劉 沖，楊偉俊，何 江，程 波，地力努爾·吐爾遜江（.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所/新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830004）

·實(shí)驗(yàn)研究·

基于DNA條形碼ITS2序列對阿魏屬藥用植物的鑒別研究Δ

劉 沖1，2＊，楊偉俊1#，何 江1，程 波1，地力努爾·吐爾遜江1（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆石河子 832003；2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所/新疆維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830004）

目的：建立一種快速、準(zhǔn)確和標(biāo)準(zhǔn)化的中藥材阿魏屬植物DNA條形碼鑒別方法。方法：提取新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen）基因組DNA，擴(kuò)增ITS2序列并測序；運(yùn)用分析相似性搜索法，下載GenBank數(shù)據(jù)庫中阿魏屬植物13個物種26個樣本基因ITS2序列并進(jìn)行比對分析，計算種間種內(nèi)遺傳距離并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析。結(jié)果：通過計算，15個物種遺傳距離分布范圍為0.009～0.230，平均遺傳距離為0.018；聚類分析結(jié)果顯示DNA條形碼ITS2序列能夠?qū)⑽簩?2種植物聚為不同的類。結(jié)論：建立的阿魏藥材DNA條形碼ITS2序列鑒別方法可準(zhǔn)確、快速地鑒別出阿魏屬藥材的正品和混淆品。

阿魏屬；DNA條形碼；ITS2序列；藥材；鑒別

阿魏屬（Ferula L.）植物在全世界約有150余種，主要分布于地中海、非洲北部、中亞及西伯利亞地區(qū)[1]。我國有26種和1變種，分布于新疆、西藏、山西、云南和江蘇等地，其中新疆有20種[2]，分布在伊寧、阜康、托里、塔城及烏恰等地。該屬有多種藥用植物，唐代《新修本草》最早記載新疆阿魏（Ferula sinkiangensis K.M.Shen）和阜康阿魏（Ferula fukanensis K.M.Shen），將其根和樹脂作為藥物使用?，F(xiàn)代研究表明，新疆阿魏和阜康阿魏的根和樹脂具有抗生育、免疫抑制、解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等廣泛的藥理活性[3-4]。該屬植物在新疆民間廣泛使用。

近年來，藥材需求的增大使阿魏屬藥材野生資源儲量急劇下降，少數(shù)種如新疆阿魏和阜康阿魏等已瀕臨滅絕，當(dāng)?shù)孛耖g行醫(yī)者和藥材市場用多傘阿魏代替新疆阿魏和阜康阿魏已相當(dāng)普遍，代用、誤用現(xiàn)象屢屢發(fā)生，嚴(yán)重影響并制約該藥的治療效果[5]。因此有必要準(zhǔn)確鑒別阿魏屬藥材及其同屬密切相關(guān)種以確保安全用藥。然而，阿魏屬藥用植物種類雖多，但真正有價值的分類性狀不多，對于大多數(shù)藥材飲片而言，藥材常常在采收、運(yùn)輸和加工中外觀形態(tài)已被改變且花粉也已損失殆盡，通用的藥材鑒別方法用于阿魏類藥材鑒定尚存缺陷。

目前，運(yùn)用DNA條形碼來作為藥材鑒定方法已逐漸成為近年來的熱點(diǎn)，該方法在物種鑒定方面顯示出巨大的應(yīng)用前景[6-7]，其中DNA條形碼ITS2（Internal transcribed spacer 2）序列已成功地應(yīng)用于小茴香[8]、麻黃[9]、薄荷[10]等及其混淆品的鑒定。由于植物DNA條形碼研究進(jìn)展相對緩慢，越來越多的科學(xué)研究試圖尋找某個DNA片段以實(shí)現(xiàn)對所有的植物物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。在“第三屆國際條形碼大會”上，我國科學(xué)家陳士林等[6]提出DNA條形碼ITS2序列的鑒定能力優(yōu)于DNA條形碼rbcl和matK組合，建議將ITS2作為藥用植物通用的條形碼序列。本研究即應(yīng)用ITS2條形碼對阿魏屬藥用植物進(jìn)行鑒定研究，旨在為阿魏屬藥材的快速、準(zhǔn)確鑒定及其分子鑒定提供新的方法和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：20151012）；瓊脂糖（美國 Invitrogen公司，批號：20140123）；核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)品DL2000、DL5000及Taq DNA聚合酶（寶生物工程有限公司，批號均為：20140234）；乙二胺四乙酸（EDTA，北京鼎國生物技術(shù)有限公司）；氯仿、異丙醇、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 樣本

