陳衛(wèi)衛(wèi)，梁 迪，趙其秀，羅 毅，劉靈杰，莫麗萍，黃俊善，李海濤，3#（.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧53000；.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 003；3.江蘇銀杏研究院，江蘇邳州 300）

銀杏葉聚戊烯醇對Aβ25-35誘導dPC12細胞損傷的保護作用研究Δ

陳衛(wèi)衛(wèi)1，2，3＊，梁 迪1，趙其秀2，羅 毅1，劉靈杰1，莫麗萍1，黃俊善1，李海濤2，3#（1.廣西中醫(yī)藥大學藥學院，南寧530001；2.南京中醫(yī)藥大學藥學院，南京 210023；3.江蘇銀杏研究院，江蘇邳州 221300）

目的：研究銀杏葉聚戊烯醇（GP）對β淀粉樣肽25-35（Aβ25-35）誘導dPC12細胞損傷的保護作用，為其用于阿爾茨海默?。ˋD）的治療提供參考。方法：以神經(jīng)生長因子（NGF）誘導PC12細胞分化為具有神經(jīng)活性的dPC12細胞后，將dPC12細胞分為正常對照組（DMSO培養(yǎng)基）、Aβ25-35處理組（DMSO培養(yǎng)基）和GP試驗組（分別含25、50、100、200、400μg/mL GP的DMSO培養(yǎng)基），培養(yǎng)24 h后，Aβ25-35處理組和GP試驗組細胞均加入25 μmol/LAβ25-35誘導細胞損傷（即復制AD細胞模型），24 h后采用MTT法測定細胞存活率。另取細胞分為正常對照組（DMSO培養(yǎng)基）、Aβ25-35處理組（DMSO培養(yǎng)基）和GP試驗組（分別含25、50、100、200 μg/mL GP的DMSO培養(yǎng)基），同法處理后檢測細胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶（LDH）、活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）水平。結(jié)果：與Aβ25-35處理組比較，50、100、200、400μg/mL GP試驗組dPC12細胞的存活率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），100、200μg/mL GP試驗組細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS和MDA水平以及50μg/mL GP試驗組細胞培養(yǎng)液中ROS水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈一定的濃度依賴性。結(jié)論：GP對Aβ25-35致dPC12損傷有一定的保護作用，為一種潛在的AD治療藥物。

銀杏葉；聚戊烯醇；β淀粉樣肽25-35；dPC12細胞；乳酸脫氫酶；活性氧；丙二醛

銀杏葉為銀杏（Ginkgo biloba L.）的干燥葉，被收載于2015年版《中國藥典》（一部）中，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、化濁降脂等功效[1]，在臨床使用較為廣泛。迄今為止，已從銀杏葉中發(fā)現(xiàn)了160多種化合物，主要包括黃酮、萜內(nèi)酯、多糖、聚戊烯醇、揮發(fā)油及甾醇等。銀杏葉聚戊烯醇（Polyprenols from the Ginkgo biloba leaves，GP）是銀杏葉中一種具有顯著生理活性的天然化合物，由15～21個異戊烯基單元構(gòu)成，在銀杏葉中的含量為1.0%～2.0%，高于銀杏黃酮（0.8%～2.0%）和銀杏萜內(nèi)酯（0.2%～0.4%）[2-4]。研究表明，GP對高血壓、糖尿病、慢性肝炎及腫瘤等具有明顯改善作用，但關(guān)于其對阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）的研究尚未見報道。國外對針葉聚戊烯醇的研究較為多見，將其用于早、中期AD和其他腦疾病的治療觀察研究中發(fā)現(xiàn)聚戊烯醇能提高認知能力、改善腦損傷程度和影響酶活性，對于腦疾病有一定的療效[5-8]。因此，本實驗以GP為研究對象，以神經(jīng)生長因子（NGF）誘導PC12細胞分化為具有神經(jīng)活性的dPC12細胞后，通過體外β淀粉樣肽25-35（Aβ25-35）誘導dPC12細胞損傷，制備體外AD細胞模型，探討GP的神經(jīng)保護作用，為GP在AD的治療研究方面提供理論依據(jù)，并為神經(jīng)保護藥物的研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

RT-6000酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；FA2004電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；Sorvall ST16臺式高性能離心機（美國Thermo公司）；IX51熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 提取物與試劑

