王時(shí)雨, 張俊娜, 冀 楠, 張婧芳, 何 煒

(第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

·快遞論文·

新型5-氟尿嘧啶-吲哚菁染料偶合物的合成

王時(shí)雨, 張俊娜, 冀 楠, 張婧芳, 何 煒*

(第四軍醫(yī)大學(xué) 藥學(xué)院 化學(xué)教研室，陜西 西安 710032)

以抗癌藥5-氟尿嘧啶和近紅外熒光探針I(yè)R780和IR783為原料，經(jīng)取代、乙酸化和酰胺化反應(yīng)合成了兩種新型的雙效抗腫瘤藥物5-FU-780和5-FU-783，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS表征。

5-氟尿嘧啶; 近紅外熒光探針; IR780; IR783; 5-氟尿嘧啶-吲哚菁染料偶合物; 合成; 抗腫瘤藥物

腫瘤的治療在當(dāng)今仍然是世界性的難題，準(zhǔn)確的診斷和針對性的治療是公認(rèn)的治療惡性腫瘤最為有效的途徑。近年來，隨著分子影像學(xué)的飛速發(fā)展，分子影像學(xué)技術(shù)在區(qū)分良惡性組織、尋找微小腫瘤病灶、界定腫瘤范圍和功能成像等方面發(fā)揮了重要作用[1-2]。如果能將分子影像學(xué)中腫瘤的準(zhǔn)確診斷和腫瘤的靶向治療有機(jī)結(jié)合起來，同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的成像診斷、治療和療效評價(jià)[3]，這將有利于提升惡性腫瘤的診治水平，為腫瘤的診治提供新的思路。

近紅外熒光探針發(fā)射波長為700～1 100 nm，具有較小的輻射能，這個(gè)波長的光子在機(jī)體生物組織內(nèi)的吸收和散射很少，生物分子自身熒光較弱，可避免背景干擾而獲得較高的分析靈敏度，因而受到研究人員的重視[4]。其中吲哚菁近紅外熒光探針I(yè)R780和IR783(Scheme 1)光穩(wěn)定性和生物安全性較好，而且具有腫瘤組織靶向性，能夠很好地實(shí)現(xiàn)肺癌及腎癌等腫瘤細(xì)胞的成像[5-7]，是美國食品與藥品監(jiān)督管理局(FDA)已批準(zhǔn)的可用于臨床的重要近紅外熒光染料[8]。

5-氟尿嘧啶(5-FU)作為抗癌治療的首選藥物，已廣泛應(yīng)用于各種實(shí)體腫瘤的治療，尤其是在消化道腫瘤的臨床治療方面占據(jù)重要地位[9-11]。如果能將其和近紅外熒光探針做成前體藥物，利用探針的靶向能力攜帶抗腫瘤藥物到達(dá)腫瘤部位，在達(dá)到腫瘤精確定位的同時(shí)提高靶部位藥物的分布，同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷和治療兩種功能。

Scheme 1

本文以近紅外熒光探針I(yè)R為基礎(chǔ)，將5-FU和近紅外熒光探針I(yè)R780或IR783進(jìn)行化學(xué)鍵合，以期獲得同時(shí)具有腫瘤近紅外成像和靶向治療的新化合物，為后續(xù)生物學(xué)活性研究奠定基礎(chǔ)。分別以IR780和IR783與哌嗪經(jīng)取代反應(yīng)制得IR780-哌嗪(1)和IR783-哌嗪(2)； 5-FU與氯乙酸反應(yīng)制得5-氟尿嘧啶-1-乙酸(3)； 3分別與1和2經(jīng)酰胺化反應(yīng)合成了兩種新型的雙效抗腫瘤藥物5-FU-780(4)和5-FU-783(5)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR， IR和HR-MS表征。并對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XRC-1型顯微熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；MERCURY-PLUS 400型核磁共振儀(CDC13為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；IR-750型紅外光譜儀(KBr壓片)；Waters Quatropremier型質(zhì)譜儀。

IR780和IR783， Sigma-Aldrich公司；哌嗪，5-氟尿嘧啶,氯化亞砜，氯乙酸，1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，百靈威化學(xué)試劑公司；其余所用試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 合成

(1) 1的合成[12]

