何亮偉，耿 婷，李艷靜，黃文哲，王振中，齊煉文，蕭 偉#（.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港00；.中國藥科大學中藥學院，南京 98）

谷胱甘肽反應(yīng)性代謝物引起藥物性肝損傷的機制研究進展Δ

何亮偉1，2＊，耿 婷1，李艷靜1，黃文哲1，王振中1，齊煉文2，蕭 偉1#（1.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇連云港222001；2.中國藥科大學中藥學院，南京 211198）

目的：了解以谷胱甘肽捕獲反應(yīng)性代謝物研究藥物肝損傷的機制，為臨床安全、合理用藥提供一定的理論依據(jù)。方法：以“谷胱甘肽”“反應(yīng)性代謝物”“藥物性肝損傷”“Reactive metabolites”“Glutathione conjugate”“Liver injury”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1993年1月－2016年4月在PubMed、ScienceDirect、Web of Science、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻，對引起藥物性肝損傷的可能機制、化學藥物和中藥的肝損傷研究、谷胱甘肽反應(yīng)性代謝物的檢測及其研究實例等方面進行綜述。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻112篇，其中有效文獻37篇。引起藥物性肝損傷由基于細胞色素P450酶代謝、鈣離子平衡破壞與細胞膜損傷、膽汁淤積與膽小管受損、自身免疫激活、線粒體功能障礙導致肝細胞凋亡等多種因素造成。對乙酰氨基酚、小檗胺、莫沙必利、去甲阿佐昔芬等單一成分的化學藥物經(jīng)肝臟代謝后可產(chǎn)生反應(yīng)性代謝物，引起肝臟的毒副作用。溴芬酸、乙溴替丁、氯丙嗪、他克林、曲格列酮、曲伐沙星等化學藥物因?qū)е赂螕p傷而最終撤市。有100多種中草藥和30多種中成藥可引起藥源性肝損傷。馬兜鈴酸、吡咯里西啶類生物堿、異喹啉類生物堿等藥用植物來源單體成分的毒性已被認為與其生成反應(yīng)性代謝物有關(guān)。還原型谷胱甘肽作為捕獲劑，與多種反應(yīng)性代謝物（Michael受體、環(huán)氧化物、芳烴環(huán)氧化物、鹵代烴等）形成的復(fù)合物可由質(zhì)譜在正離子模式下以中性丟失掃描質(zhì)荷比（m/z）為129及負離子模式下以前體離子掃描m/z為272檢出。反應(yīng)性代謝物導致體內(nèi)毒性的經(jīng)典例子除對乙酰氨基酚的肝毒性外，還有蝙蝠葛堿、綠原酸和奧美拉唑。結(jié)論：藥物代謝酶介導的谷胱甘肽反應(yīng)性代謝物的生成是引起藥物性肝損傷的重要原因之一，對其進行有效地監(jiān)測可在一定程度上避免藥品不良反應(yīng)的發(fā)生，有助于在臨床上制訂合理用藥方案、對肝損傷進行早期檢測預(yù)警。

谷胱甘肽；反應(yīng)性代謝物；藥物性肝損傷

藥物性肝損傷是指藥物本身的作用、藥物的相互作用及藥物代謝物的作用引起肝毒性或功能損害，進而引起各種臨床異常癥狀，臨床表現(xiàn)為肝功能異常、肝硬化，最終可能導致肝性死亡[1-2]。抗生素類藥物、抗結(jié)核藥物、心血管藥物、消化道用藥、抗真菌藥物、抗癲癇藥物、抗腫瘤藥物以及一些中藥如補骨脂、首烏片、馬錢子等，都會引起肝輕度或重度損害[3]。臨床藥物的不良反應(yīng)中有10%～15%為肝損傷，老年人更高達20%以上[4]。

