張民秀，謝芝勛，黃 莉，謝志勤，劉加波，謝麗基，鄧顯文，羅思思，黃嬌玲

( 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

?

H9N2亞型禽流感病毒M2e蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)

張民秀，謝芝勛*，黃 莉*，謝志勤，劉加波，謝麗基，鄧顯文，羅思思，黃嬌玲

( 廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001)

以含有全長H9N2亞型AIV M2基因的質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到M2e基因；利用BglⅡ和BamHⅠ之間互為同尾酶關(guān)系，構(gòu)建順次連接的多拷貝體M2e，并連接入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，構(gòu)成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌中；將測序正確的菌液經(jīng)不同濃度IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白大小，對蛋白進(jìn)行可溶性分析；利用Western blot分析5種重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果顯示，在37℃下，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組蛋白分別經(jīng)終濃度為0.25、 0.25、0.5、0.25、0.75 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h時(shí)，表達(dá)量最高；2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組蛋白大小分別為31.7、37.2、42.7、48.2、53.9 ku；對重組蛋白進(jìn)行可溶性分析顯示，5種重組蛋白均以包涵體形式存在；Western blot分析顯示，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組蛋白與鼠抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體具有良好的特異性反應(yīng)，為后期進(jìn)一步獲得高免疫原性蛋白和篩選具有通用免疫原性的重組蛋白奠定基礎(chǔ)。

H9N2亞型禽流感病毒；M2蛋白胞外區(qū)(M2e)蛋白；重組蛋白

H9N2亞型禽流感病毒(H9N2 subtype avian influenza virus,H9N2 subtype AIV)的感染引起禽類呼吸道疾病及產(chǎn)蛋量下降乃至死亡，嚴(yán)重危害禽類的健康，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。我國依靠AIV滅活疫苗免疫有效地控制了H9N2亞型AIV的廣泛傳播。但Pu J等[2]研究顯示，近年來，經(jīng)過常規(guī)免疫的雞群仍然發(fā)生H9N2亞型AIV的感染，并且感染病例明顯增多，說明目前H9N2亞型AIV疫苗不能給雞群提供完全而有效的保護(hù)力。Sun Y等[3]分析1994年—2008年14年間分離到的H9N2亞型AIV HA基因的遺傳進(jìn)化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)該基因變異速度加快，并且其氨基酸有較大程度的變異;Sun Y P等[4]評價(jià)H9N2亞型AIV商品化疫苗接種效果發(fā)現(xiàn)，H9N2亞型AIV商品化疫苗不能對SPF雞提供完全的保護(hù)；孟芳等[5]發(fā)現(xiàn)，近年來在免疫壓力下的H9N2亞型AIV其年平均進(jìn)化率加快，造成疫苗毒株與流行毒株不匹配，從而引起H9N2亞型AIV滅活疫苗的免疫失敗。基于以上數(shù)據(jù)，研究和開發(fā)一種針對不同抗原性H9N2亞型AIV并且具有交叉保護(hù)能力的廣譜H9N2亞型禽流感疫苗十分必要。因此，尋求一種能夠抵抗不同抗原性的H9N2亞型AIV的通用免疫原成為不可或缺的關(guān)鍵點(diǎn)。

AIV基因組編碼10個(gè)蛋白，基質(zhì)蛋白2(matrix protein 2,M2)是由AIV RNA節(jié)段7所編碼，是AIV表面的一種膜蛋白，而高度保守的胞外區(qū)(M2e)位于M2蛋白的N端[6-7]。Mozdaanowaka K等[8-10]研究表明，融合M2e蛋白的疫苗在免疫后能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體，該特異性抗體對不同亞型的人流感病毒具有有效的抵抗力。目前國外一些公司對M2e制備成的通用流感疫苗進(jìn)行了研究，并在臨床試驗(yàn)上取得了一些進(jìn)展，臨床試驗(yàn)均顯示基于M2e的流感通用疫苗具有良好的安全性和免疫原性[11-12]。以上研究數(shù)據(jù)顯示，M2e蛋白在流感通用疫苗的研制中可作為一種有待開發(fā)的具有應(yīng)用潛力的保護(hù)性抗原。由于M2e只有24個(gè)氨基酸，其免疫原性較弱[6]，因此，本研究將H9N2亞型AIV M2基因的胞外區(qū)(M2e)構(gòu)建成順次串聯(lián)的2個(gè)拷貝體(2M2e)、4個(gè)拷貝體(4M2e)、6個(gè)拷貝體(6M2e)、8個(gè)拷貝體(8M2e)和10個(gè)拷貝體(10M2e)M2e的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并在原核系統(tǒng)中進(jìn)行多拷貝M2e重組蛋白表達(dá)，以期獲得不同程度免疫原性的M2e重組蛋白，為下一步獲得高免疫原性、篩選具有通用免疫原性的重組蛋白，以及開發(fā)一種針對不同抗原性的H9N2亞型AIV并具有交叉保護(hù)能力的廣譜H9N2亞型禽流感疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和感受態(tài)細(xì)胞 原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；大腸埃希菌DH5α，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；BL21(DE3)，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；含有M2基因的pMD-19T載體(M2-19T)，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，基因來源毒株A/chicken/Guangxi/116c4/2012 (H9N2)。

