聶永惠， 李 盼， 劉文涵， 滕淵潔

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 浙江 杭州 310032)

表面增強(qiáng)拉曼光譜研究胞嘧啶在銀膠上的吸附行為

聶永惠， 李 盼， 劉文涵*， 滕淵潔*

(浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 浙江 杭州 310032)

為探討胞嘧啶(Cytosine，Cy)在基底銀表面的吸附特性和規(guī)律，采用表面增強(qiáng)拉曼散射(SERS)光譜對其吸附行為進(jìn)行分析，并結(jié)合量子化學(xué)密度泛函理論(DFT)/B3LYP計(jì)算方法對Cy分子的常規(guī)拉曼光譜(NRS)及Cy與Ag團(tuán)簇吸附的SERS光譜進(jìn)行計(jì)算，與測定結(jié)果進(jìn)行比對且對其拉曼峰進(jìn)行系統(tǒng)指認(rèn)及歸屬，理論計(jì)算結(jié)合實(shí)測值探討了Cy在基底Ag上的增強(qiáng)效應(yīng)和吸附行為?？疾炝薈y分子在Ag納米粒子上的不同吸附時(shí)間、濃度、pH等條件對SERS光譜的影響及優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)pH影響最大，在中性和強(qiáng)堿性條件下的增強(qiáng)效應(yīng)明顯優(yōu)于酸性。Cy分子存在2種不同的異構(gòu)體和3種不同的存在形態(tài)，并隨酸度變化相互轉(zhuǎn)化而達(dá)動(dòng)態(tài)平衡?；贑y在不同pH時(shí)的形態(tài)分布和相應(yīng)的SERS變化規(guī)律，結(jié)合DFT算得的Cy分子中的電荷分布及在銀基底表面的吸附機(jī)制，詳細(xì)探討了酸堿對Cy分子的SRES光譜影響的內(nèi)因和吸附機(jī)理，指出在中性和弱堿性時(shí)，是Cy中的N3和O與Ag形成配位吸附；在pH大于11時(shí)，N與Ag形成配位吸附，而O與Ag形成共價(jià)吸附。

胞嘧啶； 表面增強(qiáng)拉曼光譜； 吸附行為； DFT

1 引 言

拉曼光譜是鑒別和分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要方法之一，具有快速、無損檢測特點(diǎn)。表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)憑借其高探測靈敏度、對分子振動(dòng)具有指紋式分辨的特點(diǎn)，通過分析樣品的拉曼峰位、峰強(qiáng)、線型、線寬及譜線數(shù)目達(dá)到從分子水平對樣品進(jìn)行定性、定量和結(jié)構(gòu)的分析。SERS是研究分子在基底上行為、揭示分子與基底表面的作用機(jī)制和吸附分子在表面取向的有力手段[1-2]。

核酸(DNA)是生物體內(nèi)重要的遺傳物質(zhì)，DNA堿基是揭示這些遺傳信息的鑰匙，其排列組合是生物體遺傳、進(jìn)化、變異的根本原因，因此堿基一直是生物和化學(xué)領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容之一，對堿基分子性質(zhì)的研究有助于研究生物體行為以及生物活性。胞嘧啶作為DNA的基本單元之一，在DNA紫外損傷而導(dǎo)致皮膚和其他疾病的過程中起決定性作用[3]，李敏杰等[4]利用密度泛函理論(DFT)和極化連續(xù)介質(zhì)模型研究了DNA上鳥嘌呤-胞嘧啶(G-C)堿基對氧化損傷的反應(yīng)機(jī)理。近年來，有對DNA及其堿基如胞嘧啶和鳥嘌呤及其他生物分子相互作用[5]拉曼光譜的研究，以及胞嘧啶與金電極相互作用[6-7]的報(bào)道，但未見采用DFT計(jì)算與拉曼光譜及SERS對其吸附行為進(jìn)行深入研究。本文結(jié)合量子力學(xué)的DFT和在不同酸堿下胞嘧啶SERS光譜的變化規(guī)律，著重從分子水平探討胞嘧啶在銀基底表面的吸附本質(zhì)及吸附機(jī)理。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 試劑與儀器

