溫惠慧，紀(jì)亞忠

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

粒細胞集落刺激因子免疫調(diào)節(jié)胚胎植入的研究進展

溫惠慧，紀(jì)亞忠*

(同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，上海 200065)

免疫因素介入的反復(fù)種植失敗和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)是導(dǎo)致不孕不育的常見原因之一。近年來，應(yīng)用粒細胞集落刺激因子(Granulocyte-Colony Stimulating Factor，G-CSF)改善子宮內(nèi)膜容受性，提高臨床胚胎著床率、降低復(fù)發(fā)性流產(chǎn)逐漸成為相關(guān)研究熱點。本文從其作用機制和臨床應(yīng)用兩個方面對G-CSF在輔助生殖醫(yī)學(xué)中的最新研究進展，進行了綜述。

粒細胞集落刺激因子； 復(fù)發(fā)性流產(chǎn)； 反復(fù)種植失敗

(JReprodMed2017，26(7)：730-734)

一、概述

成功妊娠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是胚胎成功著床。但目前，無論是自然妊娠還是體外受精-胚胎移植(IVF-ET)，不明原因的胚胎著床失敗(RIF)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)發(fā)生率仍較高，研究表明其發(fā)病因素繁多，在排除遺傳發(fā)育、生殖系統(tǒng)畸形、高育齡等因素后仍有部分女性患者無法成功受孕。早期妊娠失敗，如RSA，林其德等[1]建議將RSA分為2類6型，即免疫類(同種免疫型和自身免疫型)和非免疫類(染色體異常型、解剖異常型、內(nèi)分泌紊亂型、感染型)。對于成功妊娠免疫因素尤為重要，生殖道特別是子宮局部的免疫細胞能否識別并耐受胚胎抗原直接影響了妊娠的建立和維持。粒細胞集落因子(G-CSF)是正常妊娠生理過程中調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜免疫細胞功能的重要細胞因子之一，在母體與胚胎之間的交流中有著重要的調(diào)節(jié)作用。妊娠，作為一種同種異體移植，不僅需要母體免疫系統(tǒng)不產(chǎn)生排斥作用耐受半同種移植物的胎兒，還需要早孕期細胞滋養(yǎng)細胞在該過程中發(fā)揮獨特的生物學(xué)功能：如高增殖能力，甚至類似惡性腫瘤細胞的侵襲能力[2]。研究證實，G-CSF 可刺激自然移植物的細胞滋養(yǎng)細胞增殖并抑制其凋亡，在G-CSF 的作用下滋養(yǎng)細胞偽足增多、變長，侵襲能力增強[3]。因此G-CSF對母-胎界面具有雙向調(diào)節(jié)作用，即對免疫細胞具有抑制作用，而對滋養(yǎng)細胞生物學(xué)功能則具有促進作用。

目前IVF-ET中單個移植周期的妊娠率約50%，累計妊娠率已達80%左右，但仍有近10%的女性患者經(jīng)過多個周期種植后仍未受孕，通常稱之為反復(fù)種植失敗[4]。導(dǎo)致種植失敗的原因除了胚胎本身質(zhì)量外，子宮內(nèi)膜容受性也起著關(guān)鍵作用。即使是高質(zhì)量的胚胎，其胚胎植入率也僅有20%～30%左右[5]。研究已證明，G-CSF通過影響基因的表達調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)控及細胞粘附系統(tǒng)，使其發(fā)生一系列改變，最終形成能夠接受胚胎著床的一種綜合狀態(tài)，包括子宮內(nèi)膜厚度、腔上皮、腺上皮、間質(zhì)的發(fā)育狀態(tài)及子宮內(nèi)膜的血流灌注情況[6]。