1.1.2 主要試劑 抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；T4連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒、核酸凝膠回收試劑盒、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Blue Plus Protein Marker和IPTG，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；ExTaq酶、T Vector pMD 19 (Simple)、BglⅡ、BamHⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Western blot使用ProteinSimple公司W(wǎng)esTM蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)完成。

1.2 方法

1.2.1 引物 用于擴(kuò)增H9N2亞型AIV M2e基因的引物對為BDM2e-F和BDM2e-R及引物對CLM2e-F和CLM2e-R，引物序列見表1，引物由華大基因生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物信息和M2e氨基酸序列

注：下劃線表示酶切位點(diǎn) 。

Note：Restriction enzyme digestion sites are underlined.

1.2.2 M2e多拷貝基因的構(gòu)建 以M2-19T為模板，用引物對CLM2e-F和CLM2e-R擴(kuò)增M2e基因，并克隆到T Vector pMD 19 (Simple) 載體，經(jīng)PCR鑒定出陽性克隆菌后，送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，將該重組載體命名為M2e-19T-1。將M2e-19T-1經(jīng)BamHⅠ內(nèi)切酶酶切的大片段產(chǎn)物和M2e-19T-1經(jīng)BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后的M2e片段進(jìn)行連接，參照文獻(xiàn)[13]的方法構(gòu)建2個(gè)拷貝的重組載體，重組載體命名為2M2e-19T-1；以M2-19T為模板，利用BDM2e-F和BDM2e-R引物對擴(kuò)增M2e基因，并克隆到T Vector pMD 19 (Simple) 載體，經(jīng)PCR鑒定出陽性克隆菌后，送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，將該重組載體命名為M2e-19T-2，將M2e-19T-2經(jīng)BamHⅠ內(nèi)切酶酶切的大片段產(chǎn)物與M2e-19T-1經(jīng)BglⅡ和BamHⅠ雙酶切后的小片段產(chǎn)物M2e基因進(jìn)行連接，形成2M2e-19T-2的重組載體，陽性克隆菌送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

將測序正確的2M2e -19T-2的陽性菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提，將重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ內(nèi)切酶酶切，回收大片段，同時(shí)將2M2e -19T-1重組質(zhì)粒經(jīng)BglⅡ和BamHⅠ雙酶切，回收小片段產(chǎn)物即2個(gè)拷貝M2e基因，將以上大片段產(chǎn)物和小片段產(chǎn)物用T4連接酶于16℃連接30 min，構(gòu)建4個(gè)拷貝M2e(4M2e-19T)重組載體，陽性克隆菌送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，依此方法分別構(gòu)建6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T，陽性克隆菌均送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 多拷貝M2e表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 分別抽提pGEX-6p-1載體、2M2e -19T-2、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T克隆菌的質(zhì)粒，用EcoRⅠ和XhoⅠ分別將pGEX-6p-1、2M2e -19T-2、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T進(jìn)行雙酶切后，回收小片段產(chǎn)物，分別是2、4、6、8、10個(gè)拷貝的M2e片段，利用T4連接酶將2M2e、4M2e、6M2e、8M2e和10M2e片段分別連入pGEX-6p-1載體，轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落，送上海立菲生物技術(shù)有限公司測序，測序正確的菌液命名為2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX。

