唐敬潔，劉玉芬，吳 迪

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150025)

禽類Toll樣受體研究進展

唐敬潔，劉玉芬*，吳 迪

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150025)

Toll樣受體(TLRs)是模式識別受體家族的一員，在天然免疫反應(yīng)中扮演重要角色。在禽類中至今已發(fā)現(xiàn)10種TLRs。研究表明在機體感染病原體時，將激活TLRs并引起一系列抗病毒相關(guān)因子的上調(diào)，參與宿主抗感染免疫反應(yīng)。論文主要介紹禽類TLRs的基本特征及抗病毒信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，同時對TLRs的抗微生物作用進行分析，為TLRs的分子機制研究提供參考。

禽；Toll樣受體；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；抗感染作用

脊椎動物的天然免疫系統(tǒng)是防御病原體入侵的第一道防線，首先以非特異性方式攻擊。在這個過程中，脊椎動物表達不同的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)，識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMP)，引發(fā)轉(zhuǎn)錄因子的活化和先天性抗病毒基因的表達，激活PRRs，實現(xiàn)宿主抗病毒防御的功能[1]。哺乳動物PRRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)、RIGI樣受體(RIG-I like receptors，RLRs)、 C型凝集素樣受體(C-type lectin receptors，CLRs)和視黃酸誘導(dǎo)基因蛋白I樣受體(retinoic acid-inducible gene-like receptors，NLRs)，在天然免疫和適應(yīng)性免疫抵抗微生物過程中起到關(guān)鍵作用[2]。禽類中的PRRs也已經(jīng)被鑒定，TLRs途徑是先天免疫系統(tǒng)中最關(guān)鍵、最重要的組分。隨著規(guī)模化禽類養(yǎng)殖的崛起，禽類傳染病的預(yù)防極其重要。因此，禽類TLRs的抗病毒研究越來越受到重視，了解其抗病毒機理，以開發(fā)更有效的抗病毒產(chǎn)品，減少養(yǎng)殖過程中的經(jīng)濟損失，對于禽類傳染病的診斷、預(yù)防、治療具有重要意義。

1 禽類TLRs概述

Anderson K V等[3]在果蠅胚胎背腹極性的研究中首次發(fā)現(xiàn)Toll基因，后期證實Toll在果蠅的先天性免疫中起重要作用。TLR是Ⅰ型跨膜蛋白，包括富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat motifs，LRR)的胞外N末端結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞內(nèi)Toll白細胞介素1受體(TIR)同源結(jié)構(gòu)域，LRR胞外域負責(zé)介導(dǎo)識別PAMP，而TIR則參與下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[4]。TLRs引起轉(zhuǎn)錄因子的活化和先天性抗病毒基因的表達，從而識別相應(yīng)的PAMP，例如Ⅰ型IFN和促炎細胞因子的表達，導(dǎo)致信號級聯(lián)反應(yīng)[5]。

TLRs能介導(dǎo)識別細胞外、細胞內(nèi)內(nèi)吞體和溶酶體中的病原體，并且能識別不同的微生物分子模式，準確判斷“自我”和 “非我”組件。目前，在禽類中發(fā)現(xiàn)10種TLRs，包括TLR2a、TLR2b、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR1La、TLR1Lb、TLR15和TLR21，其中前6種受體在哺乳動物中存在同源序列[6]。禽類與其他的脊椎動物在許多方面都略有不同，禽類缺乏TLR8和TLR9，但有TLR8假基因的存在， TLR1La、TLR1Lb、TLR15和TLR21則是禽類所特有的受體[7]。

2 禽類TLRs的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

TLRs與其合適的配體結(jié)合將啟動一個特定的信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致各種轉(zhuǎn)錄因子的活化和先天免疫應(yīng)答基因的表達。TLRs的初始激活導(dǎo)致一個五銜接蛋白的募集(MyD88、TIRAP/MAL、TICAM-1、TICAM-2和SARM)，不同種TLRs能夠利用多個傳感器。禽類具有抗病毒功能的TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括MyD88依賴型和誘導(dǎo)產(chǎn)生β干擾素含TIR結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)接蛋白(TRIF)依賴型。

2.1 MyD88依賴型

除TLR3以外，所有TLRs受體都能通過銜接分子MyD88發(fā)出信號。在MyD88依賴途徑，MyD88與TLRs的細胞質(zhì)部分結(jié)合，募集IRAK-4(白介素1受體相關(guān)激酶)、IRAK-1和TRAF6(TNF受體相關(guān)因子)，然后IRAK-4磷酸化IRAK-1，TRAF6與磷酸化IRAK1被釋放并激活TAK1(TGF-β活化激酶1)，TAK1進一步磷酸化IκB激酶(IKK)復(fù)合物和絲裂原活化蛋白(MAP)激酶，激活的IKK復(fù)合物導(dǎo)致IκB的降解和NF-κB的活化[7-8]。NF-κB和MAP激酶能誘導(dǎo)基因參與炎癥反應(yīng)，這些基因活化后，產(chǎn)生不同類型的炎性細胞因子和趨化因子反過來直接和塑造獲得性免疫應(yīng)答。

