武召珍，代少華，馮翠霞，李 超，2，董 強(qiáng)*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.錯(cuò)那縣覺拉鄉(xiāng)人民政府，西藏錯(cuò)那 856700)

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白藜蘆醇對甲基乙二醛損傷BRL-3A細(xì)胞的抑制作用

武召珍1，代少華1，馮翠霞1，李 超1，2，董 強(qiáng)1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.錯(cuò)那縣覺拉鄉(xiāng)人民政府，西藏錯(cuò)那 856700)

為研究甲基乙二醛(MGO)對大鼠肝細(xì)胞BRL-3A細(xì)胞的損傷機(jī)制，在MGO存在的情況下，以50 μmol/L白藜蘆醇處理BRL-3A，分別用MTT法檢測細(xì)胞活力；DNPH法檢測細(xì)胞內(nèi)Schiff base濃度；DCFH-DA熒光探針法檢測ROS水平；以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量的檢測。結(jié)果表明，MGO導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Schiff base、ROS和MDA顯著增加，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，白藜蘆醇處理可有效改善MGO對細(xì)胞的損傷作用。

甲基乙二醛；白藜蘆醇；BRL-3A；氧化應(yīng)激

在臨床肝病學(xué)的發(fā)展中，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)受到越來越多的關(guān)注。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NAFLD具有相當(dāng)高的發(fā)病率。美國成年人的發(fā)病率可達(dá)到25%左右，日本人和意大利人也有相似的發(fā)病率[1]。NAFLD的主要特征是肝臟脂質(zhì)尤其是甘油三酯的積累，而脂質(zhì)積累與脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激密切相關(guān)[2]。文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激是NAFLD發(fā)生的一個(gè)關(guān)鍵因素[3]。另外，NAFLD病人還表現(xiàn)為體內(nèi)炎癥因子分泌增加和血糖升高等[2]。甲基乙二醛(methylglyoxal,MGO)作為一種常見的活性羰基化合物，普遍存在于機(jī)體的組織和細(xì)胞中。內(nèi)源性的MGO可通過機(jī)體內(nèi)碳水化合物的氧化、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和氨基酸的氧化等多種途徑生成[4-6]。細(xì)胞內(nèi)大多數(shù)的MGO主要來源于葡萄糖代謝和果糖代謝反應(yīng)[7-8]，脂質(zhì)代謝來源的MGO是由甘油、乙酸乙酯和丙酮經(jīng)酶或非酶反應(yīng)轉(zhuǎn)化而來[5]。外源性的MGO主要來自咖啡、烘焙以及油炸食物等，它們很容易從外環(huán)境中穿過細(xì)胞膜而存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[9-10]。MGO因具有高活性羰基而易對蛋白質(zhì)的氨基酸殘基進(jìn)行修飾，形成晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glyxation end products,AGEs)。隨著機(jī)體內(nèi)AGEs的積累，氧化應(yīng)激的標(biāo)志物晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products,RAGE)表達(dá)升高，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[11-12]。此外，MGO可直接增加大鼠主動(dòng)脈中超氧陰離子等活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，引起氧化應(yīng)激[13]。白藜蘆醇是一種天然多酚類化合物，具有很強(qiáng)的抗氧化功能，可作為一種細(xì)胞的抗氧化保護(hù)劑[14]。因此，本研究以大鼠肝細(xì)胞BRL-3A為研究對象，初步探究MGO對BRL-3A的損傷以及白藜蘆醇對BRL-3A的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 白藜蘆醇、MGO、氨基胍(aminoguanidine, AG)、DCFH-DA探針、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、2,4-二硝基苯肼(DNPH)，Sigma公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclon公司產(chǎn)品；硫代巴比妥酸(TBA)等其他試劑，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器 930A熒光光度計(jì)，雷磁PHS-3E型pH計(jì)，GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，倒置相差顯微鏡，全波長酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠肝細(xì)胞系BRL-3A，購自中科院上海細(xì)胞庫。BRL-3A細(xì)胞用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測 細(xì)胞活力用MTT法檢測。96孔板以每孔相同數(shù)量的細(xì)胞做不同處理，24 h之后加入MTT溶液(20 μL，5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基并加入150 μL二甲基亞砜溶解細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚，490 nm處測定光吸收值[15]。細(xì)胞活力=(處理組OD值/對照組OD值)×100%。