LabRAM HR UV 800激光顯微拉曼光譜儀，購自法國JOBIN YVON公司。激發(fā)光源為632.81 nm He-Ne激光器，激發(fā)功率為17 mW，激光照射在樣品表面的功率為4.57 mW，分辨率為2 cm-1。50倍長焦距物鏡為德國Leica公司產(chǎn)品。

胞嘧啶(>99%)，購自Aldrich試劑公司。Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50 mmol·L-1，pH=7.4。硝酸銀、檸檬酸三鈉(C6H5NaO7·2H2O)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸等試劑均為分析純及以上。實(shí)驗(yàn)用水為18.3 MΩ·cm的超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 銀膠的制備

采用化學(xué)氧化還原法制備銀膠納米顆粒。銀膠的制備參考Lee和Meisel[8]的方法，將其置于粽色廣口瓶中密閉于4 ℃低溫避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩；资褂们靶鑼ζ溥M(jìn)行處理：在離心機(jī)中以1 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，離心后棄上層透明清液，再滴入去離子水，超聲震蕩5 min，使納米粒子重新分散，重復(fù)洗滌2次，再離心棄上層清液，得到濃度較大、純度較高的溶膠[9]。

2.2.2 NRS與SERS測試

拉曼儀器參數(shù)設(shè)置：掃描范圍為200～4 000 cm-1，光譜信號采集時(shí)間為30 s，積分2次平均。用Tris-HCl緩沖液配制濃度為1.0×10-4mol·L-1胞嘧啶溶液作為儲(chǔ)備液。再稀釋成不同濃度梯度的胞嘧啶溶液，以及用0.1 mol·L-1的H2SO4或NaOH調(diào)節(jié)配制不同pH的胞嘧啶溶液。檢測時(shí)，取胞嘧啶溶液與納米銀溶膠基底以體積比1∶1混合，靜置15 min，使銀溶膠基底聚集，并使待測物分子充分吸附分布在納米粒子表面，再進(jìn)行SERS測試。

2.2.3 理論計(jì)算

量化計(jì)算在對結(jié)構(gòu)優(yōu)化和頻率分析中，采用DFT在B3LYP/6-31++G(d, p) (C，H，N)/Lanl2dz(Ag)水平上，分別對胞嘧啶及胞嘧啶與不同數(shù)量Ag原子的團(tuán)簇復(fù)合物進(jìn)行模擬計(jì)算，得到相應(yīng)結(jié)構(gòu)的拉曼光譜和結(jié)構(gòu)圖形，并借此對胞嘧啶的振動(dòng)光譜進(jìn)行歸屬指認(rèn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 銀納米粒子的透射電鏡表征

用透射電子顯微鏡(TEM)對所合成的銀納米粒子進(jìn)行了表征，如圖1所示。從圖中可以直接觀察到納米粒子形狀及粒徑分布。銀納米粒子的形貌以球形及橢圓形為主，平均粒徑為54 nm，其粒徑主要集中分布在40～60 nm范圍內(nèi)。這說明銀納米粒子的粒徑分布比較均一和集中，能夠滿足拉曼增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)對基底均勻性和一致性的要求。

圖1銀納米粒子的TEM圖像

3.2 胞嘧啶分子理論優(yōu)化結(jié)構(gòu)及電荷布局

圖2 胞嘧啶分子結(jié)構(gòu)(a)及依據(jù)B3LYP/6-31++G (d, p)計(jì)算得到的表面靜電勢映射圖(b)

Fig.2 Molecular structure of cytosine(a) and the molecular electrostatic potential mapping of cytosine on surfaces calculated at the B3LYP/6-31++G(d, p) level(b)

3.3 胞嘧啶分子理論光譜的計(jì)算及對比

為明確胞嘧啶的拉曼峰譜歸屬，我們通過密度泛函理論雜化泛函B3LYP計(jì)算得到理論拉曼光譜，并對Cy的Raman光譜圖與實(shí)際測得的NRS、SERS圖譜進(jìn)行對比，如圖3所示?？梢钥闯?，實(shí)測的主要特征峰與理論值基本一致，但某些譜峰也有一定的偏差，這是由于理論計(jì)算本身的誤差所致。

