李亞偉，張小菊，王科珂，于艷雪，張祥林，張偉，張俊華，楊定，陳乃中

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100176；2.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊 830063；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)譜分析

李亞偉1,2,3，張小菊2，王科珂2，于艷雪1，張祥林2，張偉2，張俊華1，楊定3，陳乃中1

(1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院植物檢疫研究所，北京 100176；2.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊 830063；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，北京 100083)

【目的】克隆棗實(shí)蠅CarpomyavesuvianaCosta氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, CvcoOBP)基因，對(duì)其表達(dá)譜進(jìn)行分析，為棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白的深入研究奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉?duì)棗實(shí)蠅頭部RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)蛋白序列比對(duì)以及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析棗實(shí)蠅OBP序列，運(yùn)用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction, sqRT-PCR)方法對(duì)獲得的CvcoOBP序列進(jìn)行組織表達(dá)特異性研究?！窘Y(jié)果】轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后共獲得7個(gè)OBP, 命名為 (GenBank登錄號(hào)分別為：KU975053、KU975054、KU975055、KX059394、KU975056、KX059395、KX059396)。對(duì)CvcoOBP1-7進(jìn)行蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CvcoOBP1、CvcoOBP3、CvcoOBP4、CvcoOBP6、CvcoOBP7是典型的OBP家族成員，具有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基；CvcoOBP2和CvcoOBP5屬于“Minus-C”家族成員，具有4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，CvcoOBP1-7分別與不同的OBP有較近的進(jìn)化關(guān)系。半定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CvcoOBP1-7在棗實(shí)蠅腹部、頭部及胸部都有表達(dá)，且表達(dá)量較高；CvcoOBP1、CvcoOBP2在翅中有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低 ；CvcoOBP1、CvcoOBP5、CvcoOBP6在足中也有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低。【結(jié)論】獲得并分析了7個(gè)CvcoOBP，不同CvcoOBP表達(dá)部位和表達(dá)量各不相同；CvcoOBP1-6分別屬于OBP56g，OBP8a，OBP83a，OBP56h，OBP99c，OBP83ef類型。

棗實(shí)蠅 ；氣味結(jié)合蛋白；組織表達(dá)

0 引 言

【研究意義】棗實(shí)蠅被列入我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄。2007 年棗實(shí)蠅首次在我國(guó)新疆地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，并且對(duì)棗果業(yè)造成了毀滅性的危害。目前，該蟲在新疆仍處于擴(kuò)展蔓延的態(tài)勢(shì)。研究氣味結(jié)合蛋白對(duì)了解棗實(shí)蠅嗅覺用作機(jī)制意義深遠(yuǎn)，并且可以為開發(fā)棗實(shí)蠅專性引誘劑奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究人員對(duì)昆蟲氣味結(jié)合蛋白做過(guò)大量研究，但對(duì)棗實(shí)蠅的研究還未見報(bào)道。氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein，OBP)是一種存在于昆蟲化學(xué)感受器官的水溶性蛋白，通常含有135～220個(gè)氨基酸序列以及2～3個(gè)二硫鍵[1]。OBP主要存在于昆蟲感器淋巴液中，它能夠結(jié)合疏水性的氣味分子，并將它們轉(zhuǎn)運(yùn)到受體分子，隨后嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)通路被激活[2]。OBP家族成員通常含有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，根據(jù)半胱氨酸殘基數(shù)量的變化，OBP被劃分為“Classic”, “Minus-C”, “Plus-C”, “Dimer”和 “Atypical” OBP[3,4,5]。近期研究表明，OBP的功能不僅僅是作為一種氣味分子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，更重要的是它能夠識(shí)別氣味分子[6-8]。缺失“LUSH”O(jiān)BP的果蠅突變體不能夠應(yīng)答氣味分子乙醇以及苯甲醛[9,10]；此外，該果蠅突變體完全喪失了對(duì)其性信息素物質(zhì)的敏感性[11]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。研究選取棗實(shí)蠅成蟲頭部為研究對(duì)象，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，在分子水平探索棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白特點(diǎn)，并且通過(guò)組織特異性表達(dá)，探討其潛在的功能。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析獲得棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白，對(duì)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，研究氣味結(jié)合蛋白在不同組織中表達(dá)的特異性，為研究棗實(shí)蠅嗅覺機(jī)制及開發(fā)專性引誘劑提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試?yán)ハx