2.2 TRIF依賴型

TLR3信號僅通過TRIF依賴型途徑，利用TIR接頭蛋白誘導(dǎo)IFN-β(TRIF)，TRIF還需募集下游信號所必需的蛋白，包括受體反應(yīng)蛋白1(RIP-1)、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)和TRAF家族成員相關(guān)NF-κB-激活劑(TANK)結(jié)合激酶1(TBK1)[9]。一方面TRIF的N末端募集TRAF6并激活TAK1，再通過IκB激酶復(fù)合物激活NF-κB，另一方面TRIF的C-末端募集RIP來激活NF-κB，通過2種途徑活化的NF-κB轉(zhuǎn)運至細胞核誘導(dǎo)促炎性細胞因子基因的表達，TRIF 還能募集非典型的信號復(fù)合體IKKs、TBK1 和IKKi，TRAF3促進信號復(fù)合物的活化，活化后的復(fù)合物可催化IRF3的磷酸化，產(chǎn)生促炎性因子[10]。

3 禽類TLRs的抗感染作用

TLRs在禽類的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮不可替代的作用，一旦微生物侵入機體，TLRs則通過直接或間接的方式參與機體的防御反應(yīng)，但其內(nèi)在機制尚不清楚。禽類TLRs主要位于細胞表面和細胞質(zhì)中[11]，分布不同，進而執(zhí)行不同的功能。TLR5基因具有多態(tài)性，可能與鳥類傳染病抵抗力或易感性相關(guān)[10,12]。禽類TLR3和7識別雙鏈RNA、單鏈RNA和激活劑Poly(I∶C)；禽類TLR15可識別細菌鞭毛的蛋白組分及酵母來源組分；TLR21能識別微生物DNA和CpG-ODN，與哺乳動物的TLR9功能相似[13]。

3.1 細胞內(nèi)TLRs

研究顯示，雞TLR3可誘導(dǎo)I型IFN表達，反過來IFN-α和IFN-β能夠上調(diào)TLR3表達水平，在雞白細胞和成纖維細胞中呈劑量依賴性[14]。在馬立克病病毒感染的雞胚胎成纖維細胞中，TLR3 mRNA的表達量較未感染細胞顯著提高，同時在TLR3配體刺激時，MDA出現(xiàn)復(fù)制抑制，與此相反，TLR3 siRNA轉(zhuǎn)CEF細胞促進病毒感染和復(fù)制過程[15]。CpG-ODN和Poly(I:C)單獨或一起作用于雞單核細胞，可產(chǎn)生更強的基于輔助性T細胞(Th1)免疫反應(yīng)，包括I型IFN(IFN-α和IFN-β)、Th1細胞因子(IFN-γ和IL-12)和Th2細胞因子(IL-4和IL-10)的上調(diào)[16]。番鴨經(jīng)高致病性禽流感H5N1亞型病毒感染后48 h，TLR3在大腦中的表達顯著上調(diào)并達到最大值，此結(jié)果與雞TLR3類似，H5N1感染后番鴨TLR3在脾和肺的表達量下調(diào)，而雞TLR3的結(jié)果卻是上調(diào)[17]。綜上可知，TLR3在激活劑的輔助作用下可調(diào)節(jié)IFN及Th1/2細胞因子的表達，參與先天性免疫反應(yīng)，提高禽類抗微生物能力，減少養(yǎng)殖過程中的經(jīng)濟損失，同時細胞因子對TLR3也起到負調(diào)反饋調(diào)節(jié)作用，使禽類更好的抵御入侵病原體。

TLR7由漿細胞樣樹突細胞特異性表達，在粒細胞中高表達，病毒感染后，經(jīng)由TLR7/ MyD88依賴性信號傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)NF-κB和MAPK活化，并分泌細胞因子如IFN-α，IL-6和IL-12[18]。新型雛鵝病毒性腸炎病毒感染后初期，TLR7在脾高表達水平，MyD88和其他的抗病毒分子在肺部的表達顯著上調(diào)，這一結(jié)果表明TLR7 及其信號傳導(dǎo)通路相關(guān)分子在病毒感染后參與機體早期抗病毒應(yīng)答反應(yīng)[19]。以上研究表明TLR7可能在病毒感染的早期階段發(fā)揮作用，但在不同細胞內(nèi)引起的干擾素表達水平各不相同，其具體的分子機制還有待于闡明。