GP（廣西中醫(yī)藥大學藥學院自制，批號：20150109，純度：74.69%）；胎牛血清（美國Hyclone公司）；馬血清、雙抗（青鏈霉素）購自杭州四季青有限公司；微量丙二醛（MDA）試劑盒（批號：20150810）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（批號：20150615）均購自南京建成生物工程研究所；活性氧（ROS）檢測試劑盒（批號：S0033）均購自碧云天生物技術(shù)研究院；Aβ25-35、NGF、二甲基亞砜（DMSO）、MTT均購自美國Sigma公司。

1.3 細胞株

鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤單克隆細胞系PC12細胞購自中國科學院上海生化與細胞所。

2 方法

2.1 GP的保存及Aβ25-35老化處理

取GP 40 mg，精密稱定，溶于1 mL DMSO中，濾過除菌，分裝，4℃條件下保存，備用。

[9-10]中方法，將1 mg Aβ25-35粉末溶于0.943 mL滅菌Mili-Q水中，制備成1 mmol/L的母液，振蕩混勻，一次性無菌濾器過濾后于37℃環(huán)境中進行至少1周的老化，使其老化聚集產(chǎn)生神經(jīng)毒性。將老化聚集的Aβ25-35溶液用1.5 mL EP管分裝，－20℃冰箱中保存。試驗前用所需培養(yǎng)液或細胞外液稀釋至所需濃度。

2.2 PC12細胞培養(yǎng)

將PC12細胞培養(yǎng)于含6%馬血清、6%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液、傳代，取狀態(tài)良好的處于對數(shù)生長期的細胞用于試驗。

2.3 NGF誘導PC12細胞分化

將對數(shù)生長期的PC12細胞接種于事先經(jīng)0.1%多聚賴氨酸包被的96孔板中，接種密度為1×103個/孔。培養(yǎng)24 h后，換成含NGF（50 ng/mL）的分化培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。隔天換液，連續(xù)誘導分化6 d，得到分化的PC12細胞（即dPC12細胞），在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀態(tài)。

2.4 Aβ25-35對dPC12細胞的損傷作用

將dPC12細胞接種于96孔板中，每孔加入不同量的Aβ25-35，作為終濃度分別為6.25、12.50、25、50μmol/L的Aβ25-35處理組，同時設(shè)置正常對照組（加等體積的DMSO完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，不作其他處理），共5組。各組細胞數(shù)基本相同，每組設(shè)6個復孔。將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察不同濃度Aβ25-35對dPC12細胞的損傷情況。每孔加入20μL MTT溶液（5 mg/mL），使MTT終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，37℃孵育4 h后終止培養(yǎng)。吸凈上清，加入150μL DMSO，室溫振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，最后在酶標分析儀上測定570 nm波長處的光密度（OD）值。計算細胞的存活率（SR）[SR（%）＝（試驗組OD值/正常對照組OD值）×100%]，以篩選最佳的損傷濃度。

2.5 GP對dPC12細胞存活率的影響

將dPC12細胞接種于96孔板中，每孔加入不同質(zhì)量濃度的GP溶液，作為終質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400μg/mL的GP試驗組，另設(shè)正常對照組（加等體積DMSO完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，不作其他處理），共6組。各組細胞數(shù)基本相同，每組6個復孔。將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)“2.4”項下方法操作，考察細胞的存活率。

2.6 GP對Aβ25-35誘導dPC12細胞損傷的保護作用

將dPC12細胞接種于96孔板中，試驗共設(shè)置7組，分別為正常對照組（加等體積的DMSO完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，不作其他處理）、Aβ25-35處理組（先用等體積DMSO完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，再加入終濃度為25μmol/L的Aβ25-35溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h）與GP試驗組（先分別經(jīng)25、50、100、200、400μg/mL GP藥液預處理24 h，再加入終濃度為25μmol/L的Aβ25-35溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h）。各組細胞數(shù)基本相同，每組6個復孔。將細胞置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)“2.4”項下方法操作，考察細胞的存活率。

2.7 GP對Aβ25-35誘導損傷的dPC12細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS和MDA水平的影響

將dPC12細胞接種于96孔板中，試驗共設(shè)置5組，分別為正常對照組（加等體積的DMSO完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，不作其他處理）、Aβ25-35處理組（先用等體積DMSO完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h，再加入終濃度為25μmol/L的Aβ25-35溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h）與GP試驗組（先分別經(jīng)50、100、200μg/mL GP藥液預處理24 h，再加入終濃度為25μmol/L的Aβ25-35溶液繼續(xù)培養(yǎng)24 h）。各組細胞數(shù)基本相同，每組6個復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，根據(jù)試劑盒說明書檢測細胞培養(yǎng)培養(yǎng)液中LDH、ROS和MDA水平。