由于藥物性肝損傷的臨床表現(xiàn)和病理變化較為復(fù)雜，傳統(tǒng)的臨床生化指標不足以揭示其發(fā)病機制。近年來，基因組學、蛋白質(zhì)組學、代謝組學等系統(tǒng)生物學技術(shù)逐漸被運用到藥物性肝損傷的研究中。如Kiyosawa N等[5]運用代謝組學技術(shù)，以谷胱甘肽（GSH）生物標記物評價化學品誘導的GSH耗竭在肝中的潛在風險。筆者以“谷胱甘肽”“反應(yīng)性代謝物”“藥物性肝損傷”“Reactive metabolites”“Glutathione conjugate”“Liver injury”等為關(guān)鍵詞，組合查詢1993年1月－2016年4月在PubMed、ScienceDirect、Web of Science、中國知網(wǎng)、萬方、維普等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻112篇，其中有效文獻37篇?，F(xiàn)對引起藥物性肝損傷的可能機制、化學藥物和中藥的肝損傷研究、GSH反應(yīng)性代謝物的檢測及其研究實例等方面進行綜述，以期為臨床安全、合理用藥提供一定的理論依據(jù)。

1 引起藥物性肝損傷的可能機制

1.1 細胞色素P450（CYP）代謝引起的藥物性肝損傷

肝中富含各種藥物代謝酶，是人體最重要的代謝器官。CYP是肝細胞中最主要的代謝酶，負責對絕大多數(shù)藥物的代謝。藥物口服后由小腸吸收經(jīng)門靜脈入肝，在肝CYP的作用下發(fā)生一系列生物轉(zhuǎn)化，使得大部分代謝產(chǎn)物的極性增加、水溶性提高、藥理活性減弱、易于被排泄。酶的生物催化涉及底物-酶復(fù)合物的形成、復(fù)雜中間體的生成、代謝產(chǎn)物的形成和釋放。對某些化合物而言，他們經(jīng)CYP代謝可產(chǎn)生親電子基、自由基等活性代謝產(chǎn)物。而肝中含有豐富的GSH，具有保護細胞和解毒的作用，是體內(nèi)反應(yīng)性代謝物的天然清除劑，對氧自由基、有機氫過氧化物、親電子基團等的滅活起著重要的作用[6]，同時不會產(chǎn)生肝損傷。但過量服藥或遺傳性藥物代謝異常時，親電子基團、自由基等活性代謝產(chǎn)物大量生成，耗竭了肝內(nèi)的GSH，并且通過與細胞膜磷脂質(zhì)的不飽和脂肪酸結(jié)合發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成膜的損害、鈣（Ca2+）-三磷酸腺苷（ATP）的自穩(wěn)定性受到破壞，使線粒體損傷、肝細胞壞死；同時，親電子基團還可通過與肝細胞蛋白半胱氨酸殘基的巰基、賴氨酸殘基的氨基等親核基團共價結(jié)合，使肌動蛋白凝聚而破壞細胞骨架，使細胞膜失去其化學及生理特性而導致細胞壞死。

1.2 鈣離子平衡破壞和細胞膜損傷引起的藥物性肝損傷

細胞的許多重要生理活動都與細胞內(nèi)的Ca2+的濃度緊密相關(guān)[7]。維持細胞內(nèi)離子濃度平衡是由許多消耗能量的過程維持的，包括Ca2+-ATP酶和鎂（Mg2+）-ATP酶。藥物可與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)共價結(jié)合或造成脂質(zhì)過氧化，破壞細胞膜的完整性和膜的Ca2+-ATP酶系，使細胞膜內(nèi)外的Ca2+穩(wěn)態(tài)被破壞，最終造成肝細胞的死亡。

1.3 膽汁淤積與膽小管受損引起的藥物性肝損傷

膽汁的形成與分泌是一個復(fù)雜的生理過程，其主要成分的分泌主要受一系列ATP-依賴性輸出泵的控制。藥物影響膽汁分泌主要有包膜運載膽鹽的受體、細胞膜的流動性、鈉（Na+）-鉀（K+）-ATP酶活性、離子交換、細胞骨架和細胞質(zhì)膜完整性的改變等環(huán)節(jié)。藥物與小管轉(zhuǎn)運分子相結(jié)合，從而導致小管系統(tǒng)管腔內(nèi)膽汁的形成或流動障礙[8]。研究表明，雌激素和避孕藥物可改變肝細胞內(nèi)的膽固醇代謝而引起膽汁淤積。