研究證實禽類TLR21與哺乳動物TLR9的天然免疫功能類似，是一種與生俱來的能夠識別細菌基因組CpG基序的受體[20]。TLR21在免疫組織中高表達，尤其是法氏囊、哈德氏腺和胸腺，激活劑ODN2006(合成DNA)和NGVEV能顯著性的誘導(dǎo)TLR21的產(chǎn)生，在外周血單核細胞中觀察到大量IL-1β、IL-6和干擾素，ODN2006和NGVEV使鵝TLR21 mRNA轉(zhuǎn)錄物迅速上調(diào)，這導(dǎo)致促炎性細胞因子和抗病毒分子的快速上調(diào)[21]。雞腸道T細胞亞群(CD4+和CD8+T細胞)表達TLR21，此外在法氏囊、脾臟以及成年雞的非淋巴組織(皮膚、小腸、肺、腎、腦和肝臟)大量表達[22]。

3.2 細胞表面TLRs

禽類TLR15通過MyD88依賴性途徑對B和C型寡核苷酸的非甲基化CpG做出免疫反應(yīng)，雞IL-1β被顯著上調(diào)，同時，禽TLR15還參與宿主的抗病毒免疫應(yīng)答。雞感染MDV后28 d，脾臟中TLR15顯著下調(diào)，在感染后的4 d和7 d，法氏囊中TLR3和TLR15分別上調(diào)[23]。另一項研究表明，在感染MDV的溶細胞階段TLR15在脾臟的表達上調(diào)[24]。這些研究為chTLR15在MDV感染的早期階段控制脾臟和法氏囊感染中的關(guān)鍵作用提供了有力證據(jù)。

TLR5 mRNA在微生物接觸的免疫組織中出現(xiàn)高表達，例如脾臟和法氏囊中，這成為TLR5介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)中功能的證據(jù)，同時TLR5 mRNA在組織和黏膜中均高表達，成為保護機體防止病原體入侵的第一道屏障，這種特殊的分布可能使TLR5對病原體入侵做出迅速反應(yīng)[7]。一項研究結(jié)果顯示，鴨TLR5在健康組織中表達，其mRNA在脾中最高程度表達，在氣管、肺、直腸、空腸和法氏囊中較高水平表達；在腺胃、肌胃、十二指腸、回腸、盲腸、肝、胰腺和皮膚中等表達；在心臟、腿部肌肉和腎臟低水平表達[25]。

4 展望

在禽類的不同種屬間，由于配體對TLRs存在選擇壓力，導(dǎo)致宿主-病原體一些相關(guān)分子共同進化，產(chǎn)生不同類型、不同功能的受體，盡管TLRs序列存在同源性，但在其功能、分布以及對病原微生物的響應(yīng)過程還存在很大差異，這可能是長期進化的結(jié)果。TLRs在介導(dǎo)機體天然免疫應(yīng)答中扮演著重要角色，但TLRs介導(dǎo)宿主抗感染的分子機制尚未有明確的解釋，是否存在新型的TLRs，其配體鑒定與疫苗佐劑效應(yīng)與應(yīng)用還有待于進一步研究。隨著TLRs作用的深入研究，有助于揭示宿主如何全方位地識別病原入侵、啟動機體免疫以及最終消除感染的潛力，這對機體抵抗病毒具有重要意義。總之，TLRs種類和功能的多樣性使先天性免疫反應(yīng)系統(tǒng)更加完善，適應(yīng)不斷改變的生存環(huán)境。

[1] Taha-Abdelaziz K,Alkie T N,Hodgins D C,et al.Characterization of host responses induced by Toll-like receptor ligands in chicken cecal tonsil cells[J].Vet Immunol Immunopathol,2016,174:19-25.

[2] Barber G N.STING-dependent cytosolic DNA sensing pathways[J].Trends Immunol,2014,35(2):88-93.

[3] Anderson K V,Jürgens G,Nüsslein-Volhard C.Establishment of dorsal-ventral polarity in theDrosophilaembryo:genetic studies on the role of the Toll gene product[J].Cell,1985,42(3):779-789.

[4] Kawai T,Akira S.The role of pattern-recognition receptors in innate immunity:update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol,2010,11:373-384.

[5] Wang Jinlan,Zhang Zheng,Chang Fen,et al.Bioinformatics analysis of the structural and evolutionary characteristics for toll-like receptor 15[J].Peer J,2016,4:e2079.

[6] Grueber C E,Wallis G P,Jamieson Ian G.Episodic positive selection in the evolution Toll-like receptor innate immunity genes[J].PLoS One,2014,9(3):e89632.

[7] Gupta S K,Bajwa P,Deb R,et al.Flagellin A Toll-like receptor 5 agonist as an adjuvant in chicken vaccines[J].Clin Vac Immunol,2014,21(3):261-270.