本研究材料共包含來自15個物種的32個樣本，包括試驗(yàn)樣品及從GenBank下載的序列；樣本包括新疆阿魏和阜康阿魏藥材樣本2個基源物種，其余樣本為阿魏的同屬混淆品種。所研究材料中其余13個物種26條ITS2序列，下載于美國國家生物技術(shù)信息中心DNA序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。上述各材料由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江副研究員進(jìn)行鑒定，憑證標(biāo)本保存于新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所。樣品采集信息及ITS2 GenBank登錄號見表1。

表1 樣品采集信息及ITS2 GenBank登錄號Tab 1 Sample information and ITS2 GenBank number

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

取研究樣品新疆阿魏和阜康阿魏約10 mg，采用液氮冷凍研磨成細(xì)粉，用DNA提取試劑盒提取總DNA。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）反應(yīng)體積為25 μL，在PCR擴(kuò)增程序（94℃、5 min；94℃、30 s；56℃、30 s；72℃、45 s；40個循環(huán)）條件下對ITS2所用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增（正向引物S2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物S3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳可見清晰的條帶并經(jīng)純化后，由北京華大基因公司進(jìn)行雙向測序待用。

1.4 序列處理及數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)測序共得到了新疆阿魏和阜康阿魏6份個體，其余樣本來自于GenBank的ITS2序列，測序得到的序列用CodonCode Aligner V 3.0軟件（下載于http：//www.codoncode.com/aligner/new30.htm）對測序峰圖進(jìn)行校對拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，獲得ITS2序列。將基源物種阿魏ITS2序列提交至GenBank核酸數(shù)據(jù)庫，與其密切相關(guān)種序列鑒定運(yùn)用分析相似性搜索法（BLASTI），在GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，對相似度達(dá)到99%的序列進(jìn)行下載，利用數(shù)據(jù)庫進(jìn)行電子化比對e-PCR（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/epcr/；e-PCR是指將所查詢序列與數(shù)據(jù)庫中DNA序列兩端的PCR引物序列進(jìn)行比對），引物為ITS2，除去兩端多余的序列待用。

所得到的序列利用MEGA 5.0軟件（http：//www. megasoftware.net/home）進(jìn)行種內(nèi)、種間K2P（Kimura 2-parameter）遺傳距離分析。計算序列的種內(nèi)和種間遺傳距離分布：運(yùn)用上述軟件中K2P項(xiàng)設(shè)置參數(shù)計算物種的種間遺傳距離、種內(nèi)遺傳距離占物種數(shù)量的分布比例（調(diào)整參數(shù)消除物種樣本數(shù)量不同造成的誤差）。采用BLASTI、最近距離法（Nearest distance）及構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)聚類樹對阿魏屬植物進(jìn)行鑒定分析。

2 結(jié)果

2.1 序列分析

新疆阿魏和阜康阿魏樣品雙向測序結(jié)果經(jīng)比對校正后，所有序列不含點(diǎn)套峰、插入或缺失以及終止密碼子為合格（測序結(jié)果不應(yīng)含有套峰、插入或缺失，且ITS2序列是非編碼基因不應(yīng)該具有終止密碼子）。運(yùn)用MEGA 5.0軟件以BLASTI法在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對下載相似度較高的同屬植物密切相關(guān)種即大果阿魏、多傘阿魏、全裂葉阿魏、橄欖阿魏等的ITS2序列，分析比較阿魏屬的15種原植物的32條ITS2序列，序列長度在210～252 bp之間；序列鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）含量差異較小，平均為39%；經(jīng)過分析查找發(fā)現(xiàn)新疆阿魏和阜康阿魏的ITS2序列均有含有聚胞嘧啶核苷酸（PolyC）和聚鳥嘌呤核苷酸（PolyG）特殊序列結(jié)構(gòu)。

2.2 阿魏屬藥用植物種間和種內(nèi)遺傳距離

遺傳距離見圖1。

對圖1進(jìn)行分析表明，阿魏屬15個物種種內(nèi)變異較小，物種分布范圍為0.009～0.230，平均遺傳距離為0.018，種間遺傳距離分布范圍為0.31～5.10。阿魏屬藥用植物種內(nèi)遺傳距離較小，因此DNA條形碼ITS2序列適用于阿魏屬植物的物種鑒定。

圖1 阿魏屬種間和種內(nèi)的遺傳距離Fig 1 Interspecies and intraspecies genetic distances of ferulic plants

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定結(jié)果

根據(jù)參比序列的評價篩選標(biāo)準(zhǔn)，本文對阿魏藥材的基源植物新疆阿魏和阜康阿魏進(jìn)行ITS2序列測定，并在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中注冊，注冊號分別為新疆阿魏F.sinkiangensis K.M.Shen KF792993、KF792994、KF792995、KC461130；阜康阿魏F.fukanensis K.M.Shen KF793025、KF793026、KF793027。運(yùn)用MEGA 5.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)聚類樹，見圖2。