1.4 自身免疫激活引起的藥物性肝損傷

多數(shù)藥物的分子量較小，一般只具有反應(yīng)性而不具備抗原性，很少直接刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但某些特異質(zhì)的半抗原與肝細胞內(nèi)的特異性蛋白結(jié)合后可成為抗原。雙醋酚汀引起狼瘡樣肝炎時，大量免疫復(fù)合物沉積可能造成嚴重的肝炎[7]。從某些藥物性肝損傷患者體內(nèi)可檢測到自身抗體，例如替尼酸性肝炎的患者體內(nèi)檢測到CYP2C9的肝腎微粒體抗體。藥物通過產(chǎn)生特異性抗體激發(fā)體液免疫，也可通過對細胞的毒性作用產(chǎn)生細胞免疫，這兩種方式可導致肝損傷。

1.5 線粒體功能障礙導致肝細胞凋亡引起的藥物性肝損傷

線粒體膜有多種離子通道來介導離子轉(zhuǎn)運，離子通道的調(diào)節(jié)可能影響線粒體甚至細胞的功能。多種藥物的作用靶點位于線粒體膜或線粒體內(nèi)酶復(fù)合物，通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸鏈功能、代謝酶的活性、膜通透性來發(fā)揮其藥理作用[9]。線粒體功能障礙引起線粒體膜的通透性發(fā)生改變，從而造成肝細胞凋亡[10]。例如，格列本脲藥物能與線粒體膜上的K+通道結(jié)合，致使細胞膜的通透性降低。另外，二芳基硫脲類藥物以線粒體的呼吸鏈為靶點，通過氧化磷酸化解偶聯(lián)亦可誘發(fā)肝細胞凋亡，從而引起藥物性肝損傷。

2 化學藥物的肝損傷研究

某些單一成分的化學藥物，如對乙酰氨基酚[7]、小檗胺[11]、莫沙必利[12]、去甲阿佐昔芬[13]等，經(jīng)肝代謝后可產(chǎn)生反應(yīng)性代謝物，引起肝損傷。已有不少藥物因?qū)е赂螕p傷和肝死亡而被美國FDA從市場上撤回或限制使用，如溴芬酸、乙溴替丁、氯丙嗪、他克林[14-16]、曲格列酮、曲伐沙星[17]等。

3 中藥的肝損傷研究

中藥是富含各種化學單體的復(fù)雜混合物，這一混合體系在體內(nèi)發(fā)揮藥效時既有各單體成分間彼此相對獨立的藥學基礎(chǔ)，同時又存在極為復(fù)雜的相互作用。因此，與結(jié)構(gòu)單一、藥效及毒性均比較明確的化學藥物比較，中藥的藥效及不良反應(yīng)受到藥材產(chǎn)地、炮制、生產(chǎn)工藝、飲食等更多因素的影響。正是由于中藥多組分的復(fù)雜性，對中藥的合理應(yīng)用必須建立在對中藥的藥效、毒性深入了解的基礎(chǔ)上。

約有100多種中草藥和30多種中成藥可引起藥源性肝損傷[18]。何首烏致肝損傷的臨床表現(xiàn)為膽汁淤積，馬致潔[19]以何首烏致肝損傷大鼠模型來研究大鼠血清和膽汁中重要膽汁酸的變化規(guī)律。中藥黃藥子常用于治療甲狀腺功能亢進癥、甲狀腺瘤、多發(fā)性纖維瘤等疾病，其導致的肝毒性有類似病毒性肝炎的癥狀，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、厭油膩、尿黃、肝功能異常[20]。單味中藥致肝損傷的報道較多，復(fù)方中藥制劑的肝毒性亦有報道。中藥復(fù)方制劑引起的肝損傷以壯骨關(guān)節(jié)丸報道居多[21]，其引起肝損害的發(fā)病率較高，主要不良反應(yīng)為皮膚瘙癢、大便灰白和黃疸。

