王瑞杰，李 暉，王自闖（.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，鄭州 45000；.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，鄭州 45000）

補腎活血化痰方對多囊卵巢綜合征模型大鼠的治療作用機制研究Δ

王瑞杰1＊，李 暉2，王自闖1（1.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，鄭州 450002）

目的：考察補腎活血化痰方對多囊卵巢綜合征（PCOS）模型大鼠的治療作用機制。方法：將50只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組[羅格列酮，3.0 mg/（kg·d）]和補腎活血化痰方高、低劑量組[7.5、5.0 g/（kg·d）]，每組10只。除正常對照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法復制PCOS模型。造模后，正常對照組和模型對照組大鼠ig生理鹽水，各給藥組大鼠ig相應(yīng)藥液，每天1次，連續(xù)22 d。給藥結(jié)束后，測定大鼠血清中睪酮（T）、抗苗勒氏管激素（AMH）、胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平和卵巢組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）陽性表達情況。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平及卵巢組織中TGF-β1陽性表達率均顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平及卵巢組織中TGF-β1陽性表達率均顯著降低（P＜0.05），且補腎活血化痰方各劑量組指標優(yōu)于陽性對照組（P＜0.05）。結(jié)論：補腎活血化痰方能明顯降低PCOS模型大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平以及卵巢組織中TGF-β1陽性表達率，這可能是其治療PCOS的作用機制之一。

補腎活血化痰方；多囊卵巢綜合征；抗苗勒氏管激素；胰島素樣生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子β1；腫瘤壞死因子α；大鼠

多囊卵巢綜合征（Polycystic ovary syndrome，PCOS）是一種育齡婦女常見的內(nèi)分泌及代謝異常性疾病，典型特征為高雄激素水平和卵巢長期無排卵。其發(fā)病機制復雜，與胰島素抵抗、內(nèi)分泌失調(diào)等多種因素均有關(guān)[1]。據(jù)報道，PCOS患者血清高雄激素水平的發(fā)生可能與抗苗勒氏管激素（AMH）紊亂有關(guān)[2]。另有研究認為，胰島素抵抗與胰島素樣生長因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）有關(guān)[3]，其中卵巢組織中IGF-Ⅰ功能與胰島素類似，參與糖、脂等的代謝。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）具有抑制細胞生長、刺激細胞間質(zhì)生成的雙向作用，在卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

補腎活血化痰方為河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院褚玉霞教授總結(jié)臨床經(jīng)驗而得的驗方，由丹參、菟絲子、熟地黃等11種中藥材組成，具有補腎益精、活血通絡(luò)等功效，在臨床上能有效提高PCOS患者的排卵率[4-5]。本研究中，作者擬以PCOS大鼠為模型動物，根據(jù)PCOS現(xiàn)代醫(yī)學發(fā)病機制，探討補腎活血化痰方對PCOS模型大鼠血清中AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α和卵巢組織中TGF-β1表達的影響，探討其治療PCOS的可能作用機制。

1 材料

1.1 儀器

Uniwersal 32R型高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；SZ61型光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

補腎活血化痰方（河南省中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院中藥房自制，批號：002345；規(guī)格：每1 mL相當于生藥1 g）；羅格列酮片（太極集團涪陵制藥有限公司，批號：041399，規(guī)格：4 mg/片）；注射用人絨毛膜促性腺激素（HCG，上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號：030610）；中性胰島素注射液（江蘇徐州萬邦生化制藥有限公司，批號：120536）；睪酮（T）放射免疫檢測試劑盒（北京東雅生物試劑公司，批號：FM0084）；AMH酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國DSL有限公司，批號：EAI05038）；IGF-ⅠELISA試劑盒（意大利Diasorin公司，批號：E0050h）；TNF-α ELISA試劑盒（上海翔升生物科技有限公司，批號：EL10019）；兔抗IGF-Ⅰ單克隆抗體、生物素標記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體（美國Santa Cruz公司）；TGF-β1免疫組化試劑盒（上海藍基生物技術(shù)有限公司，批號：BA0290）。