1.2.4 2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組蛋白誘導(dǎo)條件的確定 將鑒定為陽性的2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液于37℃培養(yǎng)至OD 600 nm為0.4～0.5時(shí)，分別用終濃度為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L的IPTG在37℃下誘導(dǎo)4 h，收集誘導(dǎo)后的1 mL菌液，12 000 r/min 離心1 min，棄上清，用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次后，用30 μL PBS重懸，加入10 μL 4×SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液，置于沸水中變性10 min后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳；確定IPTG濃度后，根據(jù)不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)(0、2、4、6、8 h)重組蛋白，按照同樣的方法處理蛋白，處理后進(jìn)行進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析 分別收集10 mL經(jīng)1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后的2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液，12 000 r/min離心3 min，沉淀加入1 mL PBS重懸菌體，加入溶菌酶使溶菌酶終濃度為100 μg/mL，反復(fù)凍融菌體3次并參照文獻(xiàn)[14] 的方法進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析。

1.2.6 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析 使用1.2.5中2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX獲得的包涵體懸液進(jìn)行Western blot分析。將抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體稀釋成1∶200，按照ProteinSimple公司W(wǎng)esTM蛋白表達(dá)分析系統(tǒng)的試劑盒說明書對重組蛋白進(jìn)行Western blot分析。

2 結(jié)果

2.1 M2e多拷貝基因的構(gòu)建

以M2基因?yàn)槟０?，PCR擴(kuò)增M2e片段，目的基因大小為87 bp，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與預(yù)期大小相符(圖1)。依次構(gòu)建的2M2e-19T、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T重組載體，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定的目的基因分別為169、319、469、619、769 bp左右，與預(yù)期大小一致(圖2)，并且經(jīng)測序鑒定證明序列正確。

2.2 多拷貝M2e表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定

2M2e-19T、4M2e-19T、6M2e-19T、8M2e-19T和10M2e-19T質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，連接到原核表達(dá)重組質(zhì)粒pGEX-6p-1，構(gòu)成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX。2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物與預(yù)期片段大小相符(圖3)，并經(jīng)過測序鑒定序列正確。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 500;1、2.M2e基因的擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 500;1，2.The amplification products of M2e gene

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500;1.2M2e-19T；2.4M2e-19T；3.6M2e-19T； 4.8M2e-19T；5.10M2e-19T

M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000;1.2M2e-pGEX；2.4M2e-pGEX；3.6M2e-pGEX；4.8M2e-pGEX;5.10M2e-pGEX;M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500

2.3 多拷貝M2e重組蛋白誘導(dǎo)條件的確定

空載體菌液、2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX菌液經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳顯示，空載體無特異性條帶，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組菌分別經(jīng)終濃度為0.25、 0.25、0.5、0.75 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)量最高(圖4～圖8)，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX表達(dá)產(chǎn)物分別約為31.7、37.2、42.7、48.2、53.9 ku。2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重組菌分別經(jīng)終濃度為0.25、 0.25、0.5、0.25、0.75 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)4 h時(shí)表達(dá)量著色最深，說明2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的最佳誘導(dǎo)時(shí)間為4 h。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1誘導(dǎo)4 h;2～7.依次為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h; 2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1誘導(dǎo)4 h;2～7.依次為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1誘導(dǎo)4 h;2-7.依次為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h; 2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1誘導(dǎo)4 h;2～7.依次為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1誘導(dǎo)4 h;2～7.依次為0、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0 mmol/L IPTGM.Protein molecular weight Marker；1.The induced expression of pGEX-6p-1 for 4 h;2-7.0,0.125,0.25,0.5,0.75 and 1.0 mmol/L IPTG

2.4 重組蛋白的可溶性分析

2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過超聲波破碎后上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重組蛋白主要位于沉淀中，以包涵體形式存在。

2.5 Western blot分析

將2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重組蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX的重組蛋白與鼠抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體產(chǎn)生一些非特異性的雜帶，但并不影響對結(jié)果的判定，5種重組蛋白與鼠抗GST標(biāo)簽的單克隆抗體仍然具有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)，含空載體對照的特異性條帶大小約為26.4 ku(圖9)。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pGEX-6p-1；2.2M2e-pGEX；3.4M2e-pGEX；4.6M2e-pGEX；5.8M2e-pGEX；6.10M2e-pGEX