一些藥用植物來源的單體，如馬兜鈴酸、吡咯里西啶類生物堿、異喹啉類生物堿等的毒性已被認為與其生成反應(yīng)性代謝物有關(guān)[22]。部分常用中藥有明確報道的肝毒性，如補骨脂[23]、柴胡[24]、蒼耳子[25]、梔子[26]等。盡管大多數(shù)中藥引起的肝損傷較輕微或無明顯癥狀，但嚴重、致命的藥物性肝損傷也不少見[27]。

4 GSH反應(yīng)性代謝物的檢測

4.1 GSH反應(yīng)性代謝物的裂解特征

GSH是由1分子谷氨酸、1分子半胱氨酸和1分子甘氨酸形成的內(nèi)源性三肽，分子量為307，幾乎存在于所有哺乳動物的體內(nèi)，是體內(nèi)的天然抗氧化劑和解毒劑。GSH作為捕獲劑，與多種反應(yīng)性代謝物（如Michael受體、環(huán)氧化物、芳烴環(huán)氧化物、鹵代烴等）形成的復(fù)合物可由質(zhì)譜在正離子模式下以中性丟失掃描質(zhì)荷比（m/z）為129及負離子模式下以前體離子掃描m/z為272檢出[22]。

Xie C、Dieckhaus CM等[28-29]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測手段對GSH反應(yīng)性代謝物的裂解特征進行了系統(tǒng)描述。Ma S等[30]探討了GSH在正離子模式下的碎片離子和質(zhì)荷比及其裂解途徑。Dieckhaus CM等[29]研究了GSH在負離子模式下的裂解過程。

4.2 GSH反應(yīng)性代謝物的檢測方法

目前對GSH反應(yīng)性代謝物的檢測主要依靠質(zhì)譜檢測。經(jīng)碰撞誘導解離（CID）后，GSH反應(yīng)性代謝物在質(zhì)譜中的CID譜與肽類結(jié)構(gòu)的CID譜相似，故其碎片主要來自三肽骨架。盡管不同類型的碎片離子的相對豐度有時依賴于結(jié)合物質(zhì)的性質(zhì)，但加合物一般會呈現(xiàn)出129 Da中性丟失（焦谷氨酸）。因此，與空白對照樣品比較，通過檢測129 Da中性丟失可迅速鑒別出谷胱甘肽加合物。但單純的129 Da中性丟失掃描假陽性率較高[29]。為克服這一不足，研究者發(fā)展出了多種新的檢測方法，如將等摩爾比值的GSH和C/N標記的GSH（用穩(wěn)定同位素標記于甘氨酸上）與還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）-肝微粒體共同孵育。用MS檢測時，在同一保留時間觀察到中性丟失75 Da（甘氨酸）及78 Da（C/N標記甘氨酸）的等強雙峰以及中性丟失129 Da的特征峰[31]。而此方法在實驗中易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，無法完全準確說明GSH反應(yīng)性代謝物的生成。

生物基質(zhì)在進行MS檢測時也可發(fā)生中性丟失129 Da的內(nèi)源性化合物，但內(nèi)源性雜質(zhì)中性丟失的基團具有與焦谷氨酸同樣的元素組成的可能性不大，故精確分子量中性丟失可大大降低假陽性可能[32]。將負離子條件下的前體離子掃描和正離子條件下的中性丟失掃描兩種方式相結(jié)合，可使對反應(yīng)性代謝物的初篩結(jié)果更加準確、可靠。

不同類型的GSH加合物的CID譜存在一定的差異，即并不是所有的加合物都以中性丟失129 Da為主要裂解途徑。如脂肪硫醚-谷胱甘肽加合物主要裂解途徑為中性丟失307 Da（GSH）。為克服這一缺陷，有必要開發(fā)出通用性更強的方法來檢測一系列結(jié)構(gòu)迥異的谷胱甘肽加合物。負離子模式下對GSH加合物進行m/z為272的前體離子掃描有望達到這一目的。Ma S等[30]研究表明，谷胱甘肽和谷胱甘肽加合物的負離子模式下CID譜中，均呈現(xiàn)出高豐度的m/z為272的碎片（GSH脫去HS后在負離子檢測模式下失去1個質(zhì)子），可以此作為GSH加合物的特征進行檢測。實踐證明，大量GSH加合物均可在負離子模式下通過對m/z為272的碎片進行前體離子掃描而被檢出，且假陽性結(jié)果要顯著少于正離子模式下對GSH加合物進行的中性丟失129 Da掃描。然而，負離子模式檢測條件下，GSH結(jié)合物的二級質(zhì)譜中的CID碎片信息完全來自于GSH的三肽結(jié)構(gòu)，故該方法單獨使用無法獲得GSH加合物的結(jié)構(gòu)信息。