二、G-CSF簡介

1.G-CSF的來源及分布：G-CSF是常見的內(nèi)源性造血生長因子，廣泛作用于骨髓微環(huán)境，刺激血細胞再生。G-CSF可選擇性促嗜中性粒細胞祖細胞增殖分化，通過促進吞噬氧化發(fā)揮其功能。1983年從小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)并提純了GSF，隨后人源G-CSF(hG-CSF)于1986年克隆成功[7]。hG-CSF是一種小分子糖蛋白，包括 5個外顯子和4個內(nèi)含子，其分子量約為19 600，長約2.25 kd。G-CSF體內(nèi)來源廣泛，最早發(fā)現(xiàn)于造血細胞中的單核巨噬細胞系[8]，后發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞、間皮細胞、成纖維細胞、血小板等非造血細胞及惡性腫瘤中也存在G-CSF及其受體的表達[9-10]。正常情況下，人體血清中G-CSF的含量很低，應(yīng)激情況下可顯著增高[11]。

2.粒細胞集落刺激因子受體(G-CSFR)的來源及分布：hG-CSF的生物活性通過細胞表面的特異性G-CSFR來調(diào)節(jié)。G-CSFR為高親和力受體，主要存在于骨髓中，也表達在中性粒細胞、胎盤細胞、內(nèi)皮細胞和髓系白血病細胞系如HL-60細胞等[12-13]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)5種不同類型的G-CSFR的異構(gòu)體，由不同的RNA剪接方式產(chǎn)生，但各種變構(gòu)體的生物學(xué)作用及其表達的調(diào)控目前仍不十分明確。G-CSF與血細胞表面G-CSFR結(jié)合發(fā)揮作用，刺激粒系母細胞增殖和分化，在增加成熟粒細胞功能的同時刺激骨髓造血干細胞增殖分化，并刺激骨髓細胞釋放進入外周血。除了促進粒系母細胞生長增殖作用外，G-CSF也可促進損傷內(nèi)膜中性粒細胞和單核細胞吞噬、運動、殺菌活性及表面分子的表達[14]。

三、G-CSF對胚胎種植與子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)作用

1.滋養(yǎng)層細胞系細胞因子的表達與胚胎植入：胚胎來源的滋養(yǎng)層細胞向母體子宮內(nèi)膜的遷移、浸潤是正常胚胎植入以及胎盤形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由于G-CSFR主要存在于胎盤組織和滋養(yǎng)層細胞，因此推測G-CSF可能具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞和早期妊娠的作用[15]。有研究表明G-CSF通過激活PI3K/Akt和Erk1/2信號通路來提高人滋養(yǎng)層細胞系基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的活性以及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的分泌[16]。此外G-CSF還可通過以下機制和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞系的遷移、侵襲，參與胚胎的植入：(1)G-CSF通過提高細胞運動性參與滋養(yǎng)層細胞遷移，將滋養(yǎng)層細胞置于含有G-CSF的培養(yǎng)基中孵化9 h，滋養(yǎng)層細胞出現(xiàn)前端伸出偽足、細胞體收縮、細胞尾端和周圍基質(zhì)黏著解離等遷移表型轉(zhuǎn)變現(xiàn)象[3]；(2)細胞入侵過程中，整合素聯(lián)系著胞外基質(zhì)與肌動蛋白的α/β異二聚體膜受體，對細胞骨架重塑起著支配作用[17]。隨著胎盤絨毛外滋養(yǎng)層細胞向母體子宮蛻膜層和肌層血管入侵時，細胞呈現(xiàn)α6β4整合素表達的下調(diào)，同時α5β1、αvβ1、αvβ3及α1β1整合素表達上調(diào)[18-19]?；诖耍瑢嶒灠l(fā)現(xiàn)在含有G-CSF的培養(yǎng)基中，G-CSF可大大促進滋養(yǎng)層細胞β1亞基的表達，激活P38，Erk1/2和PI3K信號通路對β1整合素的表達進行調(diào)控[3]；(3) 促分裂素原活化蛋白激酶鏈(MAKP)是真核生物信號傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，具有調(diào)控細胞增殖、分化、遷移及侵襲的生物學(xué)作用。MAPK主要有四個亞族：Erk、JNK、p38、Erk5。G-CSF通過PI3K介導(dǎo)的磷酸化作用活化滋養(yǎng)層細胞Erk1/2MAPK信號通路，調(diào)節(jié)MMP-2的活性和VEGF分泌[16]，同時也作用于p38信號通路[3]，從而促進滋養(yǎng)層細胞系的遷移、侵襲。以上實驗表明G-CSF可作為母胎界面表達的因子之一促進胚胎植入和胎盤形成。