1.2.3 非酶糖基化產(chǎn)物Schiff base的檢測 BRL-3A經(jīng)不同試驗(yàn)組處理24 h后，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次。細(xì)胞經(jīng)裂解15 min后，14 000 r/min離心10 min，收集上清。0.5 mL上清液與等量的DNPH(1 mg/mL)室溫暗環(huán)境中孵育1 h，加入1 mL TCA(200 mg/mL)終止反應(yīng)，靜置10 min。10 000 r/min離心10 min，棄上清，以乙酸乙酯和乙醇混合液(1∶1)洗滌3次～4次，自然晾干，1 mL 6 mol/L的鹽酸胍(pH2.3)超聲溶解之后，374 nm測吸光度值，以22000 (mol/L)-1cm-1消光系數(shù)(ε)計(jì)算出Schiff base生成量。C(nmol/mL)=OD 370 nm (實(shí)驗(yàn)組-對照組)×106/ε[16]。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測 處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，用預(yù)冷的PBS清洗2次并收集。細(xì)胞與DCFH-DA工作液(2 μmol/L)在37℃暗環(huán)境下孵育20 min。用熒光分光光度計(jì)檢測熒光值，激發(fā)光為485 nm，發(fā)射光為535 nm。

1.2.5 細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的檢測 處理BRL-3A 24 h后，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞。10 mL/L Trition X-100裂解細(xì)胞20 min，分別取200 μL細(xì)胞勻漿、50 μL 700 g/L三氯乙酸(TCA)加入玻璃管中并振蕩，另加入150 μL超純水和200 μL TBA，振蕩。沸水中煮沸20 min后冰上冷卻5 min，4 000 r/min離心5 min，取200 μL于酶標(biāo)板中532 nm處測吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 5分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)表示，數(shù)據(jù)差異顯著性分析采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對BRL-3A細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，5 μmol/L～100 μmol/L白藜蘆醇可使細(xì)胞活力升高。5 μmol/L和10 μmol/L白藜蘆醇可顯著增加細(xì)胞活力，而20、50、100 μmol/L白藜蘆醇使細(xì)胞活力有輕微升高，但不明顯。0.8 mmol/L MGO處理BRL-3A細(xì)胞24 h后，能顯著減弱細(xì)胞活力，50 μmol/L和100 μmol/L白藜蘆醇可減弱MGO毒性，并且50 μmol/L白藜蘆醇的作用更明顯(圖2)。

2.2 白藜蘆醇對MGO誘導(dǎo)的Schiff base的影響

如圖3所示，0.8 mmol/L MGO促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞Schiff base的生成，50 μmol/L白藜蘆醇可對Schiff base的生成有明顯的抑制作用。活性羰基清除劑AG作為陽性對照，對Schiff base的生成同樣有明顯的抑制作用。

與對照組相比，*P<0.05

與對照組相比，*P<0.05；與MGO組相比，#P<0.05

2.3 白藜蘆醇對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

如圖4所示，MGO明顯增加細(xì)胞內(nèi)ROS水平，50 μmol/L白藜蘆醇可對MGO的作用有明顯的抑制效果，1 mmol/L AG同樣可減少細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

2.4 白藜蘆醇對細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛生成的影響

如圖5所示，0.8 mmol/L MGO促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞 MDA，50 μmol/L白藜蘆醇可對MDA的生成有明顯的抑制作用，1 mmol/L AG對MDA的生成也有明顯的抑制作用。