為克服負離子模式對m/z為272的碎片進行前體離子掃描無法獲得GSH加合物結(jié)構(gòu)信息的不足，在四級桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（Q-Trap）中首先對m/z為272的碎片進行前體離子掃描，以明確捕獲GSH加合物的生成，同時測得加合物的分子量；隨后迅速進行離子源極性切換，在正離子模式下進行增強的產(chǎn)物離子（EPI）掃描，從而依據(jù)獲得的GSH加合物的碎片信息推測GSH加合物的結(jié)構(gòu)[33]。該方法既具有負離子模式下前體離子掃描對于GSH加合物定性檢測高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢，也具有正離子模式下EPI掃描碎片信息豐富的優(yōu)勢，使得快速篩查GSH加合物并闡明其結(jié)構(gòu)成為可能。

5 GSH反應(yīng)性代謝物的研究實例

反應(yīng)性代謝物導致體內(nèi)毒性的一個經(jīng)典例子是對乙酰氨基酚的肝毒性[27]。對乙酰氨基酚主要經(jīng)肝代謝，主要代謝物為無毒、無活性的葡萄糖醛酸結(jié)合物（約60%）及硫酸結(jié)合物（約30%）。此外，約5%～9%的對乙酰氨基酚經(jīng)CYP2E1、CYP1A2、CYP3A4代謝為具有反應(yīng)性的N-乙酰苯亞胺醌（NAPQI）。在正常情況下，NAPQI迅速與體內(nèi)GSH結(jié)合成水溶性無毒加合物后，由尿排出，如圖1所示。而大量服用對乙酰氨基酚，會導致體內(nèi)GSH耗竭，從而使得NAPQI轉(zhuǎn)而與肝細胞內(nèi)蛋白的巰基殘基（主要為半胱氨酸）結(jié)合，可致肝細胞損害、壞死，嚴重者可致肝腎衰竭、肝性腦病、腦水腫、低血糖、低血壓，甚至死亡。

圖1 對乙酰氨基酚的主要代謝途徑

蝙蝠葛堿為一種雙芐基四氫異喹啉類生物堿，含有亞甲基苯酚結(jié)構(gòu)。Wang Y等[34]以LC-MS/MS法檢測蝙蝠葛堿在人肝微粒體孵化液和SD大鼠膽汁中的反應(yīng)性代謝物時發(fā)現(xiàn)，在人肝微粒體孵化液中共檢測到4種GSH加合物，在SD大鼠膽汁中共檢測到3種GSH加合物。為了確定結(jié)構(gòu)，選擇性地進行多級全掃描質(zhì)譜分析，各代謝物產(chǎn)生的主要中性丟失均為129 Da（焦谷氨酸）、273 Da（GSH-H2S）和307 Da（GSH）。通過與化學合成的對照品比對，最終確定其分別為1個原型蝙蝠葛堿GSH加合物、2個2-N-去甲基蝙蝠葛堿GSH加合物以及1個N-去甲基-O-去甲基蝙蝠葛堿GSH加合物，GSH均結(jié)合在17位C上。上述結(jié)果表明，蝙蝠葛堿的生物活化途徑主要是經(jīng)過代謝酶氧化生成對亞甲基醌型反應(yīng)性代謝中間體[34]。

