羅清+梁春+唐瑩瑩+秦玉燕+盧業(yè)飛+覃坤蘭

摘 要：文章對近年來杜鵑分子標(biāo)記的研究工作進(jìn)行了梳理和總結(jié)，綜述了ISSR、AFLP、RAPD、SSR及SRAP等分子標(biāo)記在杜鵑的應(yīng)用，并展望應(yīng)用前景和提出了建設(shè)性意見，為日后開展杜鵑品種鑒定及遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、構(gòu)建統(tǒng)一的分類系統(tǒng)及分子標(biāo)記研究等提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：杜鵑 分子標(biāo)記 進(jìn)展

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑屬（Rhododendron L.）常綠或落葉多年生植物，全世界約有960余種。我國杜鵑花自然分布廣泛，占世界種類的59 %，因其種類繁多、花色艷麗、株型多樣聞名于世。我國豐富的杜鵑花資源傳布到世界各國并經(jīng)植物學(xué)家及園藝學(xué)家繁殖培育，獲得了大量的雜交組合及新品種，至今栽培出的園藝品種近萬種。由于杜鵑花品種繁多、產(chǎn)區(qū)廣泛、新品種審定不及時(shí)、地區(qū)使用習(xí)慣稱呼不同等，出現(xiàn)了許多同名異種及同種異名的現(xiàn)象，此外我國廣闊土地的深山野林中還有許多未被保存的杜鵑種質(zhì)資源。因此，對杜鵑種質(zhì)資源進(jìn)行有效分類與鑒定是今后深入開展杜鵑育種研究的基礎(chǔ)。

近年來隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于杜鵑研究。分子標(biāo)記是揭示堿基序列變異的遺傳標(biāo)記，與細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記相比，不受環(huán)境、發(fā)育階段等影響，且檢測手段迅速簡單、多態(tài)性高、穩(wěn)定準(zhǔn)確，是形態(tài)學(xué)分類的重要補(bǔ)充。文章綜述了近年來分子標(biāo)記技術(shù)在杜鵑研究中的應(yīng)用，以期為日后杜鵑花系統(tǒng)分類、合理開發(fā)利用杜鵑種質(zhì)資源提供參考。

1 分子標(biāo)記的發(fā)展動(dòng)態(tài)

分子標(biāo)記是植物DNA水平上遺傳多樣性的體現(xiàn)，新型分子標(biāo)記技術(shù)的大量涌現(xiàn)大大縮短了植物常規(guī)育種的周期，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)檢測、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及轉(zhuǎn)基因研究等方面[1-2]。目前分子標(biāo)記種類繁多，根據(jù)不同的核心技術(shù)可分為3類： 第一類以Southern雜交為核心，如RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）；第二類以PCR反應(yīng)為核心，包括多位點(diǎn)標(biāo)記方法RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、DAF（DNA Amplification Fingerprinting）、SSCP（Single Strand Conformational Polymorphism）、SSR（Simple Sequence Repeats）、小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）等，位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)記方法ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）、AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）、STS（Sequence Tagged Site）等及PCR與酶切相結(jié)合的方法AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）等；第三類以單核苷酸多態(tài)性或mRNA為核心，主要以SNP（Single Nucleotide Polymorphic）技術(shù)和EST（Expressed Sequence Tag）技術(shù)等為代表[3-7]。

分子標(biāo)記技術(shù)能夠更深層次的解釋生命現(xiàn)象本質(zhì)，使我們認(rèn)知范圍從宏觀表型到微觀世界[8]。分子標(biāo)記直接反映DNA水平上的遺傳多樣性，能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段[9]。因此，在形態(tài)分類學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行物種鑒定與分類對物種的種質(zhì)資源研究及品質(zhì)創(chuàng)新具有重要的意義。

2 主要分子標(biāo)記的研究

2.1 杜鵑ISSR分子標(biāo)記的應(yīng)用

ISSR （簡單重復(fù)序列間多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)由Zietkiewicz等[10]提出，在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的分子標(biāo)記，屬于位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記具有實(shí)驗(yàn)成本低廉、實(shí)驗(yàn)操作簡單、引物適用廣泛等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。