2.母體內(nèi)膜淋巴細胞因子與胚胎植入：母體免疫系統(tǒng)功能受一系列細胞因子的調(diào)節(jié)，在胚胎種植過程中及妊娠早期，來自母體內(nèi)膜淋巴細胞和胚胎滋養(yǎng)層細胞的多種因子參與了母體對胚胎免疫耐受的調(diào)節(jié)。子宮內(nèi)膜中的 T 細胞主要分布于功能層，包含豐富的 T 細胞亞群。CD4+T 細胞激活后按分泌細胞因子譜分為 Th1 型和 Th2 型兩個功能亞群。Th1 型細胞介導(dǎo)細胞免疫，主要分泌 白介素-2(IL-2)、干擾素-γ、腫瘤壞死因子-β(TNF-β)等細胞因子。Th2 型細胞介導(dǎo)體液免疫，主要分泌 IL-4、IL-6、IL-10 等因子。大量研究表明Th1 型細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答不利于妊娠，而Th2 型細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答可以改善這種狀態(tài)，正常妊娠是一種Th2 偏移現(xiàn)象[20]。體內(nèi)外實驗證實，G-CSF 可以誘導(dǎo) CD4+和 CD8+T 細胞表達 G-CSFR，且呈時間依賴性；G-CSF 重復(fù)刺激能維持 G-CSFR在 CD4+T 細胞上的表達[21]，這可能是 G-CSF 對 T 細胞免疫調(diào)節(jié)的重要機制之一。G-CSF 抑制 T 細胞的異種反應(yīng)性，使 T 細胞處于免疫低反應(yīng)狀態(tài)。G-CSF 可以誘導(dǎo) T細胞的應(yīng)答不足并促進T細胞由Th1 型向 Th2 型分化[22]。高明霞[23]研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜G-CSF可以激發(fā)G-CSFR的表達，IL-1、VEGFE、整合素β、白血病抑制因子、TNF-α等細胞因子的表達，降低IL-2的表達，從而促進內(nèi)膜修復(fù)，改善子宮內(nèi)膜容受性。

3.子宮內(nèi)膜相關(guān)基因的表達與胚胎植入：將體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細胞暴露于G-CSF環(huán)境中，探究與胚胎植入過程有關(guān)的子宮內(nèi)膜相關(guān)基因表達的差異。結(jié)果提示G-CSF可通過影響以下基因的表達來調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜血管重塑、局部免疫調(diào)控及細胞粘附系統(tǒng)：(1)TYMP，作為血小板衍化內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)，其作用主要是通過調(diào)節(jié)整合素的表達促進血管形成及細胞遷移[24]。研究表明，在RIF和RSA患者的子宮內(nèi)膜中，TYMPmRNA表達下調(diào)[25]；(2)磷酸化整合素B3 (ITGB3)是人和動物體內(nèi)重要的子宮內(nèi)膜黏附分子[26]，在大劑量的G-CSF培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)子宮內(nèi)膜組織，發(fā)現(xiàn)有大量ITGB3的表達，高度提示了該因子在細胞遷移及胚胎種植過程中的作用[27]，但RIF/RSA與對照組間無統(tǒng)計學(xué)意義[25]；(3)尿激酶型纖溶酶原激活物受體(PLAUR)，是細胞遷移、增殖分化、重塑組織的重要因子[28]，在不同月經(jīng)周期子宮內(nèi)膜中的表達存在動態(tài)差異，一般表達于早期胎盤組織，特別是子宮內(nèi)膜自然殺傷細胞表面[29]。尿激酶纖維蛋白溶酶激活劑(uPA)表達高低與葡萄胎、先兆子癇等滋養(yǎng)層細胞相關(guān)妊娠疾病有關(guān)。其信號通路需要整合素，包括ITGB3的參與[28]。在RSA患者中發(fā)現(xiàn)，ITGB3/PLAURmRNA表達比值顯著下降。而將子宮內(nèi)膜暴露于含有大劑量G-CSF培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，子宮內(nèi)膜PLAUR mRNA表達顯著提高，而在對照組中未發(fā)生明顯變化[25]。故該實驗表明可考慮將相關(guān)子宮內(nèi)膜因子表達缺陷列入應(yīng)用G-CSF適應(yīng)癥范疇。