綠原酸為雙黃連、清開靈、脈絡(luò)寧等多種中藥注射劑的主要成分之一。SD大鼠靜脈注射綠原酸后在其膽汁中檢測到了多種GSH加合物，如O-甲基綠原酸的GSH加合物和綠原酸水解產(chǎn)物咖啡酸的GSH加合物。此外，在其膽汁及糞便中還檢測到了GSH加合物的次級降解產(chǎn)物O-甲基綠原酸半胱氨酰甘氨酸結(jié)合物和O-甲基綠原酸半胱氨酸結(jié)合物[35]。上述結(jié)果表明，綠原酸的烯酮雙鍵具有很強的親電性，易發(fā)生Michael加成反應(yīng)，可能與蛋白的巰基共價結(jié)合導致過敏性不良反應(yīng)。

奧美拉唑主要應(yīng)用于十二指腸潰瘍和卓艾綜合征，也可應(yīng)用于胃潰瘍和反流性食管炎。項迎春等[36]對奧美拉唑致不良反應(yīng)96例的文獻分析發(fā)現(xiàn)，有部分患者出現(xiàn)肝功能異常、肝炎等癥狀，血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶與膽紅素升高。正常情況下奧美拉唑通過肝細胞中CYP同工酶，一般經(jīng)CYP2C19代謝生成5′-羥基奧美拉唑或經(jīng)CYP3A4代謝生成奧美拉唑砜[31]；也可在不需要CYP酶的催化下與肝內(nèi)GSH發(fā)生反應(yīng)，形成易于排泄的反應(yīng)性代謝物，當超過一定的劑量耗竭體內(nèi)的GSH時，就會造成肝損傷。

6 結(jié)語

當前，被篩選化合物生成反應(yīng)性代謝物能力的評估在藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展階段中越來越受重視[37]。LC-MS/MS已成為檢測和鑒定反應(yīng)性代謝物的重要方法，其在未來反應(yīng)性代謝物捕獲的發(fā)展方向上應(yīng)兼顧通用性、定量性、靈敏性、準確性4個方面。

由于不同GSH加合物的MS響應(yīng)區(qū)別較大，在LCMS/MS定性鑒別的同時量化比較不同受試物形成反應(yīng)性代謝物的能力存在一定困難。一般是通過化學合成GSH加合物的對照品，或采用放射性標記GSH作為捕獲劑。但是，一方面反應(yīng)性代謝物篩查是在早期的藥物發(fā)展階段進行，而化學合成對照品或標記化合物制備周期長且難度大，不能滿足高通量的要求；另一方面，放射性標記GSH的價格較高，對場地、儀器要求均較高，且檢測靈敏度不高。目前一些新型的捕獲試劑，如熒光基團標記丹磺酰GSH和季銨型GSH，已被嘗試用于反應(yīng)性代謝物的定量和半定量研究。超低流速的納升噴霧技術(shù)可大致按等摩爾比將代謝物的質(zhì)譜響應(yīng)歸一化，從而初步實現(xiàn)對代謝物的定量分析，但此方法尚未被廣泛普及。

盡早進行被篩選化合物的反應(yīng)性代謝物研究，鑒定易代謝活化的位點，有助于設(shè)計新的候選藥物、降低藥物毒性、提高藥物開發(fā)的成功率。目前，GSH反應(yīng)性代謝物的篩選多是針對化學藥物，關(guān)于中藥研究的報道甚少。對中藥而言，從分子水平闡明其導致肝損傷的機制無疑對指導臨床合理用藥、減少中藥臨床不良反應(yīng)意義非凡。

隨著對反應(yīng)性代謝物研究重要性的認識及對中藥復(fù)雜組分中反應(yīng)性代謝物檢測方法的進步和普及，反應(yīng)性代謝物研究有望被引入到中藥工藝及處方篩選中，與藥理、毒理、藥動學篩查相結(jié)合，從現(xiàn)代化科學的角度闡明配伍及不同工藝增效減毒的化學基礎(chǔ)，從而遴選出最優(yōu)工藝進行大生產(chǎn)。

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2016-07-11

2016-12-28）

（編輯：余慶華）

江蘇省科學技術(shù)廳科技項目（No.BK20130403）

＊碩士研究生。研究方向：藥動學。電話：025-86587935。E-mail：heliangwei156@163.com

#通信作者：研究員級高級工程師，博士。研究方向：中藥新藥的研究與開發(fā)。電話：025-86587935。E-mail：kanionlunwen@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.36