A1(CYP1A1)and the enzyme cytochrome P4502E1 (P＜0．01 or P＜0．05)．After the primary hepatocytes treatment with five concentrations of Rhizoma Alismatis extract(0，1，5，10，20，50 μg/mL)for 24－48 hours，results showed that Rhizoma Alismatis extract could suppress the elevations of GOT，GPT，TG，TC，LDH，AKP，CHE，CYP1A1，CYP2E1(P＜0．01 or P＜0．05)，and reduced the protein expression of CYP1A to varying degrees，the most optimal action time is 48 h．It can be concluded that Rhizoma Alismatis extract exhibited protective effect against hepatocyte steatosis in Jian carp．Further in vivo studies are needed to provide more evidence for using Rhizoma Alismatis extract as a hepatoprotective agent for the treatment of hepatocyte steatosis．

Jian carp;Hepatocyte;Oleic acid;Rhizoma Alismatis extract

S965．116

A

1001－4829(2017)1－0226－07

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．039

2016－02－25

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(2015JBFM01)

杜金梁(1982－)，男，河北滄州市人，助理研究員，主要從事臨床藥理與藥物代謝研究工作，E-mail:dujl@ffrc．cn，Tel:0510-85558876，*為通訊作者:殷國(guó)俊，E-mail:yingj@ffrc．cn;徐跑，E-mail:xup@ffrc．cn。