避光保護(hù)下將IR780 333 mg(0.5 mmol)溶于新蒸DMF 10 mL中，抽真空氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下加入哌嗪172 mg(2 mmol)的DMF(5 mL)溶液，于80 ℃反應(yīng)4 h。冷卻至室溫，減壓蒸除DMF，殘余物經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑：A=V(DCM) ∶V(MeOH)=60 ∶1]純化得藍(lán)色固體1 269 mg，產(chǎn)率75%;1H NMR(400 MHz)δ: 7.66(d,J=13.2 Hz, 2H), 7.32～7.26(m, 4H), 7.09(t,J=8.0 Hz, 2H), 6.97(d,J=6.4 Hz, 2H), 5.80(d,J=13.2 Hz, 2H), 3.88(m, 8H), 3.26(t,J=6.0 Hz, 4H), 2.44(t,J=6.0 Hz, 4H), 1.84(m, 6H), 1.68(s, 12H), 1.02(t,J=6.0 Hz, 6H)。

(2) 2的合成[13]

避光條件下將IR783 363 mg(0.5 mmol)溶于新蒸DMF 10 mL中，抽真空氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌下加入哌嗪172 mg(2 mmol)的DMF(5 mL)溶液，于80 ℃反應(yīng)1.5 h。冷卻至室溫，減壓蒸除DMF，殘余物用DCM溶解，過濾除去不溶物，濾液蒸干后經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=60 ∶1)純化得藍(lán)色固體2 178 mg，產(chǎn)率46%;1H NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.73(d,J=13.2 Hz, 2H), 7.43(t,J=8.0 Hz, 2H), 7.36(d,J=7.3 Hz, 2H), 7.26(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.20(t,J=7.3 Hz, 2H), 6.07(d,J=13.2 Hz, 2H), 4.16～4.11(m, 4H), 3.90～3.84(m, 4H), 2.91～2.78(m, 6H), 2.58～2.52(m, 4H), 2.10～1.48(m, 12 H), 1.68(s, 12H)。

(3) 3的合成[14]

在反應(yīng)瓶中依次加入5-FU 1.30 g(10 mmol)和KOH(20 mmol)的水(10 mL)溶液，攪拌使其溶解；緩慢滴加氯乙酸(10 mmol)的水(10 mL)溶液，滴畢，于60 ℃反應(yīng)5 h(TLC監(jiān)測)。冷卻至室溫，用濃鹽酸調(diào)至pH 2，冷卻靜置12 h，過濾，沉淀用水(3×20 mL)洗滌，用水重結(jié)晶，烘干得針狀白色晶體3 1.63 g，產(chǎn)率87%；1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 11.53(s, 1H), 10.75(d,J=5.2 Hz, 1H), 7.76(t,J=6.0 Hz, 1H), 4.10(s, 2H)； IRν: 3 198, 1 669, 1 424 cm-1。

(4) 4的合成

將3 120 mg(0.64 mmol)溶于新蒸二氯甲烷(10 mL)中，冷卻至0 ℃，加入EDC·HCl(0.96 mmol)，攪拌3 min，加入1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)(0.96 mmol)，反應(yīng)25 min；依次加入1 458 mg(0.64 mmol)的DCM(10 mL)溶液和Et3N 0.2 mmol，反應(yīng)8 h。減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=80 ∶1)純化得藍(lán)綠色固體4 423.9 mg，產(chǎn)率76%；1H NMR (400 MHz)δ: 11.12(s, 1H), 8.49(s, 2H), 8.18(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.33(d,J=7.6 Hz, 2H), 7.23(d,J=6.4 Hz, 2H), 6.68(s, 2H), 5.87(s, 2H), 5.80(d,J=13.6 Hz, 2H), 3.97(s, 1H), 3.87(t,J=8.4 Hz, 2H), 3.65(m, 2H), 3.48(s, 1H), 3.40(t,J=6.6 Hz, 2H), 2.82(s, 1H), 2.44(t,J=6.4 Hz, 1H), 2.02(t,J=5.8 Hz, 6H), 1.84(m, 2H), 1.66(s, 4H), 1.38(t,J=7.2 Hz, 1H), 1.32(d,J=6.8 Hz, 1H), 1.22(m, 2H), 1.10(t,J=7.0 Hz, 12H), 1.04(d,J=7.2 Hz, 2H), 0.90(dd,J=16.0 Hz, 6.8 Hz, 1H);13C NMR(100 MHz)δ: 171.77, 171.40, 169.62, 157.34, 149.61, 143.99, 141.89, 140.37, 138.42, 130.5, 129.58, 125.22, 123.20, 121.33, 111.29, 79.59, 56.07, 48.63, 47.76, 46.15, 45.97, 29.18, 26.07, 22.83, 21.46, 11.67; HR-MSm/z: Calcd for C46H56N6O3FI{[M-I]-}759.973 9, found 759.972 3。