為進(jìn)一步考察Cy分子與Ag原子作用的SERS，我們選擇單個(gè)的Ag、三角形的Ag3及Ag5團(tuán)簇對Ag與Cy組合成的Cy—Ag、Cy—Ag3、Cy—Ag5復(fù)合物進(jìn)行了模擬計(jì)算拉曼光譜，其結(jié)果和振動(dòng)模式的指認(rèn)一并列于表1。整體來看，Cy—Agn(n=1,3,5)復(fù)合物的主要特征峰計(jì)算值較Cy計(jì)算值要更接近于SRES實(shí)測結(jié)果。這是由于Cy與銀團(tuán)簇Agn之間的相互作用會(huì)導(dǎo)致電荷再分配增加了靜態(tài)電子極化[12]，更類似于Ag納米基底的多原子表面，從而更接近于SERS實(shí)測環(huán)境。

圖3 胞嘧啶的拉曼光譜圖：a-Cy理論計(jì)算譜;實(shí)測譜圖：b-NRS;c-SERS。

Fig.3 Raman spectra of cytosine.a:Calculated. b:Experimental NRS.c:Experimental SERS.

3.4 胞嘧啶拉曼振動(dòng)模式指認(rèn)

表1 胞嘧啶的實(shí)測拉曼特征峰與理論計(jì)算值及其歸屬

Tab.1 Comparison of the experimental and theoretical Raman spectra in frequencies (cm-1) and assignments of cytosine cm-1

MeasuredvaluesCalculatedvaluesNRSSERSCyCy—AgCy—Ag3Cy—Ag5Vibrationalassignments251ν(Ag—N[10]),ν(Ag—Cl[11])403430357370383377β(C4—NH2)472396405416410ρ(N1—H)549561544553551554β(N3=C4—C5),β(C2—N1—C6)599600577586590587β(N1—C2—N3),β(C4—C5=C6)793798768773781778Ringbreathing924939955951ω(—NH2),ν(C4—C5),ν(N1—C2)974952960955967964γ(—C6—H),γ(C5—H)110910409889951000999β(C4—C5—C6),β(C2—N3—C4),ω(—NH2)1087110411101108ω(—NH2),β(N1—C2—N3)125111931128113211311130β(N1—H),β(C5—H)1219122711291228β(N1—H),β(C6—H)127713071264126312781272ν(C2—N3),ν(N3—C4),ν(N1—C2)136313551358137613781373γ(C5—H),γ(N1—H),ν(C4—NH2)14311443145914521452β(C2—N3—C4),ν(C4—C5),β(N1—H)146114781507151715221516νs(—NH2),ν(C4—NH2)15391570156815621563τ(N3—C4—C5),γ(N1-H),ν(C2O)15801637166616481648νs(—NH2)165516291691169616891689ν(N3—C4),ν(C5—C6),ν(C2O)16901774178717681772ν(C2—O),γ(—N1—H)312330883212320032243222γ(—N1—H),γ(—C6—H)3235322032463244γ(—C5—H)

Symbols:ν: Stretching vibration;νs: Symmetric stretching vibration;νas: Asymmetric stretching vibration;δ: Scissoring vibration;β:Bending in-plane;γ: Bending out-of-plane;ω: Wagging;ρ:Rocking;τ:Twisting.

3.5 吸附反應(yīng)時(shí)間與SERS的關(guān)系

考察每間隔3 min胞嘧啶溶液在銀表面吸附作用后的SERS信號，其SERS測定結(jié)果如圖4所示。圖5為789，1 307 cm-1峰強(qiáng)度隨吸附反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系圖?？梢钥闯觯?5 min內(nèi)，SERS的峰強(qiáng)隨吸附反應(yīng)時(shí)間的延長而增大，到15 min時(shí)達(dá)到最大，之后趨于平穩(wěn)。這是由于胞嘧啶分子在溶液中遷移擴(kuò)散到銀溶膠表面進(jìn)行吸附需要時(shí)間，隨著吸附分子的增加，SERS增強(qiáng)，在一定時(shí)間后達(dá)到吸附脫附的動(dòng)態(tài)平衡；另一方面，與待測溶液混合后的納米銀粒子會(huì)隨時(shí)間的延長而聚集，使SERS信號增強(qiáng)。可見，應(yīng)該在吸附反應(yīng)時(shí)間15 min后再進(jìn)行檢測。

圖4 胞嘧啶與納米銀膠混合后不同吸附時(shí)間的SERS光譜圖(C(Cy)=1×10-4mol·L-1，pH=7.46)。(a)0 min;(b)3 min;(c)6 min;(d) 9 min;(e)12 min;(f)15 min;(g)18 min.