1.3 動物

健康SD大鼠50只，♀，SPF級，體質(zhì)量160～200 g，鼠齡54～60 d，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SCXK（豫）2010-0002。所有大鼠均在室溫為18～22℃、濕度為55%～65%、壓力梯度為20～50 kPa的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實驗，飼養(yǎng)期間正常飲食。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

2.1.1 分組 將50只大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性對照組和補腎活血化痰方高、低劑量組，每組10只。

2.1.2 造模 除正常對照組外，其余各組大鼠均采用Poresky法[6]復制PCOS動物模型。各造模組大鼠均sc HCG 1.5 U/d，每天2次，共22 d；并同時sc中性胰島素（實驗1～11 d，劑量從0.5 U/d開始逐漸增加到6.0 U/d，每天2次；從12 d開始劑量便維持在6.0 U/d，直到造模結(jié)束）；期間以5%葡萄糖溶液作為日常飲水。正常對照組大鼠每天sc等容積注射用水，并ig等體積日常飲用水。造模的最后一天，所有大鼠禁食過夜，次日稱體質(zhì)量后測定血清中T水平并進行陰道涂片。若血清中T水平異常升高，陰道角化細胞持續(xù)出現(xiàn)或失去完整動情周期，則表明造模成功[7]。

2.1.3 給藥 從造模成功后的第2天開始給藥：正常對照組和模型對照組大鼠ig蒸餾水，陽性對照組大鼠ig羅格列酮3.0 mg/（kg·d）（根據(jù)成人臨床用量的20倍劑量換算而得），補腎活血化痰方高、低劑量組大鼠分別ig補腎活血化痰方7.5、5.0 g/（kg·d）（根據(jù)成人臨床用量的20、10倍劑量換算而得），每天1次，連續(xù)22 d。

2.2 標本采集

末次給藥后大鼠禁食過夜，次日稱體質(zhì)量，眼眶后靜脈叢取血，離心，分離血清，將血清置于－20℃冰箱中保存，備用。然后將大鼠斷頭處死，游離卵巢，置于4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，以卵巢最大平面為待檢測面，常規(guī)石蠟包埋，制成4 μm切片，用于免疫組化檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平 采用放射免疫法測定大鼠血清中T水平；采用ELISA法測定大鼠血清中AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平，嚴格按照各自試劑盒說明書操作。

2.3.2 卵巢組織中TGF-β1表達 采用免疫組織化學法。一抗采用兔抗TGF-β1單克隆抗體（稀釋比例為1∶200）；二抗采用生物素標記的羊抗兔IgG抗體（稀釋比例為1∶200），孵育時間為1～2 h。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，沖洗后蘇木素復染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片，以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗為陰性對照，對圖片進行圖像分析。光鏡下選擇5個視野，各視野計數(shù)100個間質(zhì)細胞，計數(shù)陽性細胞百分比（細胞質(zhì)內(nèi)著色為淡黃色至棕黃色提示為陽性細胞）。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，補腎活血化痰方高、低劑量組大鼠上述指標降低更為明顯（P＜0.05）；補腎活血化痰方高、低劑量組間比較，上述指標差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平測定結(jié)果詳見表1。

表1 各組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The levels of T、AMH、IGF-Ⅰand TNF-α inserum of rats in each group（±s，n＝10）

表1 各組大鼠血清中T、AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 1 The levels of T、AMH、IGF-Ⅰand TNF-α inserum of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