(5) 5的合成

將3 231 mg(1.23 mmol)溶于新蒸DCM(10 mL)中，攪拌下于0 ℃加入EDC·HCl(1.85 mmol)，攪拌3 min；加入HOAt(1.85 mmol)，反應(yīng)25 min；加入2 953 mg(1.23 mmol)的DCM(20 mL)溶液，加入Et3N(0.37 mmol)，反應(yīng)8 h。減壓蒸除溶劑，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑：A=8 ∶1)純化得藍(lán)綠色固體5 687 mg，產(chǎn)率60%；1H NMR(400 MHz)δ: 11.09(s, 1H), 8.47(s, 2H), 8.16(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.32(m, 2H), 7.20(m, 3H), 6.99(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.78(s, 1H), 5.66(s, 4H), 3.96(s, 2H), 3.70(m, 4H), 3.41(d,J=6.4 Hz, 1H), 2.35(s, 1H), 2.00(s, 8H), 1.88(m, 10H), 1.66～1.43(m, 12H), 1.06(d,J=7.2 Hz, 4H);13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ: 169.71, 169.31, 157.34, 157.03, 149.61, 142.61, 140.70, 140.44, 139.12, 131.15, 128.41, 124.60, 123.74, 122.13, 110.55, 97.61, 54.26, 50.43, 49.03, 48.14, 45.72, 43.41, 28.23, 25.90, 24.89, 22.63, 21.33; HR-MSm/z: Calcd for C48H58N6O9S2F-{[M-I]}946.137 6, found 946.135 9。

2 結(jié)果與討論

5-FU-780和5-FU-783的合成中所用原料價(jià)廉易得，所用反應(yīng)均為經(jīng)典的有機(jī)合成反應(yīng)，但由于菁染料極性較大，在反應(yīng)的選擇性和后處理方面均存在一定的困難。我們對其中關(guān)鍵步驟進(jìn)行了條件探索，簡化了反應(yīng)操作過程，有效提高了反應(yīng)產(chǎn)率。

2.1 1和2的合成

在1和2的合成中，熒光探針I(yè)R780和IR783中的氯為活性部位，當(dāng)和哌嗪反應(yīng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)哌嗪的用量和反應(yīng)溫度是影響該反應(yīng)的關(guān)鍵。針對這兩個(gè)關(guān)鍵條件進(jìn)行較為深入的考察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 哌嗪用量和反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的影響

由表1可見，當(dāng)哌嗪用量過大時(shí)，副產(chǎn)物比例非常大，難以進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，哌嗪用量少時(shí)反應(yīng)難以發(fā)生，這可能是由于菁染料分子中氯的位阻較大，少量的仲胺難以進(jìn)行親核反應(yīng)。經(jīng)條件篩選最終確定哌嗪用量為4 eq.，可以順利制得目標(biāo)產(chǎn)物。

在上述基礎(chǔ)上進(jìn)一步考察反應(yīng)溫度對反應(yīng)的影響，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在DMF中回流反應(yīng)時(shí)，副產(chǎn)物特別多，降溫至120 ℃，副產(chǎn)物有所減少，于100 ℃反應(yīng)時(shí)TLC顯示仍有3個(gè)產(chǎn)物點(diǎn)生成。而在室溫進(jìn)行反應(yīng)，混合物中副反應(yīng)最少，但收率特別低，延長反應(yīng)時(shí)間也未能提高產(chǎn)率。當(dāng)反應(yīng)在80 ℃進(jìn)行時(shí)，IR780和哌嗪以75%的分離產(chǎn)率制得目標(biāo)產(chǎn)物，而IR783的極性較大，和哌嗪的反應(yīng)副產(chǎn)物更多，純化過程需要多次柱層析才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物，分離產(chǎn)率為46%。

2.2 4和5的合成

3分別與1和2反應(yīng)合成4和5，該步反應(yīng)為經(jīng)典的有機(jī)反應(yīng)，本文選擇常用的EDC·HCl和HOAt作為偶聯(lián)劑[15]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)只用上述兩種偶聯(lián)試劑，而沒有其他堿存在下，該偶聯(lián)反應(yīng)不能發(fā)生。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了三乙胺、吡啶及碳酸鉀等添加劑促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)以三乙胺為添加劑時(shí)，分別以76%和60%的分離產(chǎn)率成功合成目標(biāo)化合物4和5。

表2 添加劑對產(chǎn)率的影響

在吲哚菁近紅外熒光探針基礎(chǔ)上，通過取代、乙酸化和酰胺化等一系列化學(xué)反應(yīng)將抗癌藥物5-FU與近紅外熒光探針I(yè)R780和IR783偶聯(lián)，制得同時(shí)具有腫瘤近紅外成像和靶向治療的新化合物5-FU-780和5-FU-783，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，為進(jìn)一步腫瘤診斷與治療研究奠定了基礎(chǔ)。這種基于近紅外熒光探針構(gòu)建同時(shí)具有診斷和靶向治療作用的新型多功能抗腫瘤藥物具有重要的意義，為腫瘤的診療提供了新的思路。

[1] 蔣力揚(yáng),孟雪,于金明. 用分子影像指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)治療[J].中華核醫(yī)學(xué)與分子影像雜志,2016,36(1):3-6.

