劉蓉蓉

（中國農業(yè)科學院科技管理局，北京 100081）

轉基因植物生產疫苗和藥物的研發(fā)進展

劉蓉蓉

（中國農業(yè)科學院科技管理局，北京 100081）

與傳統(tǒng)的生產方式相比，以轉基因植物作為生物反應器生產藥用蛋白和疫苗，被認為是成本低廉、安全便捷的技術途徑。目前，若干以轉基因植物生產的藥用蛋白已通過行政審批準予上市，一批轉基因植物表達的人用或畜禽用疫苗也進入臨床試驗。綜述了轉基因植物生產疫苗和藥用蛋白的研發(fā)進展與代表性案例，討論了目前面臨的問題與挑戰(zhàn)，展望了未來技術發(fā)展方向。

植物生物反應器；疫苗；藥用蛋白；表達系統(tǒng)

天然來源的藥用蛋白往往因提純成本高而導致價格昂貴，疫苗和重組蛋白則需建立人工表達系統(tǒng)來生產。傳統(tǒng)的生產方式主要包括細菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞等系統(tǒng)，但這些方式都有各自的缺點，如微生物細胞無法對蛋白進行哺乳動物的糖基化修飾或正確的折疊組裝，動物細胞表達系統(tǒng)成本高且有污染病原的風險等。理想的蛋白表達系統(tǒng)必須能生產有功能的產物、生產成本低、產物易于純化、生產耗時短。近年來，轉基因植物表達藥用蛋白（Plant-made pharmaceuticals，PMP）的新技術平臺獲得了廣泛關注［1］。

1 轉基因植物生產疫苗和藥物研發(fā)概述

與其他幾種表達系統(tǒng)相比，以轉基因植物作為生物反應器生產重組蛋白被認為具有突出優(yōu)點：方法簡單、成本低廉、易于規(guī)?；a、儲藏和運輸方便等，既能對表達蛋白進行翻譯后折疊和糖基化修飾，與通常使用的哺乳細胞、大腸桿菌、酵母表達系統(tǒng)相比，又沒有污染人類病原或毒素的風險，成為表達藥用蛋白的理想選擇［2］。

1986年研究者將人生長激素基因引入煙草，獲得了表達產物，從此開啟了PMP的研發(fā)工作。1989年研究者首次在煙草中成功表達了人免疫球蛋白G（IgG），證明植物中能夠合成并正確組裝這種多亞基的糖蛋白。首先實現(xiàn)商業(yè)化生產的PMP是以色列藥品研發(fā)公司Protalix開發(fā)的在胡蘿卜細胞中表達的葡糖腦苷脂酶，于2012年美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準上市，用于治療β-葡萄糖腦苷脂酶減少或缺乏引起的一種遺傳代謝病——高雪氏?。℅aucher’s disease），其價格要比天然來源的藥物更便宜。

在植物可食部分表達疫苗（被稱為“可食疫苗”或“口服疫苗”，Edible vaccines）是PMP領域的研發(fā)熱點之一。傳統(tǒng)疫苗生產和純化過程較為復雜和昂貴，在運輸和儲存過程中必須冷藏，注射免疫的方式進一步增加了成本，需要專業(yè)人員進行注射接種，存在交叉感染的風險，具有潛在的安全性問題。用轉基因植物生產疫苗則具有可當?shù)胤N植、常溫儲藏的天然優(yōu)勢，將免去或部分免去蛋白純化的花費，摒棄注射方式，也不存在弱毒疫苗毒性恢復的潛在風險。更為重要的是，“可食疫苗”食用后可同時引起粘膜免疫反應與血清免疫反應。在消化道內，植物細胞壁能夠保護疫苗抗原不被消化酶降解，直到腸道微生物降解植物細胞壁后，抗原被釋放出來，引發(fā)免疫反應。表達疫苗或藥用蛋白的植物細胞在凍干后可在室溫保存多年，是產生黏膜免疫的經濟可行的方法。將抗原決定簇蛋白與穿黏膜載體（如霍亂毒素B亞基，CTB；大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基，LTB）融合表達，重組蛋白能夠有效地穿過腸道上皮細胞而進入循環(huán)或免疫系統(tǒng)，可提高抗原運送至免疫系統(tǒng)的效率，促進了口服疫苗的研發(fā)［3］。

2 幾種主要的表達技術系統(tǒng)