新疆吐魯番地區(qū)棗園摘取有棗實(shí)蠅幼蟲的蛀果，帶回實(shí)驗(yàn)室等待幼蟲化蛹、羽化、收集成蟲。飼養(yǎng)條件為27℃，相對(duì)濕度60%，光周期12L∶12D。

1.1.2 儀器及設(shè)備

恒溫振蕩金屬浴：eppendorf；PCR儀：ABI；凝膠電泳儀：bio-red；移液器：eppendorf；高速離心機(jī)：eppendorf。

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

收集羽化后2～5 d的雄蟲和雌蟲各50頭，在冰上用鑷子分別取成蟲頭部、翅膀、腹部、胸部及足，操作時(shí)盡量保證完整性。RNA提取使用RNA trizol提取試劑(TRIzol? LS Reagent，ThermoFisher)；cDNA合成使用寶生物試劑盒(PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit，TAKARA)；操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取樣品總 RNA 后，用帶有 Oligo(dT) 的磁珠富集mRNA。加入 buffer 將 mRNA 打斷成短片段，以 mRNA 為模板，合成 cDNA 鏈，再經(jīng)過(guò)純化并加入緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)、加 polyA 并連接測(cè)序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，建好的測(cè)序文庫(kù)上機(jī)測(cè)序。測(cè)序結(jié)束后，數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控，得到clean reads。將clean reads從頭組裝成Unigene，然后對(duì)每個(gè)Unigene進(jìn)行ORF Finding、SNP分析以及簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記分析，然后根據(jù)NT(可選)，NR，SWISSPROT，KOG/COG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)Unigene進(jìn)行基因信息的注釋，然后對(duì)注釋上的gene進(jìn)行GO富集分析和KEGG pathway分析。

1.2.3 蛋白序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將棗實(shí)蠅7個(gè)OBP進(jìn)行系列比對(duì)，使用MEGA V6.0軟件。系統(tǒng)進(jìn)化分析包括11個(gè)桔小實(shí)蠅(BactroceradorsalisHendel) OBP、5個(gè)地中海實(shí)蠅(CeratitiscapitataWiedemann) OBP、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)以及研究中的7個(gè)棗實(shí)蠅OBP。氨基酸序列分析前，先將每一蛋白序列的信號(hào)肽序列去除，然后對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，使用MAFFT v6.864(E-INS-i strategy, BLOSUM62 matrix, 1 000 maxiterate and offset 0)；進(jìn)化分析使用鄰位相連法(Neighbor-joining, 1 000 bootstrap replications)，使用MEGA V6.0軟件。

1.2.4 半定量PCR

以棗實(shí)蠅頭部、翅、腹部、胸部及足的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參照基因，分別擴(kuò)增棗實(shí)蠅OBPs。PCR反應(yīng)體系為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，72℃ 30 s，55℃ 40 s；72℃ 7 min；36個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系(20 μL)為：cDNA 2 μL，2×PCR Mix 10 μL，正向引物0.5 μL(10 μmol/L)，反向引物0.5 μL(10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。列出引物序列。表1

表1 研究所用棗實(shí)蠅OBP基因引物
Table 1 Oligo nucleotide primers for amplifying the OBP genes fromCarpomyavesuvianaCosta

引物名稱Thenameofprimer引物序列(5’-3’)Primersequence(5’-3’)OBP1-FOBP1-RAATCCACCCAATCCCCCCTGCTTGACCATAAOBP2-FOBP2-RTAAAGCGAATACGGAATGAACCATTGACCCACOBP3-FOBP3-RTCGTGCTACCTGTTGACGCCATCGCTAAATOBP4-FOBP4-RCTGGCTGGCTTGGTGATGCCCTGCTTCTCOBP5-FOBP5-RAAAACTTTGAATACCCTGCTGCTCGTTCTTGTCCOBP6-FOBP6-RGAAGTAGGCACCAAACTCGGCATCAAACCOBP7-FOBP7-RCAGTGCTGTTTATTGGCTGTTCTATTACCGAGGAGβ-actin-Fβ-actin-RCTCGTCCAACCGTTCATACCCTGACCTGCCCACTGAAGTT