四、G-CSF在生殖領(lǐng)域治療現(xiàn)狀

G-CSF在研究中主要用于治療不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、IVF-ET反復(fù)著床失敗。

1.G-CSF應(yīng)用于復(fù)發(fā)性流產(chǎn)：2009年Scarpellini 和 Sbracia[30]首次提出對患有RSA的夫婦使用基因重組的集落生長因子(rG-CSF)。該研究對前期靜脈注射免疫球蛋白治療失敗的68名不明原因RSA的婦女進行隨機對照試驗。治療組35位婦女經(jīng)皮注射Filgrastim (Neupogen，Dompe，Italy)，治療劑量 1 μg (100 000 IU)/kg/d。對照組33位婦女經(jīng)皮注射生理鹽水，治療時間同治療組。研究中所有婦女在三個月內(nèi)均自然受孕。治療組及對照組活產(chǎn)率分別為(82.8%：48.5%，P<0.01)。治療組在孕期有相對較高水平的HCG。治療組一例皮疹、兩例白細胞增多(白細胞計數(shù)>25×109/L)，對照組一例妊娠高血壓。兩組在流產(chǎn)孕周和新生兒出生體重方面無差異且沒有先天畸形病例報道。在23位流產(chǎn)患者中，對14位患者的妊娠組織進行基因檢測，治療組一例、對照組兩例發(fā)現(xiàn)基因異常。

2013年，Santjohanser 等[31]對IVF且有RSA史的患者(至少有兩次早期流產(chǎn))進行G-CSF的有效性評估，127位患者共199個周期納入研究?；颊弑浑S機分為三組：G-CSF治療組，其他藥物治療組及對照組。所有研究對象均口服葉酸和陰道塞黃體酮栓劑(600 mg/d，黃體期開始至孕后12周)。結(jié)果顯示采用G-CSF治療組有較好的妊娠結(jié)局，妊娠率和活產(chǎn)率分別為47%、32%。與G-CSF治療組相比，采用其他藥物治療組妊娠率和活產(chǎn)率分別為27%、14%，不采用藥物治療組妊娠率和活產(chǎn)率分別為24%、13%[31]]。兩個實驗采用不同的方案來評估G-CSF對RSA患者臨床結(jié)局的有效性，均顯示可降低流產(chǎn)率[30-31]。也有數(shù)據(jù)顯示G-CSF參與了卵泡發(fā)育，可能是IVF結(jié)局的預(yù)測因子[32]。然而，使用G-CSF對何種癥狀是否真正有益依然有待探討。

2.G-CSF應(yīng)用于 IVF-ET反復(fù)著床失?。?011年Gleicher 等[33]首次報道應(yīng)用rG-CSF治療薄型子宮內(nèi)膜，對4名不孕婦女(年齡在33～45歲)在胚胎移植當(dāng)日通過宮腔內(nèi)導(dǎo)管給藥rG-CSF [30 MU (300 μg/1 ml)]。結(jié)果提示，用藥后患者子宮內(nèi)膜厚度顯著增加且4例患者全部妊娠，除外一名異位妊娠。因此，胚胎移植當(dāng)日，對于薄型子宮內(nèi)膜患者，使用G-CSF 改善了患者妊娠率。