目前國內(nèi)學(xué)者在杜鵑屬植物種群間的遺傳多樣性和種間親緣關(guān)系分析研究中運(yùn)用最多的分子標(biāo)記是ISSR標(biāo)記。劉旭穎等[13]將ISSR用于9種杜鵑花的親緣關(guān)系分析，擴(kuò)增出522條帶，其中有90.63 %是多態(tài)性的。遺傳距離從0. 1833到0. 7236，表明種間具有較豐富的遺傳多樣性。鄭宇等[14]研究了11個(gè)杜鵑栽培品種的遺傳多樣性，Shannon多樣性指數(shù)為0.4742，表明遺傳多樣性水平較高。彭嬋等[15]、趙芯等[16]及羅清等[17]學(xué)者都利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分別對不同的野生杜鵑屬植物種群進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，結(jié)果都表明種群遺傳多樣性處于較高水平，種群間的基因交流頻率很高，能較好的適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境?？讋俒18]對福建旗山2個(gè)馬銀花（R. ovatum （Lindl.） Planch. ex Maxim. ）種群研究，2個(gè)種群的基因流 Nm=0.2627<1，表明種群基因交流較少，可能由于種群所處的生境與外界聯(lián)系甚少，被周圍環(huán)境的高山與溪流所阻隔。鐘容等[19]對篩選出13條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，研究表明4種杜鵑花遺傳背景既有相同之處又有一定差異。陳春福[20]以九仙山上的鹿角杜鵑（R. latoucheae Franch.）與滿山紅（R.mariesii Hemsl.et Wils.） 6大類為實(shí)驗(yàn)材料， ISSR分子標(biāo)記分析表明，在不同海拔處的株系呈現(xiàn)出較大的遺傳差異，可能與植株所處的環(huán)境條件、氣候等因素有關(guān)。趙冰等[21]對秦嶺地區(qū)美容杜鵑（R. calophytum Franch.）的5個(gè)野生種群通過ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性，表明不同種群間的美容杜鵑遺傳多樣性水平差異大，遺傳分化的程度與地理距離無相關(guān)性。而趙凱等[22]學(xué)者研究群居的都支杜鵑（R. shanii Fang）遺傳多樣性較低，但是遺傳距離卻與地理距離顯著相關(guān)，可能是都支杜鵑高度一致性的生境及異交的生活特性所導(dǎo)致。王剛[23]對黃山杜鵑（R. maculiferum Franch.）5個(gè)種群利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行研究，種群間遺傳水平不高，需對幼苗進(jìn)行混合繁殖，加大居群間遷移和交流使居群間的遺傳基因重組，以此提高黃山杜鵑種群的遺傳多樣性水平。

2.2 杜鵑AFLP分子標(biāo)記的應(yīng)用

AFLP（擴(kuò)增片段長度多態(tài)性）由荷蘭科學(xué)家Pieter Vos等[24]提出，是3端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記，屬于PCR與酶切相結(jié)合的方法[25]。AFLP分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高及樣品適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，在構(gòu)建遺傳圖譜、遺傳育種、基因表達(dá)與調(diào)控、物種分類和進(jìn)化等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

AFLP標(biāo)記一次單個(gè)反應(yīng)可檢測到大量限制性片段， AFLP是最有效的分子標(biāo)記，由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)量龐大，因此運(yùn)用在杜鵑屬植物上較少，僅有幾個(gè)學(xué)者采用AFLP標(biāo)記對杜鵑遺傳多樣性進(jìn)行分析?？v丹等[26]采用AFLP標(biāo)記對馬纓杜鵑（R. delavayi Franch.）5個(gè)居群進(jìn)行檢測與分析，居群內(nèi)83.12 %發(fā)生遺傳變異，基因流為2.4624，居群遺傳多樣性較高。趙冰等[27]研究秀雅杜鵑（R. concinnum Hemsl.）種群的遺傳分化程度及遺傳多樣性，結(jié)果表明秀雅杜鵑無論在種群水平還是物種水平上遺傳多樣性都比較高，遺傳變異主要在種群內(nèi)部，且遺傳距離與地理距離相關(guān)性不顯著。吳富勤[28]對2個(gè)居群的大樹杜鵑（R. protistum Balf. f. et Forrest var. giganteum （Tagg） Chamb. ex Cullen et Chamb.）利用AFLP分子標(biāo)記來研究遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性，研究顯示2個(gè)居群間的遺傳分化程度低，基因流較高，遺傳多樣性在物種水平上較高。其研究結(jié)果印證了“狹域分布的小種群亦能維持較高的遺傳多樣性”的假說。

2.3 杜鵑RAPD分子標(biāo)記的應(yīng)用

RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記）是由Williams等[29]提出，是基于PCR技術(shù)對未知序列的基因組檢測DNA多態(tài)性的方法。RAPD分子標(biāo)記具有操作簡單易行、易于程序化、所需DNA樣品量少、退火溫度低、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)與分子生藥學(xué)等領(lǐng)域。

張春影等[30]對不同海拔牛皮杜鵑（R. aureum Georgi）種群利用RAPD標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析：產(chǎn)地不同的種群遺傳多樣性高，可能與氣候因子、環(huán)境因子及地理因子等因素綜合影響有關(guān)；產(chǎn)地相同的遺傳多樣性水平低，可能是由于分生境狹小產(chǎn)生地理間隔的生殖屏障，阻斷基因交流。姬文秀等[31]利用RAPD標(biāo)記鑒定出6份大字杜鵑（R. schlippebachii Maxim.）的親緣關(guān)系。劉雁飛[32]對長白山居群牛皮杜鵑進(jìn)行研究，借助RAPD分子標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)受地理環(huán)境的影響，遺傳多樣性水平高，說明牛皮杜鵑適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)。

