邊臘紅 徐華超 四川省涼山彝族自治州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心 615000

基層使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)儀器的注意事項(xiàng)

邊臘紅 徐華超 四川省涼山彝族自治州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心 615000

基層檢測(cè)單位由于經(jīng)費(fèi)有限、技術(shù)力量薄弱，在開(kāi)展獸藥殘留檢測(cè)時(shí)需要考慮檢測(cè)技術(shù)和成本等因素。酶聯(lián)免疫法具有操作簡(jiǎn)便、樣品處理量大、靈敏度高、儀器化程度低和分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前成為了各級(jí)基層檢測(cè)單位檢測(cè)獸藥殘留最理想的檢測(cè)技術(shù)之一。本文主要闡述基層檢測(cè)獸藥殘留使用酶聯(lián)免疫法所需的主要儀器及注意事項(xiàng)。

基層檢測(cè)；獸藥殘留；酶聯(lián)免疫法；儀器

獸藥殘留是指動(dòng)物產(chǎn)品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及（或）其代謝物，以及與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)。對(duì)人體健康影響很大。主要有毒性反應(yīng)、誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌株和三致作用(致畸、致癌、致突變)[1]。因此，對(duì)獸藥殘留進(jìn)行廣泛、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)很有必要。

目前檢測(cè)獸藥殘留的方法很多，但是大多數(shù)需要昂貴的儀器設(shè)備，操作繁瑣，成本很高?；鶎訖z測(cè)單位由于經(jīng)費(fèi)、人員有限，技術(shù)力量薄弱，在開(kāi)展獸藥殘留檢測(cè)時(shí)就需要考慮檢測(cè)成本及技術(shù)水平等。酶聯(lián)免疫吸法具有操作簡(jiǎn)便、樣品處理量大、靈敏度高、重現(xiàn)性好、儀器化程度低和分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前成為各級(jí)基層檢測(cè)單位檢測(cè)獸藥殘留最理想的檢測(cè)技術(shù)之一，展示了良好的應(yīng)用前景[2]。

1 離心機(jī)

ELISA前處理操作中離心機(jī)要能進(jìn)行50mL離心管離心，非冷凍也可以。離心機(jī)要能夠提供實(shí)驗(yàn)所需的離心力（Fr）： Fr=11.19×(rpm/1000)2×r×g。 Fr越大，越有利于分離。一般實(shí)驗(yàn)操作要求的3000g即為離心力。使用離心機(jī)前，先看使用注意事項(xiàng)；在操作時(shí)，要保證離心管對(duì)稱放置。

2 移液器

移液器一般使用 50～1000μL、50～300μL 八通道排槍。 ELISA 加樣量?。?0～200μL），其準(zhǔn)確性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用稱重法校準(zhǔn)：低、中、高三個(gè)刻度分別吸取指示量的水，用萬(wàn)分之一的天平稱重后計(jì)算是否準(zhǔn)確，一般誤差在±5%以內(nèi)。實(shí)際操作過(guò)程中，移液器提倡用“吸二打一”。其優(yōu)勢(shì)在于，在加樣過(guò)程中在板孔內(nèi)不出現(xiàn)或者很少出現(xiàn)氣泡，能夠提高加樣速度，縮短前后樣本反應(yīng)的時(shí)間差。

3 氮吹儀

它是利用氮?dú)獾目焖倭鲃?dòng)打破液體上方的氣液平衡，從而使液體揮發(fā)速度加快；并通過(guò)升高溫度，進(jìn)而達(dá)到濃縮的目的。

注意事項(xiàng)：針頭懸于液面上方，不可接觸液面；氣流調(diào)試平穩(wěn)后，再放入樣本；加熱系統(tǒng)溫度設(shè)置在規(guī)定范圍內(nèi)。

4 酶聯(lián)免疫試劑盒[3-6]

酶聯(lián)免疫試劑盒是獸藥殘留檢測(cè)的核心儀器，它的優(yōu)劣在很大程度上影響著檢測(cè)的準(zhǔn)確性，因此在實(shí)驗(yàn)前對(duì)試劑盒的下列指標(biāo)注意考查，與提供的參數(shù)進(jìn)行比對(duì)，做出評(píng)判。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的好壞，將會(huì)影響到最后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以考察試劑盒的相關(guān)系數(shù)和抑制率。

試劑盒中含有不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)曲線至少由5個(gè)濃度組成，測(cè)定次數(shù)不少于5次，以確定工作濃度范圍和IC50范圍，藥物最大殘留限量（MRL）必須在曲線范圍內(nèi)。其中IC50是標(biāo)準(zhǔn)曲線50%的抑制濃度,是反映試劑盒靈敏度的指標(biāo)，IC50的數(shù)值越小，靈敏度越高。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)≧0.98。

工作濃度范圍通過(guò)陰性、臨界值濃度和陽(yáng)性的樣品測(cè)定來(lái)確定，每個(gè)濃度重復(fù)不少于5次。

（2）檢出限和定量限。檢測(cè)限為20份空白樣品測(cè)定均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差。定量限應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線中最低濃度點(diǎn)。應(yīng)對(duì)該濃度樣品至少測(cè)定6次以進(jìn)行驗(yàn)證，而不能通過(guò)外延法推斷。