2.1 轉基因植株表達

通過農桿菌介導、基因槍等方法將外源基因整合入植物細胞核，可使外源重組蛋白質連續(xù)穩(wěn)定合成。根據(jù)信號肽的有無，表達蛋白可以存儲在不同的細胞器內或分泌至胞外。這種表達方式的優(yōu)點是蛋白質能夠進行完整的翻譯后修飾，但外源基因容易受到基因沉默、位置效應（外源基因的表達因插入位置不同而變化的現(xiàn)象）等的影響，表達量較低，存在轉基因安全性的問題。在目前研發(fā)的產品中，主要受表達量低的因素限制，還沒有通過臨床一期試驗的例子。通過位點特異性同源重組，將外源基因插入植物葉綠體基因組中，可使目標蛋白在葉綠體內積累。植物細胞中葉綠體基因組的數(shù)量可達上萬拷貝，這可極大提高外源基因的表達量。例如，在葉綠體基因組中引入人生長激素基因時，表達量能達到細胞核轉化的百倍以上；通過遺傳改造的表達系統(tǒng)，表達量甚至可高達可溶性蛋白總量的72%［4］。引入葉綠體基因組的外源基因沒有核轉基因中經常發(fā)生的位置效應，也不會發(fā)生基因沉默。在開花前收獲植株，能夠防止通過花粉或種子發(fā)生轉基因漂移。采用多順反子表達的策略，用一個啟動子能夠表達多個外源基因。脊髓灰質炎、瘧疾、肺結核、輪狀病毒、豬流感等多種病毒的抗原都在葉綠體中成功獲得了高表達［5］。

2.2 瞬時表達

以農桿菌接種法（Agroinoculation）或農桿菌滲入法（Agroinfiltration）介導基因瞬時表達是近年來發(fā)展起來的表達技術，是植物遺傳轉化與植物病毒學技術的融合。首先構建攜帶病毒表達載體的農桿菌T-DNA，通常利用花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CMV）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）等作為載體，將重組蛋白基因與病毒衣殼蛋白融合，或用衣殼蛋白啟動子啟動重組蛋白基因。通過植物葉片氣孔注射或真空滲入的方法，使農桿菌進入植物葉片細胞間隙，借助農桿菌侵染作用使病毒DNA載體有效運輸?shù)街参锛毎?。病毒載體在植物細胞中大量復制，幾天之內就能表達大量的外源蛋白，最高表達量可達總可溶蛋白的27.6%。采用農桿菌滲入法瞬時表達可提高表達量，顯著縮短植物處理過程，降低下游成本［6，7］。以病毒基因組為框架的表達載體構建是瞬時表達技術系統(tǒng)的關鍵。煙草花葉病毒和馬鈴薯X病毒載體能夠實現(xiàn)外源基因的大量表達，但由于是RNA病毒，導致同時表達多個蛋白的效率較低；雙生病毒載體表達系統(tǒng)能夠表達較大的外源蛋白；煙草脆裂病毒載體表達系統(tǒng)適用于基因沉默和在植物根部表達。隨著未來研發(fā)的深入，將有望創(chuàng)造出融合不同優(yōu)點的新的病毒表達載體。

2.3 懸浮細胞表達

將農桿菌轉化形成的植株或植物愈傷組織細胞制備成懸浮細胞，能夠較為容易的在發(fā)酵罐中進行擴大生產。2006年美國農業(yè)部批準的第一例禽用新城疫病毒疫苗就采用了煙草懸浮細胞表達系統(tǒng)。2012年FDA批準的首例人用藥用蛋白——葡糖腦苷脂酶是就在胡蘿卜細胞中表達的。此外，還在水稻懸浮細胞中獲得了表達量為5.1 μg/mg的豬流感病毒E2糖蛋白，口服后可引發(fā)小鼠和豬的黏膜免疫與細胞免疫反應。但以該系統(tǒng)生產的產品仍需經過較為復雜的下游純化過程和低溫無菌儲存運輸，其成本相對較高，并沒有完全發(fā)揮出植物生物反應器的優(yōu)越性。

3 轉基因植物表達疫苗與藥用蛋白的代表性研發(fā)案例

迄今為止，一批重組抗體、抗原、疫苗、醫(yī)用或藥用蛋白都在轉基因植物中獲得了表達。除煙草外，生菜、番茄、胡蘿卜、大豆、馬鈴薯、苜蓿、水稻及玉米等植物常被用作表達系統(tǒng)［8］。