2 結(jié)果與分析

2.1 棗實(shí)蠅OBP序列獲得

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析后共獲得7個(gè)棗實(shí)蠅OBP序列，分別命名為CvcoOBP1、CvcoOBP2、CvcoOBP3、CvcoOBP4、CvcoOBP5、CvcoOBP6、CvcoOBP7。通過(guò)蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，7個(gè)棗實(shí)蠅OBP都具有PBP-GOBP結(jié)構(gòu)域，這是昆蟲典型OBP蛋白的重要特征。將7個(gè)棗實(shí)蠅OBP序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行蛋白序列比對(duì)，除了CvcoOBP6與地中海實(shí)蠅OBP序列匹配度最佳外，其他棗實(shí)蠅OBP與雙翅目實(shí)蠅科昆蟲蘋果實(shí)蠅的OBP序列匹配度更好，此外，對(duì)每種棗實(shí)蠅CvcoOBP1-7的開放讀碼框、編碼氨基酸數(shù)量、分子量、等電點(diǎn)、是否存在信號(hào)肽進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果為開放讀書碼框長(zhǎng)度在于372～510 bp，編碼氨基酸數(shù)量為了124～170aa，等電點(diǎn)區(qū)間為5.6～6.9，分子量大小為13.48～19.53 kDa,除CvcoOBP7沒有信號(hào)肽序列外。CvcoOBP1-6都存在一段信號(hào)肽序列。表2，表3

表2 棗實(shí)蠅OBP與最佳匹配序列
Table 2 CvcoOBP with best-hit match sequences

棗實(shí)蠅OBP種類CvcoOBPtype比對(duì)序列來(lái)源(登錄號(hào))SourcebySequencealignment(NCBInumber)覆蓋率Coverage(%)E值E-value識(shí)別率Identity(%)CvcoOBP1蘋果實(shí)蠅GOBP56h-like(XP＿017485615)1002e-7181CvcoOBP2蘋果實(shí)蠅GOBP99a-like(XP＿017472959)1005e-10492CvcoOBP3蘋果實(shí)蠅PBP-relatedprotein6-like(XP＿017493809)1009e-9891CvcoOBP4蘋果實(shí)蠅GOBP56h-like(XP＿017486157)1002e-6267CvcoOBP5蘋果實(shí)蠅GOBP99a(XP＿017464529)1004e-9893CvcoOBP6地中海實(shí)蠅GOBP99a(XP＿004523508)999e-8884CvcoOBP7蘋果實(shí)蠅GOBP69a(XP＿017477316)821e-8888

表3 CvcoOBP1-7 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果
Table 3 Transcriptome analysys of CvcoOBP1-7

棗實(shí)蠅OBP種類CvcoOBPtype開放讀碼框ORF編碼氨基酸數(shù)量Numberofaminoacid分子量Molecularweight等電點(diǎn)Isoelectricpoint信號(hào)肽SignalpeptideCvcoOBP1372bp124aa1348kDa61有CvcoOBP2465bp155aa1853kDa61有CvcoOBP3450bp150aa1754kDa56有CvcoOBP4411bp137aa1523kDa63有CvcoOBP5447bp149aa1716kDa59有CvcoOBP6429bp143aa166kDa69有CvcoOBP7510bp170aa1953kDa60無(wú)

2.2 氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化

為了明確棗實(shí)蠅OBP是否為昆蟲典型OBP以及判斷7種棗實(shí)蠅OBP所屬的亞家族，將7個(gè)OBP進(jìn)行多序列比對(duì)，CvcoOBP1、CvcoOBP3、CvcoOBP4、CvcoOBP6、CvcoOBP7具有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，屬于“Classic”家族；CvcoOBP2和CvcoOBP5具有4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，屬于“Minus-C”家族成員(圖1)。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析了7個(gè)棗實(shí)蠅OBP與雙翅目果蠅、桔小實(shí)蠅及地中海實(shí)蠅的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果表明：CvcoOBP1 和CvcoOBP2分別與桔小實(shí)蠅OBP5(OBP56g)和 OBP1(OBP8a)聚類在一起；CvcoOBP3與桔小實(shí)蠅OBP(OBP83a)、地中海實(shí)蠅OBP83a-2、黑腹果蠅OBP83a、黑果腹蠅OBP83b聚類在一起；CvcoOBP4與桔小實(shí)蠅OBP6(OBP56h)及地中海實(shí)蠅OBP56h聚類在一支；CvcoOBP5與桔小實(shí)蠅OBP10(OBP99c)、黑腹果蠅OBP99c聚類在一支；CvcoOBP6與桔小實(shí)蠅OBP8(OBP83ef)、黑腹果蠅OBP83ef聚類在一支；CvcoOBP7為單獨(dú)一個(gè)進(jìn)化分支(圖2)。圖1，圖2