（3）精密度和準(zhǔn)確度。對(duì)于有最高殘留限量的藥物，添加濃度為MRL及MRL上下各一個(gè)濃度；對(duì)于禁用藥物，添加濃度為定量限和2倍定量限，每個(gè)添加濃度至少測(cè)定5個(gè)平行樣，并至少進(jìn)行3批實(shí)驗(yàn)（不同檢測(cè)日期，不同標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同批次的試劑盒）。

準(zhǔn)確度為回收率范圍大于40%或符合相應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求；精密以變異系數(shù)表示；批內(nèi)變異系數(shù)，每批平行樣之間的變異系數(shù)≦25%，禁用藥物≦30%。

批間變異系數(shù)：所有樣品之間的變異系數(shù)≦30%，禁用藥物≦40%。定性方法為陰性和陽(yáng)性樣品各測(cè)定不少于50份，確定假陽(yáng)性率和假陰性率。假陽(yáng)性率=假陽(yáng)性÷（假陽(yáng)性+真陰性），假陰性率=假陰性÷（假陰性+真陰性），一般要求假陽(yáng)性率≦5%，假陰性率為0。

（4）特異性。在試劑盒中，特異性常用交叉反應(yīng)率表示。與待測(cè)藥物相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)可能和酶標(biāo)板上的抗原結(jié)合，產(chǎn)生交叉反應(yīng)，使測(cè)定結(jié)果升高，還可能成為假陽(yáng)性。對(duì)于檢測(cè)單一藥物的試劑盒，其他相似藥物的交叉反應(yīng)率越低，表明試劑盒特異性越強(qiáng)。

（5）產(chǎn)品外觀。觀察試劑盒外包裝是否有產(chǎn)品名稱、生產(chǎn)廠家、型號(hào)、批號(hào)和生產(chǎn)日期等標(biāo)識(shí)，以及盒內(nèi)是否有說(shuō)明書、質(zhì)控檢驗(yàn)單等，若其中多項(xiàng)空白則需注意，可能該試劑盒為不合格產(chǎn)品。盒內(nèi)封裝試劑在正常情況下應(yīng)該是澄清、透明的液體，不應(yīng)出現(xiàn)結(jié)晶、絮狀物或沉淀。取出試劑盒在常溫下回溫30分鐘，觀察試劑瓶里的試劑是否有標(biāo)簽脫落、漏液現(xiàn)象。

需特別注意的是試劑盒應(yīng)保存于2～8℃條件下，不要冷凍，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色底物液對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。試劑盒使用前應(yīng)先從冰柜里取出，室溫下放置30分鐘以上，以減少邊緣效應(yīng)對(duì)結(jié)果的影響。試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致吸光度值和靈敏度發(fā)生變化，會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。反應(yīng)終止液為高濃度硫酸，避免接觸皮膚。

5 恒溫培養(yǎng)箱

它主要是為實(shí)驗(yàn)中的酶聯(lián)免疫反應(yīng)提供恒溫的環(huán)境。要經(jīng)常檢查恒溫箱溫度計(jì)所示溫度和溫箱內(nèi)實(shí)測(cè)溫度是否一致，允許有±1℃的誤差。

6 酶標(biāo)儀

酶標(biāo)儀是對(duì)酶聯(lián)免疫檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行讀取和分析的專業(yè)儀器。在檢測(cè)前將酶標(biāo)儀預(yù)熱30分鐘。在酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的值時(shí)，應(yīng)在5分鐘內(nèi)讀完。經(jīng)常維護(hù)其光學(xué)部分，防止濾光片霉變，定期檢測(cè)校正，使其保持良好的工作性能。

7 結(jié)語(yǔ)

儀器是實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)、檢測(cè)活動(dòng)最直接的工具和重要的基礎(chǔ)設(shè)施及關(guān)鍵資源，是檢測(cè)機(jī)構(gòu)開(kāi)展檢測(cè)工作所必需的物質(zhì)基礎(chǔ),也是國(guó)家有關(guān)部門對(duì)檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)收、審查認(rèn)可、計(jì)量認(rèn)證等行政管理時(shí)必須考核的硬件內(nèi)容。有了這些儀器，基層檢測(cè)單位就能夠開(kāi)展獸藥殘留的定性和定量工作，能夠?yàn)楫?dāng)?shù)卣块T了解當(dāng)?shù)匦笄莓a(chǎn)品現(xiàn)狀提供數(shù)據(jù)支撐。

[1]賀家亮，李開(kāi)雄，等.動(dòng)物性食品獸藥殘留現(xiàn)狀及對(duì)策[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2006，23(7)：22-24.

[2]邢應(yīng)壽，祁克宗.ELISA技術(shù)在畜產(chǎn)品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)發(fā)展，2004，25（3）：19-22.

[3]農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號(hào).關(guān)于發(fā)布獸藥殘留ELISA試劑（盒）備案審查技術(shù)資料要求和“獸藥殘留ELISA試劑（盒）備案參與評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)”的通知[Z].

[4]伏慧明，郭展旗,等.獸藥殘留檢測(cè)中試劑盒的驗(yàn)證評(píng)判方法研究[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2008，10（S2）：109-111.

[5]王麗娜，郝利忠,等.獸藥殘留檢測(cè)中酶聯(lián)免疫試劑盒的選擇原則與使用注意事項(xiàng)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2013（7）：41-44.

[6]劉冬梅，蒲明.選擇獸藥殘留酶聯(lián)免疫試劑盒的關(guān)鍵因素[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（20）：258，260.