3.1 疫苗

首例植物來源的口服疫苗早在1995年即研發(fā)成功，是在煙草和馬鈴薯中表達的大腸桿菌熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基LTB，飼喂小鼠后能夠引起血清IgG和分泌型IgA合成。此后，馬鈴薯塊莖表達的諾如病毒衣殼蛋白VP1、馬鈴薯和玉米表達的大腸桿菌毒素疫苗、水稻表達的霍亂疫苗等都進入了臨床一期試驗，在被試者體內引發(fā)了血清免疫。美國陶氏益農（Dow AgroSciences）公司研發(fā)的新城疫疫苗2006年獲得USDA許可，是獲得許可的第一個植物來源疫苗，然而并沒有實現(xiàn)商業(yè)化生產。

流感病毒血凝素（HA）抗原變異率高，使流感成為威脅世界公共健康最重要的疾病之一。HA是流感病毒表面的糖蛋白，在病毒感染和致病性方面起著關鍵作用，也是引起宿主體內保護性免疫反應的主要抗原。高致病性禽流感H5N1毒株不僅在家禽中引起大流行，也嚴重威脅全球人類健康。為預防畜禽傳染性疾病爆發(fā)，通常需要進行大規(guī)模的免疫接種，植物來源的疫苗為控制禽流感提供了理想的解決方案。在擬南芥中表達禽流感H5N1毒株的HA，可獲得140 μg/g 鮮重的高表達量。葉片凍干后與免疫助劑同時飼喂小鼠，不僅能誘導合成HA特異性的IgA和IgG，還能產生中和抗體并引發(fā)細胞免疫反應，顯示出良好的免疫保護效果［4］。美國Medicago公司生產的H5N1型禽流感疫苗已完成臨床二期試驗。

在一種轉基因牧草Stylosanthes guianensis中表達口蹄疫病毒結構蛋白VP1，將植物原料作為飼料添加劑飼喂小鼠，首次實現(xiàn)了針對口蹄疫的口服免疫。也有研究者在轉基因水稻、煙草、番茄、苜蓿及其他牧草植物中表達口蹄疫病毒的衣殼前體多肽，成功引發(fā)了口服免疫反應［9］。

在番茄根毛系統(tǒng)中表達的狂犬病毒核蛋白能夠在小鼠中引發(fā)免疫反應，并對病毒產生抗性；利用苜?；ㄈ~病毒瞬時表達體系，采用農桿菌滲入法在菠菜中瞬時表達的狂犬疫苗進入臨床一期試驗，能夠在被試者體內產生中和抗體。

植物表達口服疫苗目前面臨的主要技術問題是免疫耐受。常規(guī)注射用疫苗通常要同時使用免疫刺激的助劑，但口服疫苗由于缺乏免疫刺激而影響免疫效果，或產生免疫耐受。不過從另一個方面來看，抗原引起的特異性免疫耐受則為抗過敏口服疫苗提供了一個新的技術途徑。將日本雪松（Japanese cedar）花粉過敏原Cry j1和Cry j2基因在水稻胚乳中表達，給花粉過敏的小鼠飼喂轉基因稻米，在體內引發(fā)免疫耐受，能夠抑制特異性的抗原IgE和細胞因子反應，血清中的組胺合成和打噴嚏等癥狀也得到抑制，表現(xiàn)出抗過敏的效果［10］。然而，自首例植物來源的口服疫苗誕生20余年來，尚沒有一個產品實現(xiàn)產業(yè)化應用。

3.2 抗體

歐洲科學家在轉基因煙草中表達了中和人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的人單克隆抗體2G12，歐盟以2G12作為案例，通過了植物生產重組藥用蛋白的標準化生產規(guī)程，包括植物轉化與篩選、種子庫構建、遺傳穩(wěn)定性的保證、植株均一性、種植與收獲等［11］。德國批準了該轉基因抗體的臨床一期試驗，并未發(fā)現(xiàn)明顯的安全問題。這是首例獲準進入臨床試驗的轉基因植物表達的單克隆抗體，是PMP商業(yè)化進程中里程碑式的事件［12］。

埃博拉病毒引起的埃博拉出血熱是死亡率很高的烈性傳染病。美國Mapp公司研發(fā)了一種名為ZMapp 的試驗性生物藥物，以轉基因煙草表達的3種抗埃博拉病毒的人鼠嵌合單克隆抗體mAbs進行“雞尾酒”療法。2014年8月在線發(fā)表于《Nature》上的一項研究論文中指出，ZMapp治愈了全部18只感染埃博拉病毒的恒河猴；在尚未開展臨床試驗的情況下，同年在利比里亞治愈了2名感染病毒的美國醫(yī)療援助人員，為抗埃博拉藥物研發(fā)帶來了希望［13-14］。