TNF-α，pg/mL 14.07±2.2227.13±2.12＊20.69±2.25#14.00±2.15#Δ15.06±2.02#Δ組別正常對照組模型對照組陽性對照組補腎活血化痰方高劑量組補腎活血化痰方低劑量組劑量，mg/（kg·d）3.0 7.5 5.0T，ng/dL 5.56±1.42 19.57±3.82＊10.24±2.67#6.86±2.05#Δ7.35±1.90#ΔAMH，ng/mL 2.89±1.02 7.85±2.54＊4.50±1.42#3.00±1.40#Δ3.18±1.38#ΔIGF-Ⅰ，ng/mL 0.30±0.170.49±0.06＊0.40±0.09#0.31±0.06#Δ0.32±0.07#Δ

3.3 卵巢組織中TGF-β1陽性表達率測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組比較，各給藥組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率均顯著降低（P＜0.05）；與陽性對照組比較，補腎活血化痰方高、低劑量組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率降低更為明顯（P＜0.05）；補腎活血化痰方高、低劑量組間比較，TGF-β1陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率測定結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 The positive expression rate of TGF-β1in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

表2 各組大鼠卵巢組織中TGF-β1陽性表達率測定結(jié)果（±s，n＝10）Tab 2 The positive expression rate of TGF-β1in ovarian tissue of rats in each group（±s，n＝10）

注：與正常對照組比較，＊P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與陽性對照組比較，ΔP＜0.05Note：vs.normal control group，＊P＜0.05；vs.model control group，#P＜0.05；vs.positive control group，ΔP＜0.05

TGF-β1陽性表達率，%13.50±1.9542.56±6.15＊30.28±5.24#20.14±3.67#Δ22.95±3.54#Δ組別正常對照組模型對照組陽性對照組補腎活血化痰方高劑量組補腎活血化痰方低劑量組劑量，mg/（kg·d）3.0 7.5 5.0

4 討論

目前，PCOS動物模型建立的方法有孕激素+HCG法、雄激素法、胰島素+HCG法（即Poresky法）等[6-7]。Poresky法造模后表現(xiàn)出無排卵、血清T水平顯著上升的特點，病理組織學檢查卵巢癥狀與臨床表現(xiàn)類似，這是本研究選擇Poresky法造模的原因之一。西醫(yī)治療PCOS主要以羅格列酮等抗胰島素抵抗相關(guān)藥物為主，能有效增強胰島素敏感性、促進排卵。中醫(yī)則認為PCOS的發(fā)生在于本虛標實，其中本虛即本腎虛，標實包括血瘀、痰濕等，這也為補腎活血化痰方治療PCOS提供了理論基礎(chǔ)。

報道稱，50%～70%的PCOS患者伴有糖代謝異常現(xiàn)象，表現(xiàn)為胰島素抵抗[7]。在本研究中，模型對照組大鼠血清中T水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），提示造模成功。給藥后，大鼠血清中T水平較模型對照組均顯著下降，且補腎活血化痰方組下降幅度較陽性對照組更為明顯。AMH在TGF-β家族中占據(jù)重要地位，其在直徑小于4 mm的竇卵泡中表達最強，竇卵泡直徑越大則表達越弱，可見AMH表達強弱與竇卵泡直徑的有關(guān)，因此推斷可將AMH作為PCOS診斷的重要指標之一[8]。IGF-Ⅰ含有70個氨基酸，其結(jié)構(gòu)、功能類似胰島素，具有調(diào)節(jié)細胞生長、參與機體新陳代謝等作用。當IGF-Ⅰ水平異常升高時，IGF-Ⅰ的類似胰島素功能也隨之變化，致使機體新陳代謝異常、雄激素水平上升，增加胰島素抵抗，最終導致PCOS發(fā)生。TGF-β1參與卵泡的發(fā)育過程，有雙向作用，一方面可抑制多種細胞生長，另一方面卻可刺激細胞間質(zhì)生成。TNF-α是重要的促炎細胞因子，且在PCOS合并胰島素抵抗的患者中表達增高，推測其參與了PCOS的發(fā)病，是目前PCOS研究的熱點[3]。本研究結(jié)果顯示，補腎活血化痰方能有效調(diào)節(jié)PCOS模型大鼠卵巢組織中TGF-β1的異常高表達，降低血清中AMH、IGF-Ⅰ和TNF-α水平，且作用強于羅格列酮。