2.4 杜鵑SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用

SSR（簡單序列重復(fù)）由Moore[33]提出，是重復(fù)單位（含有1～6個(gè)核苷酸）組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，為單引物PCR標(biāo)記。SSR長度的高度變異性是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR分子標(biāo)記具有等位基因變異多、多態(tài)性高、信息量豐富、重復(fù)性好、結(jié)果可靠及呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，因而該技術(shù)被用于目標(biāo)基因的標(biāo)定、分子輔助選擇育種、遺傳機(jī)制、品種測定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等的研究中。

雖然目前最接近理想的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記，但引物開發(fā)要建立在已知的DNA序列上，由于杜鵑植物DNA序列信息相對缺乏的情況下，使得杜鵑SSR標(biāo)記引物的開發(fā)相對較少，因此國內(nèi)學(xué)者在杜鵑屬植物上對SSR標(biāo)記的應(yīng)用不多[34-36]。周泓[37]運(yùn)用Dendauw等開發(fā)的SSR引物對130個(gè)杜鵑花進(jìn)行SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，所用引物呈現(xiàn)的多態(tài)性都比較高，聚類結(jié)果與傳統(tǒng)分類系統(tǒng)基本吻合。吳富勤[28]運(yùn)用SSR標(biāo)記對居群大樹杜鵑進(jìn)行保護(hù)遺傳學(xué)研究，結(jié)果表明大樹杜鵑歷史基因流高，經(jīng)過多年演變現(xiàn)已不能維持足夠的等位基因豐富度，近代基因流低，瀕臨極危的狀態(tài)，建議加強(qiáng)基因交流，就地保護(hù)與遷地保護(hù)相結(jié)合，擴(kuò)大有效居群地。

2.5 杜鵑SRAP分子標(biāo)記的應(yīng)用

目前在杜鵑屬上應(yīng)用的還有SRAP分子標(biāo)記。該分子標(biāo)記由于2001年美國加州大學(xué)Li和Quiros[38]博士提出的，是基于PCR的一種新型的標(biāo)記系統(tǒng)。SRAP分子標(biāo)記具有高共顯性、重復(fù)性好、方便測序和簡單高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于重要性狀基因標(biāo)記、比較基因組學(xué)、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等研究領(lǐng)域。

蘇家樂等[39]運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記鑒別了10份杜鵑屬植物，遺傳分化明顯，遺傳多樣性高，分類結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)基本一致。吳月燕等[40]以24個(gè)西洋杜鵑為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化建立了適合西洋杜鵑的SRAP-PCR反應(yīng)體系，并利用該體系對供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示SRAP分子標(biāo)記可以很好用于該實(shí)驗(yàn)材料的鑒定。

3 總結(jié)與展望

分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于杜鵑遺傳育種中，在遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究與種質(zhì)資源鑒定等方面開展了一系列工作并獲得了一些成果。多態(tài)性信息的統(tǒng)計(jì)分析可以從分子水平提供杜鵑遺傳變異的證據(jù)，為全面掌握現(xiàn)有杜鵑資源的遺傳多樣性提供參考。從基因組DNA水平上的差異研究杜鵑親緣關(guān)系，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，為選育雜交優(yōu)勢強(qiáng)、性狀優(yōu)良的杜鵑品種提供理論支撐。杜鵑品種繁多、市場混亂，分子標(biāo)記技術(shù)以品種間變異的可識別性與穩(wěn)定性成為傳統(tǒng)植物鑒別方法的有效補(bǔ)充。

杜鵑分子水平研究仍處于起步階段，遺傳圖譜構(gòu)建與輔助選擇育種等研究未見報(bào)道。遺傳圖譜是遺傳育種及分子克隆的理論基礎(chǔ)，高密度遺傳圖譜的構(gòu)建可有效開展質(zhì)量、數(shù)量性狀定位、分子標(biāo)記輔助育種及比較基因組學(xué)等研究。分子標(biāo)記輔助育種可對目標(biāo)性狀進(jìn)行早期選擇，從而縮短育種周期。

在與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，開展杜鵑分子水平研究，開發(fā)更為高效的分子標(biāo)記技術(shù)，各種分子標(biāo)記技術(shù)相互滲透，使用構(gòu)建杜鵑遺傳連鎖圖譜，利用與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種成為今后杜鵑分子標(biāo)記育種的研究重點(diǎn)，可為杜鵑名品鑒賞、雜交親本選擇、傳統(tǒng)分類學(xué)等提供豐富的分子水平依據(jù)。

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