保守半胱氨酸殘基以星形標(biāo)出，信號(hào)肽以下劃線表示

Conserved cysteines are characterised by star, and signal peptide are underlined

圖1 棗實(shí)蠅OBP多序列比對(duì)
Fig.1 Amino acid alignment of OBP inCarpomyavesuvianaCosta

棗實(shí)蠅OBP:CvcoOBP,桔小實(shí)蠅OBP(BdorOBP)，地中海實(shí)蠅OBP(CcapOBP)，黑腹果蠅OBP(DmelOBP)

BactroceradorsalisHendel OBP(BdorOBP),CeratitiscapitataWiedemann OBP(CcapOBP),DrosophilamelanogasterOBP(DmelOBP)

圖2 棗實(shí)蠅OBP系統(tǒng)進(jìn)化
Fig.2 Phylogenetic analysis of OBP inCarpomyavesuvianaCosta

2.3 棗實(shí)蠅OBP組織表達(dá)特異性

以棗實(shí)蠅翅、腹、足、頭及胸部的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，半定量PCR擴(kuò)增棗實(shí)蠅OBP基因。結(jié)果表明，CvcoOBP1-CvcoOBP7在棗實(shí)蠅腹部、頭部及胸部都有表達(dá)，且相對(duì)表達(dá)量較高；CvcoOBP1、CvcoOBP2在翅中有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低；CvcoOBP1、CvcoOBP5、CvcoOBP6在足中也有表達(dá)，但表達(dá)量相對(duì)較低。圖3

圖3 棗實(shí)蠅OBP在不同組織中表達(dá)量
Fig.3 Expression profiling of OBP in different tissues ofCarpomyavesuvianaCosta

3 討 論

昆蟲嗅覺蛋白在嗅覺系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，它能夠識(shí)別和結(jié)合環(huán)境中有生理活性的氣味分子。在昆蟲嗅覺機(jī)制研究中，嗅覺蛋白的篩選及克隆和表達(dá)是研究基礎(chǔ)。因此，研究人員首選通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、蛋白序列特征分析以及系統(tǒng)進(jìn)化分析篩選并獲得研究對(duì)象的嗅覺蛋白；其中以氣味結(jié)合蛋白和化學(xué)感受蛋白為首要研究對(duì)象，還包括三種不同基因家族編碼的受體分子：氣味受體、味覺受體和促離子型受體。研究首次發(fā)現(xiàn)了7個(gè)棗實(shí)蠅OBP，對(duì)其序列進(jìn)行了生化分析，并且確定了7個(gè)OBP類型。CvcoOBP1-6均為典型OBP家族蛋白，OBP7未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽并且在系統(tǒng)進(jìn)化分析中單獨(dú)存在，這可能與測(cè)序結(jié)果不完整有關(guān)。棗實(shí)蠅OBP1、OBP2僅與雙翅目實(shí)蠅科橘小實(shí)蠅聚類在一起，說(shuō)明這兩種OBP進(jìn)化上相對(duì)保守；而CvcoOBP3-6同時(shí)和實(shí)蠅科兩種昆蟲以及果蠅不同OBP能夠聚類在一支，這可能說(shuō)明它們進(jìn)化相對(duì)較快。承擔(dān)的生理功能更具有普遍性。尤其是CvcoOBP3分別與桔小實(shí)蠅OBP(OBP83a)、地中海實(shí)蠅OBP83a-2、黑腹果蠅OBP83a、黑腹果蠅OBP83b聚類在一起，有研究報(bào)道地中海實(shí)蠅OBP83a-2能夠識(shí)別信息素成分并且可與其相互作用引起觸角電位反應(yīng)[12]。因此，假設(shè)CvcoOBP3也應(yīng)該與其信息素物質(zhì)有較高的結(jié)合能力，其功能可能涉及識(shí)別信息素物質(zhì)并且將其轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元細(xì)胞膜上的受體。CvcoOBP2與OBP8a聚類在一起，在黑腹果蠅研究中發(fā)現(xiàn)，OBP8a在幼蟲時(shí)期表達(dá)，其功能涉及到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的感知[13]。根據(jù)這一研究報(bào)道，推斷CvcoOBP2功能參與棗實(shí)蠅幼蟲在寄主中取食。針對(duì)其他類型的OBP，目前在雙翅目昆蟲中還沒未其功能研究的報(bào)道。研究中缺乏對(duì)棗實(shí)蠅OBP功能方面的探索。其主要原因是目前仍然沒有報(bào)道棗實(shí)蠅的信息素物質(zhì)。因此，在棗實(shí)蠅OBP功能研究方面，下一步首選需要篩選出棗實(shí)蠅信息素物質(zhì)以及其寄主揮發(fā)性物質(zhì)，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及蛋白表達(dá)沉默探索棗實(shí)蠅OBP潛在功能，同時(shí)為開發(fā)高效引誘劑奠定基礎(chǔ)。在組織特異性研究中，棗實(shí)蠅OBP基因在翅、腹、足、頭、胸中均有不同程度的表達(dá)，不同CvcoOBP基因表達(dá)部位和表達(dá)量各不相同。這與黃蜂Polistesdominulus[14]、瓜實(shí)蠅Bactroceracucurbitae[15]等一些OBP表達(dá)方式十分相似，進(jìn)一步確定了OBP不僅在嗅覺機(jī)制充當(dāng)重要角色，它還具有其它生理功能，例如組織再生等。針對(duì)OBP基因表達(dá)研究，下一步工作應(yīng)該涉及發(fā)育時(shí)期表達(dá)研究、以及不同性別表達(dá)研究，進(jìn)一步挖掘OBP在昆蟲中發(fā)揮的生理功能。