3.3 其他藥物蛋白

許多醫(yī)用或藥用蛋白都在轉基因植物中成功表達，包括人生長激素、血清白蛋白、血紅蛋白、α-干擾素、白介素、促紅細胞生成素、胰蛋白酶抑制劑等。

生菜被認為是生產PMP的理想植物。在轉基因生菜中表達與CTB融合的凝血因子9，在人工控制的環(huán)境和條件下生長，收獲生菜葉片后進行凍干，可獲得約1 mg/g的高表達量。融合蛋白折疊和翻譯后修飾正確，在室溫可保存約2年，飼喂小鼠能夠有效地引發(fā)特異性免疫反應。

Griffithsin（GRFT）是一種來源于紅色海藻、由121個氨基酸組成的外源凝集素，由于具有針對HIV的抗病毒活性而被當做治療艾滋病的候選藥物。GRFT在大腸桿菌中獲得了成功表達，但對于藻類蛋白來說，植物細胞是更為適宜的表達系統(tǒng)。通過農桿菌介導的瞬時表達技術，以改進后的重組煙草花葉病毒作為表達載體，煙草中GRFT表達量可高達60%-90%［7］。

Exendin-4（EX4）是一種有效的促胰島素生成劑，被用作臨床治療II型糖尿病的藥物，但使用中需要低溫儲存和腹部注射。CTB融合的EX4在轉基因植物中表達，口服融合蛋白降低血糖的作用與皮下注射EX4相當［15］。

缺乏α葡萄糖苷酶（Acid alpha glucosidase，GAA）可導致龐培氏?。≒ompe disease），使組織中糖原累積，是引起嬰兒心臟迅速增大的疾病之一。盡管向患者注射重組人GAA的酶替代療法具有臨床療效，但可能在體內產生針對重組GAA的抗體而影響治療效果。在轉基因煙草葉綠體中表達GAA，再以轉基因葉片飼喂疾病模型小鼠，即使很低的劑量也可產生口服免疫耐受，顯著抑制小鼠體內GAA抗體的產生。這一結果顯示轉基因植物表達的藥用蛋白可以借助免疫耐受作用在疾病治療方面發(fā)揮作用［16］。

4 制約PMP產業(yè)化的問題與挑戰(zhàn)

4.1 表達量及均一性控制

口服疫苗可同時引發(fā)黏膜免疫和系統(tǒng)免疫，但與傳統(tǒng)免疫方式相比，在黏膜免疫過程中抗原不穿過上皮細胞，在消化系統(tǒng)中可能會被酸和酶類降解，因此需要高得多的抗原劑量。早期研發(fā)工作中，制約植物疫苗研發(fā)進程的主要因素就是表達量過低，導致下游分離純化過程成本過高。雖然葉綠體表達系統(tǒng)可顯著提升蛋白表達量，但許多植物可食部分缺乏葉綠體，制約了該技術的應用。由此看來，農桿菌介導的瞬時表達法、以生菜為宿主的葉綠體轉化法是具有優(yōu)勢的技術途徑，但是在植物可食部位高表達重組蛋白的技術途徑仍不完善。此外，由于在果實和蔬菜中表達的重組蛋白量難以控制，如果不進行表達產物分離純化的話，需要仔細測定不同植株表達量的差異以確定合理的服用量，這也導致生產成本大幅上升。因此，通過凍干的方式控制計量是一條可行的技術路線。

4.2 蛋白質的翻譯后折疊與修飾

抗原蛋白在翻譯后是否折疊為正確的三維構象并進行正確的二硫鍵、糖基化等修飾，對其抗原活性至關重要。當?shù)鞍踪|三維構象不正確時，細胞內質網中就會啟動降解機制，將蛋白質運至細胞質中進入蛋白酶降解途徑。植物蛋白質的糖基化與哺乳動物不同，植物細胞中蛋白質糖基化發(fā)生在內質網和高爾基體中，N-連接糖基化主要是α（1，3）-海藻糖和β（1，2）-木糖，而哺乳動物主要是α（1，6）-海藻糖和β（1，4）-半乳糖和唾液酸，糖基化修飾的差異可能引發(fā)過敏性反應。因此，要根據(jù)表達產物的來源和特性仔細設計植物表達載體與技術方案，并對重組蛋白的免疫原性和致敏性進行細致檢測［17］。