3 討論

1966年在美國威斯康星州首次分離到H9N2亞型AIV后，H9N2亞型AIV在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[15]。我國于1994年在雞體內(nèi)首次分離到H9N2亞型AIV，隨后H9N2亞型AIV在我國養(yǎng)禽業(yè)中廣泛傳播和流行[16-17]。目前，H9N2亞型AIV成為我國養(yǎng)禽業(yè)主要的流行毒株。根據(jù)H9N2亞型AIV HA基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化規(guī)律，H9N2亞型AIV分為北美譜系和歐亞譜系。歐亞譜系分支中包括S2-like、Y280-like、G1-like和BJ94-like等，北美譜系則包括Wisconsin-like等[18]。孟芳等[5]對1994年—2014年度國內(nèi)雞源H9N2亞型AIV的HA基因的遺傳變異進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，自2005年后S2-like分支的H9N2亞型AIV成為我國H9N2優(yōu)勢流行毒株，并且顯示病毒在疫苗免疫壓力下呈現(xiàn)變異速度加快的趨勢，這可能是造成免疫失敗的主要原因。由于H9N2亞型AIV具有不同的分支，并且由于其HA基因變異快的特性，即使使用疫苗免疫后，仍然會出現(xiàn)H9N2亞型AIV的流行，這給H9N2亞型禽流感的防控帶來了困難。

有研究表明，M2e蛋白在各個(gè)亞型的流感病毒中高度保守，M2e蛋白與流感滅活疫苗聯(lián)合使用或與適當(dāng)?shù)妮d體連接表達(dá)后，免疫后的動物具有抵抗不同亞型人流感病毒或高致病性H5N1亞型禽流感病毒的攻擊[19]，因此M2e蛋白可作為通用流感疫苗的成分加以應(yīng)用。目前國內(nèi)篩選針對不同抗原性的H9N2亞型AIV廣譜的禽流感疫苗的研究較少，并且針對融合M2e蛋白疫苗在雞體上的免疫保護(hù)研究也較少，本研究后期會在此基礎(chǔ)上通過獲得的多拷貝M2e蛋白，研究比較不同拷貝數(shù)M2e融合蛋白在SPF雞或其他動物模型的免疫原性，并通過比較不同抗原性H9N2亞型AIV攻毒后的免疫保護(hù)差異來評價(jià)多拷貝M2e蛋白的免疫效果。由于M2e只有24個(gè)氨基酸，其免疫原性較弱[6]，本研究將來源于H9N2亞型AIV的M2e基因順次串聯(lián)成多拷貝體，旨在提高M(jìn)2e蛋白的免疫原性。本研究成功構(gòu)建了含有多拷貝(2M2e、4M2e、6M2e、8M2e和10M2e)的原核表達(dá)重組質(zhì)粒，并成功在大腸埃希菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，Western blot結(jié)果表明，多拷貝M2e重組蛋白的正確表達(dá)，為后期進(jìn)一步獲得高免疫原性蛋白和篩選具有通用免疫原奠定基礎(chǔ)。

[1] 甘孟侯.禽流感 [M].2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2004:222-225.

[2] Pu J,Wang S G,Yin Y B ,et al.Evolution of the H9N2 influenza genotype that facilitated the genesis of the novel H7N9 virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2015,112(2):548-553.

[3] Sun Y,Pu J,Jiang Z,et al.Genotypic evolution and antigenic drift of H9N2 influenza viruses in China from 1994 to 2008[J].Vet Microbiol,2010,146(3-4):215-225.

[4] Sun Y P,Pu J,Fan L H,et al.Evaluation of the protective efficacy of a commercial vaccine against different antigenic groups of H9N2 influenza viruses in chickens[J].Vet Microbiol,2012,156:193-199.

[5] 孟 芳,徐懷英,張 偉,等.近20年中國部分地區(qū)雞源H9N2亞型禽流感病毒HA基因遺傳演化及其變異頻率[J].微生物學(xué)報(bào),2015,56(1):35-43.

[6] Fiers W,De F M,Birkett A.A "universal" human influenza A vaccine[J].Virus Res,2004,103:173-176.

[7] 譚 偉,謝芝勛.甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(2):81-84.