[2] Hu X D, Xing LG, Yu J M,etal. Nuclear medical molecular imaging of tumor angiogenesis:Current status and future prospect[J].Chin Med J,2013,126(14):2741-2746.

[3] Alberti C. From molecular imaging in preclinical/clinical oncology to theranostic applications in targeted tumor therapy[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2012,16(14):1925-1933.

[4] 劉欣,王紅,張華山. 生物分析中近紅外熒光探針進(jìn)展[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2001,17(4):346-352.

[5] Christy A, Mark M S. Sequence-dependent fluorescence of cyanine dyes on microarrays[J].PLoS One,2011,6(7):e22177.

[6] 孫亮亮.氨基菁類熒光染料用于腫瘤細(xì)胞的光學(xué)成像[D].大連:大連理工大學(xué),2015.

[7] Foersch S, Heimann A, Ayyad A,etal. Confocal laser endomicroscopy for diagnosis and histomorphologic imaging of brain tumorsinvivo[J]. PLoS One,2012,7(7):e41760.

[8] Jerre W M, Kelly M B. Removal of calcein in waste water produced from the batch marking of fish[J].N Am J Fish Manage,2008,28(4):1177-1181.

[9] Gordon W, Janette V, Malcolm A B,etal. The effects of the anti-cancer drugs,methotrexate and 5-fluorouracil on cognitive function in mice [J].Pharmacol Biochem Behav,2006,85(1):66-75.

[10] He Y S, Sun W, Wang C Z,etal. Effects of American ginseng on pharmacokinetics of 5-fluorouracil in rats[J].2015,29(5):762-767.

[11] 黃文才，張春紅，蘇玉芬，等. 5-氟尿嘧啶靶向性前藥的研究進(jìn)展[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23(4):462-465.

[12] Li C Y, Kong X F, Li Y F,etal. Ratiometric and colorimetric fluorescent chemosensor for Ag+based on tricarbocyanine[J].Dyes and Pigment,2013,99:903-907.

[13] Takuya M, Kazuki K, Kenjiro H,etal. Rational design of ratiometric near-infrared fluorescent pH probes with various pKavalues, based on aminocyanine[J].J Am Chem Soc,2011,133(10):3401-3409.

[14] 楊琴，張志榮. 5-氟尿嘧啶-D-氨基葡萄糖衍生物的設(shè)計(jì)與合成[J].華西藥學(xué)雜志,2014,29(4):359-361.

[15] Tellitu I, Serna S, Herrero M T,etal. Intramolecular PIFA-mediated alkyne amidation and carboxylation reaction[J].J Org Chem,2007,72(4):1526-1529.

Synthesis of Novel 5-Fluorouracil-coupled Indocyanine Dye Compounds

WANG Shi-yu, ZHANG Jun-na, JI Nan, ZHANG Jing-fang, HE Wei*

(Department of Chemistry, School of Pharmacy, The Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China)

Two new 5-fluorouracil-coupled indocyanine dye compounds(5-FU-780 and 5-FU-783) were synthesizedviasubstitution, acetoxylation and amidation reaction, using antitumor drug 5-fluorouracil and near-infrared fluorescent dyes IR780 and IR783 as the starting materials. The structures were characterized by1H NMR，13C NMR， IR and HR-MS.

5-fluorouracil； near-infrared fluorescent probe； IR780； IR783； 5-fluorouracil-coupled indocyanine dye; synthesis; antitumor drug

2016-11-18

陜西省科技統(tǒng)籌計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2012KTCQ03-02)

王時(shí)雨(1992-)，女，漢族，陜西漢中人，碩士研究生，主要從事抗腫瘤藥物合成研究。 Tel. 029-84774470, E-mail: wangshiyuwang@163.com

何煒，教授，博士生導(dǎo)師， Tel. 029-84774470， E-mail: weihechem@fmmu.edu.cn

R979.1； O621.3

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.04.16290