4.3 免疫耐受

口服免疫耐受是生物體腸道黏膜為避免對食物中的抗原產生炎癥反應的免疫抑制機制，但詳細機理仍不十分清楚。傳統(tǒng)疫苗通過助劑作為致敏因子（Priming）啟動并增強宿主免疫反應，而口服免疫的方式缺乏致敏反應，可能降低免疫反應的效果或引發(fā)免疫耐受，是口服疫苗研發(fā)中必須高度關注的問題。研究顯示，口服抗原的頻率是影響免疫耐受的關鍵因素［16］。這一現(xiàn)象使開發(fā)PMP特別是口服疫苗需要考慮的因素變得更為復雜

4.4 上游和下游的高成本

以植物作為生物反應器生產PMP的核心優(yōu)勢在于成本低廉，但這僅指種植植物的生產成本。通常種植成本只構成總成本的有限部分，而建立適合的技術途徑、優(yōu)化表達載體、獲得轉基因植物等“上游”環(huán)節(jié)和建立良好生產規(guī)范（Good manufacturing practice，GMP）、提取純化表達產物、產物質量控制等“下游”環(huán)節(jié)可能占成本很大的比重。有研究表明，植物表達藥用蛋白的純化成本可占到總成本的65%-95%。采用懸浮細胞系統(tǒng)盡管能簡化表達產物提取純化過程，但生產過程成本又會相應增加，產品也需要低溫無菌儲存和運輸。基于這些綜合性的原因，目前為止PMP研發(fā)工作能夠成功商業(yè)化的比例并不高。

4.5 管理框架缺失

在從實驗室進入批量生產時遇到的主要挑戰(zhàn)，是生產過程的管理需求和表達蛋白的質量控制。與疫苗和藥物生產所需要的高度重復性、標準化和質量控制的需求相比，大田生產植物的過程管理是產業(yè)化中必須考慮的問題。表達藥用蛋白或疫苗的轉基因植物應當以標準化的程序和方式來種植，以保證蛋白持續(xù)穩(wěn)定的表達。到目前為止通過許可的植物來源的治療用蛋白為數(shù)寥寥，針對此的管理框架近年來才初步建立，與哺乳動物細胞和微生物生物反應器相比，相關技術規(guī)程、管理規(guī)定和政策還非常不完善，特別是用完整的植株表達藥用蛋白面臨著更多的管理方面的新問題。

5 展望

針對上述問題與挑戰(zhàn)，未來的技術發(fā)展將更加著眼于開發(fā)出能夠臨床應用的PMP產品，解決當前制約性的關鍵問題。一是通過改進表達技術體系，不斷提高重組蛋白表達量。例如，選擇合適的表達載體與表達系統(tǒng)，使用組織或器官特異性啟動子，優(yōu)化密碼子，采用信號肽將蛋白運送至內質網以促進翻譯后加工等；二是確保翻譯后折疊與修飾。對于分泌蛋白來說，未來需要進一步研究細胞降解未正確折疊蛋白質的分子機理，通過分子手段保證蛋白質正確折疊，提高累積量；三是優(yōu)化疫苗的免疫策略，避免口服免疫耐受。需要在大量實驗研究的基礎上，優(yōu)化抗原遞送方式、服用量與服用頻率，確定合適的抗原組成，可同時服用黏膜助劑，解決好引發(fā)免疫與口服耐受間的關系問題，并保證抗原在消化道內的穩(wěn)定性；四是簡化下游操作。繼續(xù)探索完善在植物可食部分表達重組蛋白的技術手段，實現(xiàn)表達蛋白不純化而直接食用或部分純化，大幅降低生產成本。

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（責任編輯 李楠）

Research and Development Progress on Plant-made Pharmaceuticals

LIU Rong-rong
（Department of Science and Technology Management，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Compared with the traditional production methods，the use of transgenic plants as bioreactor for the production of pharmaceutical proteins and vaccines is considered to be low-cost，safer and more convenient. At present，a number of plant-made pharmaceutical proteins have been approved for commercialization，while a group of plant-made vaccines have entered clinical trials. Research and development of plant-made vaccines and pharmaceutical proteins are reviewed，main problems and challenges are discussed，and the future technology development is prospected.

plant bioreactor；vaccine；pharmaceutical protein；expression system

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0177

2017-03-09

劉蓉蓉，女，博士，研究方向：農業(yè)科技管理；E-mail：liurongrong@caas.cn