與對照組相比，*P<0.05；與MGO組相比，#P<0.05

與對照組相比，*P<0.05；與MGO組相比，#P<0.05

與對照組相比，*P<0.05；與MGO組相比，#P<0.05

3 討論

MGO對BRL-3A細(xì)胞的IC50為1.6 mmol/L(數(shù)據(jù)未顯示)，因此本研究所用的MGO濃度在半數(shù)致死濃度以下，為0.8 mmol/L。外環(huán)境中的MGO很容易穿過細(xì)胞膜而存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)[9-10]，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的MGO可與蛋白質(zhì)的氨基酸經(jīng)過多步反應(yīng)生成AGEs。首先，MGO與蛋白游離的氨基生成Schiff base，經(jīng)過Amadori重排之后即形成Amadori產(chǎn)物。其次，這些非酶糖基化的衍生物會再次與游離氨基結(jié)合，經(jīng)過一系列反應(yīng)形成穩(wěn)定的化合物，這些化合物即為AGEs。由于MGO屬于α醛酮，易與蛋白質(zhì)氨基酸發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)生成Schiff base[17-18]。因此，Schiff base含量常被用來反應(yīng)蛋白羰基化程度。蛋白發(fā)生羰基應(yīng)激會最終形成穩(wěn)定的AGEs，AGEs與RAGE結(jié)合后可介導(dǎo)一系列的細(xì)胞信號通路反應(yīng)，引起氧化應(yīng)激和ROS水平增加。此外，MGO可直接導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)ROS水平升高[19]。試驗(yàn)表明，MGO可增加大鼠主動(dòng)脈中超氧陰離子和ONOO-的產(chǎn)生[13]。

白藜蘆醇主要從藥用植物虎杖中提取而得，具有抗癌、抗炎等作用，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生ROS時(shí)，它有較強(qiáng)的抑制作用和自由基的清除作用[20]。在正常的線粒體內(nèi)，白藜蘆醇可通過調(diào)節(jié)ROS主要來源的復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ而調(diào)節(jié)線粒體的呼吸鏈[21]。另外，它可提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等的活性。而當(dāng)金屬離子誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激時(shí)，白藜蘆醇可憑借其較強(qiáng)的抗氧化能力來保護(hù)細(xì)胞不受氧化應(yīng)激的損傷并提高細(xì)胞活力[22]。有證據(jù)表明，過氧化氫誘導(dǎo)人牙齦成纖維細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，可有效減少ROS產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞[22]。本試驗(yàn)所用另外一種抑制劑AG為MGO等活性羰基化合物的捕獲劑，早在20世紀(jì)就已被報(bào)道作為非酶糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的捕獲劑或清除劑，與二羰基化合物反應(yīng)生成三嗪類物質(zhì)[23]。

在本研究中，MGO處理導(dǎo)致BRL-3A細(xì)胞內(nèi)Schiff base濃度、ROS水平和MDA含量升高，表明BRL-3A細(xì)胞已被誘導(dǎo)發(fā)生了氧化應(yīng)激。而白藜蘆醇可顯著降低細(xì)胞內(nèi)Schiff base、ROS以及MDA水平。并且，MGO處理使BRL-3A細(xì)胞活力降低，50 μmol/L白藜蘆醇可明顯提高細(xì)胞活力。本研究確定了MGO可導(dǎo)致BRL-3A細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，而白藜蘆醇可通過降低氧化應(yīng)激水平起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

[1] Marchesini G,Bugianesi E,Forlani G,et al.Nonalcoholic fatty liver, steatohepatitis, and the metabolic syndrome[J].Hepatology,2003,37(4):917-923.

[2] Gaggini M,Morelli M,Buzzigoli E,et al.Non-alcoholic fatty liver disease (nafld) and its connection with insulin resistance,dyslipidemia,atherosclerosis and coronary heart disease[J].Nutrients,2013,5(5):1544-1560.

[3] Leung T M,Nieto N.Cyp2e1 and oxidant stress in alcoholic and non-alcoholic fatty liver disease[J].J Hepatol,2013,58(2):395-398.

[4] Kalapos M P.The tandem of free radicals and methylglyoxal[J].Chem Biol Int,2008,171(3):251-271.

[5] Kalapos M P.Where does plasma methylglyoxal originate from?[J].Diabet Res Clin Pract,2013,99(3):260-271.

[6] Semchyshyn H M.Reactive carbonyl speciesinvivo:Generation and dual biological effects[J].Sci World J,2014(10):417842.

[7] Liu J,Wang R,Desai K,et al.Upregulation of aldolase b and overproduction of methylglyoxal in vascular tissues from rats with metabolic syndrome[J].Cardiovascular Res,2011,92(3):494-503.

[8] Wang Y,Ho C T.Flavour chemistry of methylglyoxal and glyoxal[J].Chem Soc Rev,2012,41(11):4140-4149.

[9] Papetti A,Mascherpa D,Gazzani G.Free α-dicarbonyl compounds in coffee, barley coffee and soy sauce and effects ofinvitrodigestion[J].Food Chem,2014,164:259-265.