圖2 基于鄰接法構(gòu)建ITS2序列的阿魏屬植物進(jìn)化樹Fig 2 Establishing ferulic species phylogenetic tree of ITS2 sequences based on adjacency method

對圖2的鑒定分析結(jié)果表明，阿魏屬藥用植物ITS2序列能夠?qū)⒃搶倜糠N植物聚為一類，例如2015年版《中國藥典》中收錄的新疆阿魏和阜康阿魏的ITS2序列各自單獨(dú)聚為一類，區(qū)分出了與其親緣關(guān)系較近的相關(guān)種?；诖耍珼NA條形碼ITS2適用于阿魏屬植物的鑒定。

3 討論

阿魏屬藥用植物具有很高的藥用價值，近年來，隨著對中藥材需求量的增大，如新疆阿魏、阜康阿魏等，市面上藥材品種混亂，使得藥材品質(zhì)不一，代用、誤用現(xiàn)象時有發(fā)生。本研究通過阿魏屬的藥用植物DNA條形碼鑒定，發(fā)現(xiàn)新疆阿魏和阜康阿魏同屬植物ITS2序列NJ遺傳臨近距離遠(yuǎn)大于密切相關(guān)種多傘阿魏、全裂葉阿魏、橄欖阿魏等，用此方法能明顯區(qū)分各種；建立的新疆阿魏、阜康阿魏和混淆品的系統(tǒng)進(jìn)化樹，可為新疆阿魏和阜康阿魏的鑒別提供分子水平的鑒定依據(jù)。

ITS2是rDNA基因中5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列，常用于對真菌的不同生物型、菌株、種、屬進(jìn)行分類鑒定[6]。運(yùn)用DNA條形碼ITS2鑒定物種開啟了新的研究熱點(diǎn)[11]，對于分類學(xué)中難以區(qū)分的類群，采用ITS2序列區(qū)分鑒定，可以拋開形態(tài)相似的假象，從基因水平上提供一種分類依據(jù)。因此，本研究運(yùn)用DNA條形碼ITS2序列成功進(jìn)行了鑒別阿魏屬藥用植物復(fù)雜分類的有益嘗試，為當(dāng)?shù)匚锓N阿魏藥材研究提供了信息化的分類學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，具有重要的意義。為了使物種鑒定更加快捷，筆者基于上述研究擬提出快速鑒別物種的方法如下：選取鑒定物種的新鮮組織提取其DNA，對DNA進(jìn)行ITS2序列PCR擴(kuò)增，將物種的ITS2序列在GenBank中進(jìn)行物種比對，即可完成物種鑒定。

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Study on the Identification of Ferulic Medicinal Plants Based on DNA Barcode ITS2 Sequence

LIU Chong1，2，YANG Weijun1，HE Jiang1，CHENG Bo1，DILINUER·Tuerxunjiang（11.School of Pharmacy，Shihezi University，Xinjiang Shihezi 832003，China；2.Xinjiang Institute of Materia Medica/Key Laboratory of Xinjiang Uygur Medicine，Urumqi 830004，China）

OBJECTIVE：To establish a rapid，accurate and standardized DNA barcode identification method for the ferulic medicinal plants.METHODS：Genomic DNA was extracted from Ferula sinkiangensis K.M.Shen and Ferula fukanensis K.M. Shen，ITS2 sequences were amplified and sequenced，analytical similarity search method was conducted，13 species 26 samples gene ITS2 sequences of ferulic medicinal plants in GenBank database were downloaded and comparatively analyzed；interspecies and intraspecies genetic distances were calculated，and phylogenetic tree was developed for cluster analysis.RESULTS：According to calculation，species genetic distances of the 15 species ranged 0.009-0.230，average genetic distance was 0.018；results of cluster analysis showed DNA barcode ITS2 sequences can cluster the 32 kinds of ferulic medicinal plants into different classes.CONCLUSIONS：The established DNA barcode ITS2 sequences identification method can accurately and rapidly identify the genuine and false samples of ferulic species.

Ferulic species；DNA barcode；ITS2 sequences；Medicinal materials；Identification

R284.1

A

1001-0408（2017）07-0878-03

2016-08-19

2016-11-19）

（編輯：劉 萍）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.81560714）

＊助理研究員，博士研究生。研究方向：藥用植物資源學(xué)。電話：0991-2320292。E-mail：liu_chong02@163.com

#通信作者：研究員。研究方向：藥用植物資源學(xué)。電話：0991-2320292

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.04