4 結(jié) 論

研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)了7個(gè)棗實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白，蛋白序列分析與比對(duì)結(jié)果顯示，CvcoOBP1、CvcoOBP3、CvcoOBP4、CvcoOBP6、CvcoOBP7具有6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基；CvcoOBP2和CvcoOBP5具有4個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基；除了CvcoOBP6與地中海實(shí)蠅OBP序列匹配度最佳外，其他棗實(shí)蠅OBP與雙翅目實(shí)蠅科昆蟲蘋果實(shí)蠅的OBP序列匹配度更好。CvcoOBP1-6都有信號(hào)肽，但是CvcoOBP7沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽；此外，蛋白序列進(jìn)化分析結(jié)果表明，CvcoOBP1-2僅與桔小實(shí)蠅OBP聚類在一起，CvcoOBP3-6同時(shí)與實(shí)蠅科昆蟲及果蠅不同類型的OBP聚類在一支。CvcoOBP1-6分別屬于OBP56g，OBP8a，OBP83a，OBP56h，OBP99c，OBP83ef類型。在組織特異性研究中，棗實(shí)蠅OBP基因在翅、腹、足、頭、胸中均有不同程度的表達(dá)，不同的CvcoOBP基因表達(dá)部位和表達(dá)量各不相同。

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[12] Siciliano, P., He, X. L., Woodcock, C., Pickett, J. A., Field, L. M., & Birkett, M. A., et al. (2014). Identification of pheromone components and their binding affinity to the odorant binding protein ccapobp83a-2 of the mediterranean fruit fly, ceratitis capitata.InsectBiochemistry&MolecularBiology, 48(100):51-62.

[13] Siciliano, P., Scolari, F., Gomulski, L. M., Falchetto, M., Manni, M., & Gabrieli, P., et al. (2014). Sniffing out chemosensory genes from the mediterranean fruit fly, ceratitis capitata.PlosOne, 9(1):e85523.

[14] Calvello, M., Brandazza, A., Navarrini, A., Dani, F. R., Turillazzi, S., & Felicioli, A., et al. (2005). Expression of odorant-binding proteins and chemosensory proteins in some hymenoptera.InsectBiochemistry&MolecularBiology, 35(4):297-307.

[15] 申建梅，胡黎明，賓淑英,等. 瓜實(shí)蠅嗅覺受體基因的克隆及表達(dá)譜分析[J]. 昆蟲學(xué)報(bào)，2011，54(3):265-271.