[10] Kalapos M P,Wu L.Oxidation of methylglyoxal to co2 by cultured a-10 vascular smooth muscle cells[J].J Invest Biochem,2014,3(4):149-153.

[11] Dhar A,Dhar I,Bhat A,et al.Alagebrium attenuates methylglyoxal induced oxidative stress and age formation in h9c2 cardiac myocytes[J].Life Sci,2016,146:8-14.

[12] Yan S F,Yan S D,Ramasamy R,et al.Tempering the wrath of rage: An emerging therapeutic strategy against diabetic complications,neurodegeneration,and inflammation[J].Annals Med,2009,41(6):408-422.

[13] Sena C M,Matafome P,Crisóstomo J,et al.Methylglyoxal promotes oxidative stress and endothelial dysfunction[J].Pharmacol Res,2012,65(5):497-506.

[14] Liu L,Gu L,Ma Q,et al.Resveratrol attenuates hydrogen peroxide-induced apoptosis in human umbilical vein endothelial cells[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(1):88-94.

[15] Li W,Xu H,Hu Y,et al.Edaravone protected human brain microvascular endothelial cells from methylglyoxal-induced injury by inhibiting ages/rage/oxidative stress[J].PLoS One,2013,8(9):e76025.

[16] Cao G,Cutler R G.Protein oxidation and aging 1. Difficulties in measuring reactive protein carbonyls in tissues using 2, 4-dinitrophenylhydrazine[J].Arch Biochem Biophysi,1995,320(1):106-114.

[17] Oya T,Hattori N,Mizuno Y,et al.Methylglyoxal modification of protein chemical and immunochemical characterization of methylglyoxal-arginine adducts[J]. J Biol Chem,1999,274(26):18492-18502.

[18] Riley M L,Harding J J.The reaction of methylglyoxal with human and bovine lens proteins[J].Biochim Biophys Acta (BBA) Mol Basis Dis,1995,1270(1):36-43.

[19] Chang T,Wu L.Methylglyoxal,oxidative stress,and hypertension[J].Can J Physiol Pharmacol,2006,84(12):1229-1238.

[20] Vega C C,Reyes-Castro L A,Rodríguez-González G L,et al.Resveratrol partially prevents oxidative stress and metabolic dysfunction in pregnant rats fed a low protein diet and their offspring[J].J Physiol,2016,594(5):1483-1499.

[21] Sassi N,Mattarei A,Azzolini M,et al.Cytotoxicity of mitochondria-targeted resveratrol derivatives: Interactions with respiratory chain complexes and atp synthase[J].Biochem Biophys Acta (BBA)Bioenergetics,2014,1837(10):1781-1789.

[22] Orihuela-Campos R C,Tamaki N,Mukai R,et al.Biological impacts of resveratrol,quercetin,and n-acetylcysteine on oxidative stress in human gingival fibroblasts[J].J Clin Biochem Nutrit,2015,56(3):220-227.

[23] Nagai R,Murray D B,Metz T O,et al.Chelation:A fundamental mechanism of action of age inhibitors,age breakers,and other inhibitors of diabetes complications[J].Diabetes,2012,61(3):549-559.

Inhibitory Effect of Resveratrol on Damage of BRL-3A Cells by MGO

WU Zhao-zhen1,DAI Shao-hua1,FENG Cui-xia1,LI Chao1，2,DONG Qiang1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China；2.GovernmentofJuelaCuonaCounty,Cuona,Tibet,856700,China)

To explore the damaged mechanism of methylglyoxal (MGO) on the cell line of BRL-3A,50 μmol/L resveratrol was used to treate BRL-3A cells in the presence of MGO.Cell viability was detected by MTT assay,the concentration of Schiff base was measured by DNPH assay,and the level of ROS was detected using DCFH-DA probe as well as the content of lipid peroxidation product MDA was detected. Results showed that MGO significantly increased levels of Schiff base,ROS and MDA, and induced oxidative stress in BRL-3A cells.However,resveratrol treatment can effectively ameliorate the damage of cells by MGO.

methylglyoxal; resveratrol; BRL-3A; oxidative stress

2016-09-18

武召珍(1989-)，女，河南商丘人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物臨床疾病研究。

S852.33;S853.74

A

1007-5038(2017)04-0083-04

*通訊作者