[8] Wu F,Huang J H,Yuan X Y,et al.Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus[J].Vaccine,2007,25(52):8868-8873.

[9] Fan J,Liang X,Horton M S,et al.Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines in mice, ferrets, and rhesus monkeys[J].Vaccine,2004,22 (23/24):2993-3003.

[10] Mozdaanowaka K,Feng J Q,Eid M,et al.Induction of influenza type A virus 2 specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2[J].Vaccine,2003,21(19/20):2616-2626.

[11] Gilbert S C.Advances in the development of universal influenza vaccines[J].Influenza Other Respir Virus,2013,7(5):750-758.

[12] Turley C B,Rupp R E,Johnson C,et al.Safety and immunogenicity of a recombinant M2e-flagellin influenza vaccine (STF2.4xM2e) in healthy adults[J].Vaccine,2011,29:5145-5152.

[13] 石 佳,鄭世軍,崔 勝,等.禽流感病毒M2胞外區(qū)(M2e)多拷貝的原核表達(dá)及其免疫原性分析[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(7):760-766.

[14] 羅思思,謝芝勛,鄧顯文,等.彭宜.I群禽腺病毒五鄰體基因的克隆及原核表達(dá)[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(7):154-157.

[15] Homme P J,Easterday B C.Avian influenza virus infections.I.Characteristics of influenza A-turkey-Wisconsin-1966 virus[J].Avian Dis,1970,14: 66-74.

[16] Xu K M,Smith G J,Bahl J,et al.The genesis and evolution of H9N2 influenza viruses in poultry from southern China, 2000 to 2005[J].J Virol,2007,81:10389-10401.

[17] 葉賀佳,梁昭平,彭 特,等.2012-2015年H9N2亞型AIV分離株HA基因的克隆與序列分析[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(5):1148-1155.

[18] Guo Y J,Krauss S,Senne D A,et al.Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia[J].Virology,2000,267(2):279-288.

[19] Song J M,Van Rooijen N,Bozja J,et al.Vaccination inducing broad and improved cross protection against multiple subtypes of influenza A virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(2):757-761.

Prokaryotic Expression of M2e Protein of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus

ZHANG Min-xiu,XIE Zhi-xun,HUANG Li,XIE Zhi-qin,LIU Jia-bo,XIE Li-ji,DENG Xian-wen,LUO Si-si,HUANG Jiao-ling

(GuangxiVeterinaryResearchInstitute,GuangxiKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,Nanning,Guangxi,530001,China)

The plasmid containing the full length M2 gene of H9N2 subtype AIV was used as template for M2e gene amplification by PCR method; the various numbers of copies of M2e gene were constructed using the isocaudamer enzyme ligation ofBglⅡandBamHI, and the various numbers of copies of M2e gene were connected into the vector pGEX-6p-1 forming five recombinant plasmid 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX;five recombinant plasmids were transformed into expression host strain,respectively.The bacterial liquid containing correct recombinant plasmids were induced by different IPTG concentrations and the sizes of the proteins were identified using SDS-PAGE method;the analysis of soluble protein was carried;the immuneoreactivities of five proteins were analyzed using Western blot method.The result showed that the expression levels of 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX reached the highest yield respectively under 0.25,0.25,0.5,0.25 and 0.75 mmol/L final concentration of IPTG after being cultured for 4 h at 37℃;the sizes of the recombinant proteins of 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX were 31.7,37.2,42.7,48.2 and 53.9 ku,respectively;five proteins existed in a form of inclusion body;Western blot analysis showed that the 2M2e-pGEX,4M2e-pGEX,6M2e-pGEX,8M2e-pGEX and 10M2e-pGEX proteins had a good specific reaction with anti-mouse monoclonal antibody against GST.These results lay a foundation for the further obtaining high immunogenicity protein and screening the universal immunogen.

H9N2 subtype avian influenza virus;extracellular domain of M2 (M2e) protein;recombinant protein

2016-09-03

廣西科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(14123001-8)；廣西特聘專家專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(2011B020)；廣西科技攻關(guān)重大專項(xiàng)項(xiàng)目(1222003-2-4)

張民秀(1986-)，女(壯族)，廣西南寧人，碩士，主要從事獸醫(yī)生物技術(shù)研究。*通訊作者

；S852.659.5;Q789

A

1007-5038(2017)04-0007-06