SHEN Jian-mei, HU Li-ming, BIN Shu-ying, et al. (2011). Cloning and expression profiling of an olfactory receptor gene in Bactrocera cucurbitae (Coquillett) (Diptera: Tephritidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 54(3):265-271. (in Chinese)

Supportedby:ResearchprojectsoftheStateAdministrationofqualitysupervisionandinspection"MonitoringattractantsforimportantquarantinepestofCarpomya vesuvianaCosta"(2015IK321);NationalScienceandtechnologysupportprogramin12thFive-Year"Studyontheriskandmonitoringtechnologyfortheintroductionofinvasivepests"(2015BAD08B01)；AQSIQNon-ProfitIndustryResearchProjects“Researchonthecolonizationfactorsandriskfactorsofalienorganismsandtheircontroltechniques”(201410014).

Cloning and Expression Profiling of Odorant Binding Protein Gene inCarpomyavesuviana(Costa) (Diptera: Tephritidae)

LI Ya-wei1,2,3, ZHANG Xiao-ju2, WANG Ke-ke2, YU Yan-xue1,ZHANG Xiang-lin2, ZHANG Wei2, ZHANG Jun-hua1, YANG Ding3, CHEN Nai-zhong1

(1.ResearchInstituteofPlantQuarantine,ChineseAcademyofInspectionandQuarantine,Beijing100176,China; 2.XinjiangEntryExitInspectionandQuarantinePortal,Urumqi830063,China;3.ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)

【Objective】 This study aims to cloneCarpomyavesuvianaCosta odorant binding protein (CvcoOBP) and analyze expression profile of CvcoOBP in order to lay the foundation of researching CvcoOBP inCarpomyavesuvianaCosta.【Method】Based on transcriptome sequencing of cephalic RNA, the study has analyzed CvcoOBP according to alignment and phylogenetic analysis. The research was also conducted into the tissue specific expression of CvcoOBP by semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction (sqRT-PCR).【Result】The study has obtained seven CvcoOBP that had been named respectively as CvcoOBP1-7(GenBank accession number: KU975053, KU975054, KU975055, KX059394, KU975056, KX059395 and KX059396). According to amino acid alignment, CvcoOBP1, CvcoOBP3, CvcoOBP4, CvcoOBP6 and CvcoOBP7 had been proved to be a family of classic OBP, which contained six highly conversed cysteine residues. CvcoOBP2 and CvcoOBP5 belonged to a family of "Minus-C", which had only four highly conversed cysteine residues. Phylogenetic analysis showed that CvcoOBP1-7 had close relationships with different OBPs. Finally, sqRT-PCR revealed that CvcoOBP1-7 could be highly expressed in abdomen, head and thorax. CvcoOBP1 and CvcoOBP2couldbealsoexpressedinwingswithrelativelylowexpression.CvcoOBP1,CvcoOBP5andCvcoOBP6werealsofoundinlegs.【Conclusion】Forthefirsttime,thestudyobtainedandanalyzedsevenCvcoOBP.DifferentCvcoOBParevariousintermsofexpressionsitesandexpressionquantity.TheCvcoOBP1-6separatelybelongstoOBP56g,OBP8a,OBP83a,OBP56h,OBP99candOBP83eftype.

Carpomya vesuvianaCosta;odorantbindingprotein;expressionprofiling

10.6048/j.issn.1001-4330.2017.02.014

2016-11-04

國(guó)家質(zhì)檢總局科研項(xiàng)目“重要檢疫性入侵害蟲棗實(shí)蠅監(jiān)測(cè)誘集物質(zhì)”(2015IK321)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃“重要外來(lái)有害生物傳入風(fēng)險(xiǎn)及監(jiān)測(cè)技術(shù)”(2015BAD08B01)；質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項(xiàng)“外來(lái)生物定殖因子及危害因子研究及防控技術(shù)”(201410014)

李亞偉(1987-)，男，新疆人，農(nóng)藝師，博士研究生，研究方向?yàn)槔ハx化學(xué)生態(tài)學(xué)，(E-mail)110983128@qq.com

陳乃中(1964-)，男，湖南人，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槔ハx化學(xué)生態(tài)學(xué)，(E-mail)chennz@263.net.cn

S436.65；S188

A

1001-4330(2017)02-0313-07