2.8 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間的兩兩比較。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 NGF誘導PC12細胞分化結(jié)果

常規(guī)條件下PC12細胞的形態(tài)與嗜鉻瘤細胞相似，呈圓形、短梭形或三角形，有的細胞兩極有短突起；當用NGF處理后，可分化成類交感神經(jīng)元樣細胞，形成軸突樣突起，細胞胞漿中還伸出多條其他突起，突起長短不一、數(shù)目不等，細胞之間相互連接交織成網(wǎng)，結(jié)果見圖1。

圖1 PC12細胞分化前、后的形態(tài)變化Fig 1 Morphological changes of PC12 cells before and after differentiation

3.2 Aβ25-35對dPC12細胞的損傷作用考察結(jié)果

與正常對照組比較（細胞存活率為100%），Aβ25-35處理組在濃度為6.25～50μmol/L時對dPC12細胞有明顯損傷作用（P＜0.05或P＜0.01），且隨著Aβ25-35濃度的增加細胞存活率也隨之明顯下降，呈現(xiàn)濃度依賴性。當Aβ25-35濃度為12.5μmol/L時，細胞的存活率為83.18%，表明其對dPC12細胞的活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用（P＜0.01）。Aβ25-35誘導PC12細胞損傷的半數(shù)抑制濃度（IC50）約為25μmol/L，因此本研究選擇25μmol/L Aβ25-35處理dPC12細胞以復制AD細胞模型。

3.3 GP對dPC12細胞存活率的影響考察結(jié)果

GP試驗組的溶劑DMSO對dPC12細胞存活率基本無影響；不同質(zhì)量濃度GP（25～400μg/mL）與dPC12細胞共孵育24 h后，各組細胞存活率分別為100%、97.43%、97.43%、105%、100%，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明GP在25～400μg/mL質(zhì)量濃度范圍時對dPC12細胞無毒性作用。

3.4 GP對Aβ25-35誘導dPC12細胞損傷的保護作用考察結(jié)果

與正常對照組比較（細胞存活率為100%），Aβ25-35處理組細胞存活率（55.26%）顯著降低（P＜0.01）。與Aβ25-35處理組比較，GP試驗組用25μg/mL GP預處理后，細胞存活率（59.00%）無顯著變化（P＞0.05）；用50～400μg/mL GP預處理后，細胞存活率（分別為68.18%、76.27%、88.63%、86.36%）均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。這提示GP可以減輕Aβ25-35誘導的神經(jīng)細胞毒性，對dPC12細胞有一定保護作用。

3.5 GP對Aβ25-35誘導損傷dPC12細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS、MDA水平的影響

與正常對照組比較，Aβ25-35處理組細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS、MDA水平均顯著升高（P＜0.01）；與Aβ25-35處理組比較，100、200μg/mL GP試驗組細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS、MDA水平以及50μg/mL GP試驗組細胞培養(yǎng)液中ROS水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），呈一定的濃度依賴性。這提示GP可保護細胞膜的完整性，從而有效對抗Aβ25-35誘導的dPC12細胞損傷，結(jié)果見圖2。

圖2 各組細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS和MDA水平測定結(jié)果Fig 2 Determination results of LDH，ROS and MDA levels in cell culture medium in each group

4 討論

銀杏葉提取物對腦局部缺血、癲癇發(fā)作、外周性神經(jīng)炎具有神經(jīng)保護作用，臨床上用于治療早期AD、血管性癡呆等疾病，但是銀杏葉提取物化學成分復雜，其抗AD的物質(zhì)基礎(chǔ)未能闡明[11]。AD是老年人常見的神經(jīng)退行性疾病，其發(fā)病可能與Aβ誘導的神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)。PC12細胞具有神經(jīng)嵴源性和神經(jīng)細胞特點，經(jīng)NGF誘導后產(chǎn)生神經(jīng)元樣細胞，是目前比較公認的用來制作AD模型的細胞之一。Aβ是一種分子量為4.2 kD的多肽，含39～42個氨基酸，是許多正常細胞內(nèi)的β淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）的裂解產(chǎn)物。Aβ通常以Aβ1-40和Aβ1-42兩種形式存在，其中Aβ1-42更易沉積，是老年斑的主要成分；Aβ25-35是Aβ生物活性片段，25-35位氨基酸序列呈β折疊是引起神經(jīng)毒性必需的結(jié)構(gòu)。研究表明，凝聚態(tài)Aβ25-35在體或離體條件下皆可表現(xiàn)出神經(jīng)細胞毒性作用，誘導細胞凋亡，故Aβ25-35常被廣泛應用于體內(nèi)外AD模型制備的研究中[12-13]。在正常細胞中，LDH是主要存在細胞內(nèi)的胞漿酶，細胞凋亡裂解時，LDH會釋放到細胞外基質(zhì)液中。因此，可以通過測定細胞培養(yǎng)液中LDH的含量來反映細胞損傷的程度[14]。機體受到毒性刺激時，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與抗氧化防御之間失去平衡，導致ROS在體內(nèi)蓄積，損傷細胞功能直至細胞死亡。MDA是神經(jīng)元脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)物，可結(jié)合蛋白質(zhì)、磷脂等物質(zhì)，使膜通透性增加，引起膜內(nèi)外離子濃度失衡，造成細胞損傷。細胞培養(yǎng)液中ROS、MDA水平也可評價神經(jīng)細胞損傷的程度。