[8] Wang X,Wang J,Zheng H D,et al.Differential requirement for the IKKβ/NF-κB signaling module in regulating TLR versus RLR-induced type 1 IFN expression in dendritic cells[J].J Immunol,2014,193(5):2538-2545.

[9] He Y,Xie Z,Dai J,et al.Responses of the Toll-like receptor and melanoma differentiation-associated protein 5 signaling pathways to avian infectious bronchitis virus infection in chicks[J].Virol Sin,2016,31(1):57-68.

[10] Chen Shun,Cheng Anchun,Wang Mingshu.Innate sensing of viruses by pattern recognition receptors in birds[J].Vet Res,2013,44:82.

[11] Brownlie R,Allan B.Avian Toll-like receptors[J].Cell Tissue Res,2011,343:121-130.

[12] Ruan Wenke, An Jian, Wu Yanhua.Polymorphisms of chicken TLR3 and 7 in different breeds[J].PLoS One,2015,10(3):e0119967.

[13] Alizadeh M,Rodriguez-Lecompte J C,Yitbarek,et al.Effect of yeast-derived products on systemic innate immune response of broiler chickens following a lipopolysaccharide challenge[J].Poult Sci,2016, 95(10):2266-2273.

[14] St Paul M,Mallick A I,Read L R,et al.Prophylactic treatment with Toll-like receptor ligands enhances host immunity to avian influenza virus in chickens[J].Vaccine,2012,30:4524-4531.

[15] Hu X,Zou H,Qin A,et al.Activation of Toll-like receptor 3 inhibits Marek's disease virus infection in chicken embryo fibroblast cells[J].Arch Virol,2016,161(3):521-528.

[16] He H,Genovese K J,Swaggerty C L,et al.Costimulation with TLR3 and TLR21 ligands synergistically up-regulates Th1-cytokine IFN-γ and regulatory cytokine IL-10 expression in chicken monocytes[J].Dev Comp Immunol,2012,36:756-760.

[17] Zhang Miaotao, Song Kaijie, Li Chuanfeng,et al.Molecular cloning of Peking duck Toll-like receptor 3 (duTLR3) gene and its responses to reovirus infection[J].Virol J,2015,12:207.

[18] Barjesteh N,Shojadoost B,Brisbin J T,et al.Reduction of avian influenza virus shedding by administration of Toll-like receptor ligands to chickens[J].Vaccine,2015,33(38):4843-4849.

[19] Qi Y,Chen S,Zhao Q,et al.Molecular cloning,tissue distribution,and immune function of goose TLR7[J].Immunol Lett,2015,63(2):135-142.

[20] Keestra A M,de Zoete M R,Bouwman L I,et al.Chicken TLR21 is an innate CpG DNA receptor distinct from mammalian TLR9[J].J Immunol,2010,185:460-467.

[21] Qi Y,Yan B,Chen S,et al.CpG oligodeoxynucleotide-specific goose TLR21 initiates an anti-viral immune response against NGVEV[J].Immunobiology,2016,221(3):454-461.

[22] Brisbin J T,Parvizi P,Sharif S.Differential cytokine expression in T-cell subsets of chicken caecal tonsils co-cultured with three species ofLactobacillus[J].Benef Microbes,2012,3:205-210.

[23] Jie H,Lian L,Qu LJ,et al.Differential expression of Toll-like receptor genes in lymphoid tissues between Marek’s disease virus-infected and non-infected chickens[J].Poult Sci,2013,92:645-654.

[24] Li R,Li N,Zhang J,et al.Expression of immune-related genes of ducks infected with avian pathogenicEscherichiacoli[J].Front Microbiol,2016,7:637.

[25] Cheng Yuqiang, Sun Yingjie, Wang Hengan,et al.Cloning,expression and functional analysis of the duck Toll-like receptor 5 (TLR5) gene[J].J Vet Sci,2015,16(1):37-46.

Progress on Avian Toll-like Receptors

TANG Jing-jie,LIU Yu-fen,WU Di

(CollegeofLifeSicenceandTechnology,HarbinNormalUniversity,Harbin,Heilongjiang,150025,China)

Toll-like receptors(TLRs) belong to pattern recognition receptor family,play an important role in natural immune response.10 avian TLRs have been characterized.After pathogen infection,TLRs are activated and cause a series of anti-virus-related factors to increase,and involve in the host antiviral immune response.This paper described the basic characteristics of birds and antiviral TLRs signal transduction pathway,and analyzed the antimicrobial effect of TLRs in order to lay the foundation for the study of the molecular mechanisms of TLRs.

avian;Toll-like receptor; signal transduction pathway; antiviral effect

2016-06-14

唐敬潔(1991-)，女，黑龍江北安人，碩士研究生，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.43

A

1007-5038(2017)01-0085-04