《醫(yī)學正傳》中記載：“經(jīng)水全賴腎水施化，腎水缺乏而經(jīng)水日以干涸”[9]。中醫(yī)認為腎虛為PCOS患者排卵障礙的根本原因，而腎虛也易導致痰瘀或血瘀發(fā)生，瘀不去則新不生[10]。補腎活血化痰方中的丹參活血化瘀；熟地黃滋陰補血、益精填髓；菟絲子補腎益精；仙靈脾補腎壯陽、祛風除濕；白術(shù)健脾益氣；茯苓利水滲濕；川牛膝活血通絡(luò)、祛風除濕；陳皮健脾燥濕；白芥子化痰理氣；姜半夏化痰；香附理氣調(diào)中、調(diào)經(jīng)止痛。諸藥合用，共奏補腎益精、活血通絡(luò)、祛痰除濕之功效[11]。

綜上所述，補腎活血化痰方可能是通過調(diào)節(jié)血清中AMH、IGF-Ⅰ、TNF-α水平以及卵巢組織中TGF-β1陽性表達，從而降低PCOS模型大鼠血清中高水平雄激素和減輕胰島素抵抗，這可能是其治療PCOS的機制之一。

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Study on the Curative Mechanism of Bushen Huoxue Huatan Formula on Polycystic Ovarian Syndrome Model Rats

WANG Ruijie1，LI Hui2，WANG Zichuang1（1.The Second Clinical Medical College of Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450002，China；2.Dept.of Reproductive Medicine，the Second Affiliated Hospital，Henan University of Chinese Medicine/Henan Traditional Chinese Medicine Hospital，Zhengzhou 450002，China）

OBJECTIVE：To detect curative mechanism of bushen huoxue huatan formula on polycystic ovarian syndrome（PCOS）model rats.METHODS：50 rats were randomly divided into normal control group，model control group，positive control group[rosiglitazone，3.0 mg/（kg·d）]and Bushen huoxue huatan formula high-dose，low-dose groups[7.5，5.0 g/（kg·d）]，10 in each group.Except for normal control group，the PCOS model was induced by Poresky method in other groups.After modeling，normal control group and model control group were received normal saline intragastrically，medicine groups were received corresponding liquids intragastrically，once a day，for 22 d.After administration，the serum levels of testosterone（T），anti-mullerian hormone（AMH），insulin-like growth factorⅠ（IGF-Ⅰ），tumor necrosis factor-α（TNF-α）and the positive expression of transforming growth factor-β1（TGF-β1）in ovarian tissue were determined.RESULTS：Compared with normal control group，T，AMH，IGF-Ⅰ，TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate in ovarian tissue of rats in model control group were significantly increased（P＜0.05）；compared with model control group，T，AMH，IGF-Ⅰ，TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate of rats in ovarian tissue in other medicine groups were significantly decreased（P＜0.05），and the indexes in Bushen huoxue huatan formula different doses groups were superior to positive control group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Bushen huoxue huatan formula can obviously reduce the T，AMH，IGF-Ⅰ，TNF-α levels in serum and TGF-β1positive expression rate in ovarian tissue in model rats with PCOS，which may be one of the mechanisms of its treatment for PCOS.

Bushen huoxue huatan formula；Polycystic ovarian syndrome；Anti-mullerian hormone；Insulin-like growth factor；Transforming growth factor-β1；Tumor necrosis factor-α；Rats

R285.5

A

1001-0408（2017）07-0899-04

2016-06-07

2016-12-09）

（編輯：林 靜）

河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目（No.13A360579）；全國名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項目（No.〔2014〕-20號）；河南中醫(yī)學院博士啟動基金（No.BSJJ2012-21）

＊講師，博士。研究方向：生殖內(nèi)分泌、不孕不育。電話：0371-60908737。E-mail：wangruijie021@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.10