Fig.4 SERS spectra of mixture system of cytosine with silver colloid at different mixed time.(a) 0 min. (b) 3 min. (c) 6 min. (d) 9 min. (e) 12 min. (f) 15 min. (g) 18 min.

圖5 胞嘧啶SERS峰強(qiáng)與吸附時(shí)間的關(guān)系

Fig.5 Peak intensity of 798 cm-1and 1 307 cm-1vs. adsorption time

3.6 不同胞嘧啶濃度與SERS的關(guān)系

圖6 不同胞嘧啶溶液濃度的SERS光譜(pH=7.46，t=15 min)

Fig.6 SERS spectra of cytosine with different concentrations

圖7 胞嘧啶的798，1 307，1 629 cm-1特征峰強(qiáng)與濃度的關(guān)系。

Fig.7 SERS peak intensity of 798，1 307，1 629 cm-1vs. concentration of cytosine.

3.7 不同溶液的pH值對胞嘧啶SERS的影響

為考察溶液酸度對胞嘧啶分子SERS的影響，測定了濃度為1×10-4mol·L-1時(shí)的不同pH值下的SERS光譜，如圖8所示?？梢钥闯?，隨著pH值的變化，峰強(qiáng)度發(fā)生了明顯的改變，在pH=6.00～12.00的范圍內(nèi)，561，600，798，1 040，1 193 cm-1等特征峰的相對強(qiáng)度明顯增大，而1 307，1 431，1 629，3 088 cm-1這4個(gè)峰則先增強(qiáng)后下降。圖9為胞嘧啶的798，1 040，1 193，1 307，1 431，3 088 cm-1等特征峰強(qiáng)度與不同pH值的關(guān)系圖。

圖8 不同pH值時(shí)的胞嘧啶分子的SERS光譜(1×10-4mol·L-1)

Fig.8 SERS spectra of cytosine at different pH (1×10-4mol·L-1)

從圖9可以看出，隨著pH值的改變，SERS信號基本呈3段變化：pH=6以下基本為弱信號，pH=6～11為隨pH增加而上升階段，pH>11為達(dá)到最大值后的逐漸減弱階段。值得探討的是1 307，1 431，3 088 cm-1峰信號(圖9 b，e，f)的特殊走勢，這幾個(gè)峰隨著pH的增加先揚(yáng)后抑，與其他鍵的拉曼信號的增強(qiáng)形成了鮮明的對比。

圖9 胞嘧啶798，1 040，1 193，1 307，1 431，3 088 cm-1特征峰強(qiáng)與pH的關(guān)系。

Fig.9 SERS peak intensity of 798，1 040，1 193，1 307，1 431， 3 088 cm-1vs. pH value.

3.8 Cy在不同pH值下的存在形式及與SERS的關(guān)系

圖10 胞嘧啶分子在溶液中隨pH變化的形態(tài)轉(zhuǎn)變

Fig.10 Morphological changes of cytosine molecules in different pH solution

Cy的酸堿解離常數(shù)pKa1和pKa2為4.60和12.16[15]，設(shè)溶液中Cy分子3種結(jié)構(gòu)形態(tài)的總濃度為1，可以得到Cy在不同pH時(shí)的形態(tài)分布[16](圖11)。從圖11中可以看出，在pH<3.6時(shí)，胞嘧啶主要以Cy+存在(δA>90%)；酸性減弱(pH增加)時(shí)，Cy+開始失去H+向Cy±的形式轉(zhuǎn)化，在pH為4.6時(shí)，Cy+與Cy±均占50%；隨著pH值的繼續(xù)升高，在5.6～11.1的范圍內(nèi)，溶液主要以Cy±態(tài)存在(δB+δB′>90%)；pH>11.1后，Cy±逐漸向Cy-轉(zhuǎn)變，δC所占比例逐漸增大。