本試驗研究了GP對Aβ25-35誘導dPC12細胞損傷的影響。結(jié)果顯示，給予Aβ25-35處理dPC12細胞后，細胞存活率顯著下降，細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS、MDA水平也顯著升高，這提示造模成功。用GP預處理dPC12細胞后，再用Aβ25-35誘導細胞損傷，結(jié)果與Aβ25-35處理組比較細胞存活率顯著升高，細胞培養(yǎng)液中LDH、ROS、MDA水平明顯降低，且呈一定的濃度依賴性，這提示GP具有拮抗Aβ25-35誘導dPC12細胞損傷的作用，可保護細胞膜完整性、減輕細胞損傷。GP作為一種潛在的抗AD藥物，其作用機制值得進一步研究。

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Study on Protective Effects of the Polypentenol from Ginkgo biloba Leaf on Aβ25-35-induced Damage in dPC12 Cells

CHEN Weiwei1，2，3，LIANG Di1，ZHAO Qixiu2，LUO Yi1，LIU Lingjie1，MO Liping1，HUANG Junshan1，LI Haitao2，3（1.School of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530001，China；2.School of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；3.Jiangsu Institute of Ginkgo Biloba，Jiangsu Pizhou 221300，China）

OBJECTIVE：Study the protective effect of the polypentenol from Ginkgo biloba leaf（GP）on Aβ25-35-induced damage in dPC12 cells，and to provide reference for the treatment of Alzheimer’s disease（AD）.METHODS：After PC12 cells were differentiated into dPC12 cells with neural activity by incubating with never growth factor（NGF），the dPC12 cells were divided into normal control group（DMSO medium），Aβ25-35treatment group（DMSO medium）and GP test group（DMSO medium respectively containing 25，50，100，200，400μg/mL GP）.After 24 h cultivating，cells in Aβ25-35treatment group and GP test group were added 25 μmol/L Aβ25-35to induce cell damage（AD cell model），MTT method was used to determine the survival rate after 24 h.Other cells were divided into normal control group（DMSO medium），Aβ25-35treatment group（DMSO medium）and GP test group（DMSO medium respectively containing 25，50，100，200μg/mL GP），the lactate dehydrogenase（LDH），reactive oxygen species（ROS），malondialdehyde（MDA）levels in cell culture medium were detected after the same treatment.RESULTS：Compared with Aβ25-35treatment group，the survival rates of dPC12 cells in 50，100，200，400μg/mL GP test groups were obviously increased（P＜0.05 or P＜0.01）；LDH，ROS，MDA levels in 100，200μg/mL GP test groups and ROS level in 50μg/mL GP test group were significantly reduced（P＜0.05 or P＜0.01），showing a certain concentration-dependence.CONCLUSIONS：GP has certain protective effect on Aβ25-35-induced damage in dPC12 cells，and it’s a potential drug for AD.

Ginkgo biloba leaf；Polypentenol；Aβ25-35；dPC12 cell；Lactate dehydrogenase；Reactive oxygen species；Malondialdehyde

R741.02

A

1001-0408（2017）07-0881-04

2016-08-17

2016-11-07）

（編輯：林 靜）

廣西自然科學基金面上項目（No.2013GXNSFAA-019115）；廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項課題（No.GZZY13-09）；壯瑤藥協(xié)同創(chuàng)新中心課題（No.桂教科研﹝2013﹞20號）；廣西壯瑤藥重點實驗室課題（No.桂科基字﹝2014﹞32號）

＊教授，博士研究生。研究方向：新藥研發(fā)、藥理學。E-mail：weiweichen2012@sina.com

#通信作者：教授，博士生導師，博士。研究方向：新藥研發(fā)、藥理學。E-mail：lihaitao0003@sina.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.05