隨后，2013年Gleicher 等[34]對21名IVF治療失敗(平均2.0±2.1 (0～9) 個周期)的患者(年齡為 40.5±6.5 歲)進行了超過18個月的前瞻性觀察隊列研究，部分患者診斷為卵巢儲備功能下降 [16/21 (76.2%)]。這些患者HCG日的子宮內(nèi)膜厚度均不超過7 mm。在HCG日的前6～12 h通過宮腔內(nèi)導(dǎo)管注入G-CSF，若內(nèi)膜在給藥后的48 h內(nèi)未增至7 mm，則在取卵后再次給藥。其中3名患者需要再次給藥。經(jīng)陰道超聲測量子宮內(nèi)膜厚度。結(jié)果顯示，從宮腔內(nèi)灌注G-CSF到胚胎移植的過程中，內(nèi)膜厚度自(6.4±1.4)mm增至(9.3±2.1)mm(P<0.01)并獲得19.0%的臨床妊娠率。結(jié)果表明，對于薄型子宮內(nèi)膜患者，HCG日使用G-CSF 改善了患者妊娠率。雖然G-CSF對改善子宮內(nèi)膜厚度有正向作用，但由于這項研究的局限性，例如小樣本、無隨機對照組以及入組病例未經(jīng)嚴(yán)格篩選第一次行IVF治療的不孕婦女，因此仍無法科學(xué)評價G-CSF對改善IVF臨床妊娠率的有效性。

最近，Aleyasin等[35]對112名IVF反復(fù)著床失敗的不孕患者進行多中心、隨機對照實驗，對G-CSF改善IVF臨床結(jié)局的有效性進行評估。研究對象均采用長方案，在胚胎植入1 h前，治療組56名患者皮下注射 300 μg G-CSF，對照組不采取任何治療。黃體支持均采用天然黃體酮陰道栓劑 (2 次/d)以及80 mg阿司匹林。結(jié)果顯示，治療組及對照組移植率 (18% vs.7.2%，P=0.007)、生化妊娠率 (44.6% vs.19.6%，P=0.005)及臨床妊娠率 (37.5% vs.14.3%，P=0.005)，治療組明顯高于對照組。該實驗首次評估了全身性使用G-CSF對 IVF反復(fù)失敗患者的有效性，與宮腔灌注相比，操作簡單、易接受且成本更低。但因未建立對照組，尚需要更多的隨機對照試驗進行證實，并進一步探索其最佳臨床應(yīng)用途徑與劑量。

五、總結(jié)

G-CSF作為預(yù)防RSA和RIF的新型免疫治療方法之一，雖然其中的某些治療方法可以有效提高臨床妊娠率，但是仍需高質(zhì)量的大樣本隨機雙盲對照研究證明其有效性，進而明確真正受益的群體、最佳的給藥劑量、給藥時間、最佳給藥途徑(皮下還是宮腔灌注)，也亟待制定規(guī)范的治療方案、嚴(yán)格的適應(yīng)證及相關(guān)禁忌癥。

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[編輯：谷炤]

Research progress in effect of granulocyte colony-stimulating factor on immune regulation in embryo implantation

WENHui-hui，JIYa-zhong*

DepartmentofAssistedReproduction，theaffiliatedTongjiHospitalofTongjiUniversity，Shanghai200065

It is a common cause of infertility that immune factors involve repeated implantation failure and recurrent abortion.In recent years，it is become a research hotspot that granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is applied for improving clinical embryo implantation rate，reducing recurrent miscarriage and improving endometrial receptivity.This paper reviews the latest research progress of application of G-CSF in assisted reproductive technology from two aspects of mechanism and clinical application.

G-CSF； Recurrent spontaneous abortion； Repeated implantation failure

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.07.022

2016-11-23；

2017-02-23

溫惠慧，女，江西贛州人，碩士研究生，生殖醫(yī)學(xué)專業(yè).(*

，Email：jiyazhong@hotmail.com)