圖11 胞嘧啶分子在不同pH下的形態(tài)分布圖

結(jié)合圖9、10、11，考察不同pH值下的Cy分子結(jié)構(gòu)及SERS信號的變化。SERS強(qiáng)度變化呈3個(gè)不同的階段，與不同pH條件下胞嘧啶形態(tài)變化相對應(yīng)。在酸性較強(qiáng)條件下(pH<6.75)，隨酸性的增強(qiáng)，胞嘧啶分子的SERS信號逐漸消失。在pH=6.10～11.04的范圍內(nèi)，Cy分子主要以中性Cy±存在，798，1 040，1 193 cm-1等峰呈逐漸增強(qiáng)的正趨勢。在pH>11.04后，798，1 040，1 193 cm-1峰強(qiáng)反而有略微下降趨勢。這些現(xiàn)象表明溶液pH的改變與Cy分子結(jié)構(gòu)的改變以及SERS拉曼光譜的變化呈一定的相關(guān)性。

3.9 Cy在Ag表面吸附機(jī)理的探討

圖12 胞嘧啶分子在納米銀溶膠上的吸附示意圖。(a) 中性條件下；(b)堿性條件下。

Fig.12 Schematic diagram of adsorption of cytosine adsorption on Ag nanoparticle. (a) Neutral condition. (b) Alkaline condition.

4 結(jié) 論

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聶永惠(1992-)，男，湖南漣源人，碩士研究生，2014年于北方民族大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位,主要從事儀器分析、表面增強(qiáng)拉曼光譜的痕量分析和量子化學(xué)計(jì)算方面的研究。

E-mail: nieyonghui@zjut.edu.cn滕淵潔(1983-)，女，浙江臺(tái)州人，博士，講師，2011年于華東理工大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事表面增強(qiáng)拉曼光譜的痕量分析、電化學(xué)-表面增強(qiáng)拉曼光譜聯(lián)用表面分析、光電小型快速檢測分析方面的研究。

E-mail: yuanjieteng@zjut.edu.cn劉文涵(1956-)，男，江蘇無錫人，教授，1986年于杭州大學(xué)(今浙江大學(xué))獲得碩士學(xué)位，主要從事儀器分析、原子分子光譜分析、激光拉曼光譜、電化學(xué)分析測試及在線聯(lián)用檢測等的研究。

E-mail: liuwh@zjut.edu.cn

Adsorption Behavior of Cytosine on Silver Colloid Investigated by Surface Enhanced Raman Scattering

NIE Yong-hui, LI Pan, LIU Wen-han*, TENG Yuan-jie*

(StateKeyLaboratoryBreedingBaseofGreenChemistry-SynthesisTechnology,CollegeofChemicalEngineering,ZhejiangUniversityofTechnology,Hangzhou310032,China)*CorrespondingAuthors,E-mail:liuwh@zjut.edu.cn;yuanjieteng@zjut.edu.cn

The adsorption characteristics and regularity of cytosine (Cy) on the silver substrate surface were analyzed by the means of surface enhanced Raman scattering (SERS) combing with quantum chemistry density functional theory (DFT). The normal Raman spectrum (NRS) of Cy and Cy—Agncomplex (n=1, 3, 5) SERS spectra were calculated by DFT/B3LYP method, which were further compared with the measured results to identify and assign the spectral peaks. The SERS spectra of Cy molecules on silver colloid nanoparticles were recorded at different adsorption time, concentration and pH. The results show that pH value has the greatest influence on its SERS signal, especially at neutral and strong alkaline conditions. It is inferred that there are two different isomers of Cy molecules and three kinds of existing forms, and all of them keep dynamic balance in the solution. The adsorption mechanism of Cy on the surface of silver substrate was further discussed in detail based on the morphological distribution of Cy at different pH by their corresponding SERS changes combining with the DFT calculation of charge distribution in Cy molecules. In conclusion, the N3and O in Cy are coordinated to Ag at the neutral and weakly alkaline conditions. N and Ag form coordinated adsorption and O and Ag form covalent adsorption, when the pH is greater than 11.

cytosine; surface-enhanced Raman scattering; adsorption behavior; DFT

2016-10-27；

2017-01-23

浙江省自然科學(xué)基金(LQ17B050002)； 浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究(分析測試)計(jì)劃(2015C37068)資助項(xiàng)目 Supported by Natural Science Foundation of Zhejiang Province(LQ17B050002); Analysis and Measurement Foundation of Zhejiang Province(2015C37068)

1000-7032(2017)04-0543-09

O657

A

10.3788/fgxb20173804.0543