馬曉媛，俞 瑾，馬海平，伊利亞爾·買買提力，鄭 宏，王 江

·基礎研究·

轉化生長因子－β1預處理調(diào)控缺氧誘導因子－1α蛋白表達水平對心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響

馬曉媛，俞 瑾，馬海平，伊利亞爾·買買提力，鄭 宏，王 江

目的 探討轉化生長因子－β1(TGF－β1)預處理調(diào)控缺氧誘導因子－1α(HIF－1α)的蛋白表達水平是否可以影響心肌細胞缺氧/復氧損傷。方法 建立心肌細胞株H9C2缺氧/復氧損傷模型及缺氧預處理模型，將H9C2心肌細胞隨機分為5組:正常對照組(Control組)、缺氧復氧組(H/R組)、缺氧預處理組(HPC組)，TGF－β1預處理組(TGF－β1－Pre組)、TGF－β1抑制劑組(SB431542組)，各組復氧結束后測定培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)活性、HIF－1α蛋白表達水平、心肌細胞凋亡率。結果Control組、H/R組、HPC組、TGF－β1－Pre組、SB431542組的LDH活性(U/L)分別為(201.2±48.9)、(936.6±93.7)、(727.0± 75.9)、(747.3±63.1)、(957.3±55.3);心肌細胞凋亡率(%)分別為(25.5±3.2)、(71.8±5.5)、(42.8±6.1)、(54.1±4.1)、(82.8 ±9.7)，與H/R組比較，HPC組、TGF－β1－Pre組的LDH活性、心肌細胞凋亡率顯著降低(P＜0.05)，HIF－1α蛋白表達水平升高(P＜0.05);與HPC組比較，TGF－β1－Pre組各項指標差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結論 不論在常氧條件還是在缺氧環(huán)境下，TGF－β1均可以增加HIF－1α的蛋白表達水平，并且在缺氧復氧誘導所致的心肌細胞損傷中發(fā)揮抗凋亡作用，這種作用與調(diào)控HIF－1α的蛋白水平有關。

轉化生長因子－β1;缺氧/復氧損傷;缺氧誘導因子－1α;預處理

圍術期心肌缺血/再灌注損傷發(fā)生率較高［1］，并且預后不佳，占術后院內(nèi)患者死亡原因的17%～27%［2］。由Murry提出的缺血預處理是心肌保護中最為有效的內(nèi)源性保護措施［3］，其中缺氧誘導因子－1(Hypoxia inducible factor－1，HIF－1)在缺血的適應性反應中起核心作用［4］。因此，促使HIF－1的氧調(diào)節(jié)蛋白HIF－1α(Hypoxia inducible factor－1α，HIF－1α)的穩(wěn)定表達，可能成為圍術期對抗心肌缺血/再灌注損傷的有效策略［5］。但由于缺血預處理或者缺氧預處理在臨床實施方面的局限性，有研究使用藥物干預發(fā)揮心肌保護作用［6］。有研究結果顯示，許多生長因子可調(diào)節(jié)HIF－1α的穩(wěn)定性，其中轉化生長因子－β1(Transforming growth factor－β1，TGF－β1)作為一種分泌型多肽類生長因子，在牙周膜細胞及腫瘤細胞中可增強HIF－1α的穩(wěn)定性［7－8］。因此，本研究以TGF－β1穩(wěn)定HIF－1α的蛋白水平為切入點，探討TGF－β1預處理對心肌細胞缺氧/復氧(hypoxia/reoxgenation，H/R)損傷的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 胚胎大鼠心臟來源的細胞系H9C2心肌細胞購自于中國科學院上海生命科學研究院; HIF－1α抗體、驢抗兔辣根過氧化物酶標記的IgG二抗、重組人TGF－β1、SB431542、ECL顯色試劑盒均購自Thermo公司;GAPDH抗體購自博士德生物工程有限公司;乳酸脫氫酶(LDH)測試盒購自南京建成生物工程研究所;Tunel試劑盒購自Roche公司。

1.2 H9C2心肌細胞的培養(yǎng) 將凍存復蘇后的H9C2心肌細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，在37℃恒溫培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣)培養(yǎng)。1～2天換液一次，實驗時取對數(shù)生長期細胞進行干預，干預前用無血清M199培養(yǎng)液饑餓細胞12 h同步化。

1.3 實驗分組

1.3.1 不同干預條件下的分組 ①不同濃度的TGF－β1干預:根據(jù)參考文獻的干預時間［7］，將心肌細胞隨機分為4組(n=6)。分別給予不同濃度0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L的TGF－β1進行干預8 h;②不同時間的TGF－β1干預:將心肌細胞隨機分為6組(n=6)。給予5μg/L的TGF－β1分別干預2 h、4 h、8 h、10 h、16 h、24 h;③TGF－β1在常氧或缺氧條件下干預:將心肌細胞隨機分為4組(n =6)。空白對照組:正常培養(yǎng)細胞不做任何干預; TGF－β1干預組:給予5μg/L的TGF－β1培養(yǎng)10 h;單純?nèi)毖踅M:在95%N2+5%CO2的混合氣體的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)10 h;TGF－β1干預組+缺氧:給予5μg/L的TGF－β1后放入95%N2+5%CO2混合氣體的培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)10 h。

1.3.1 總實驗分組 將心肌細胞隨機分為5組(n= 6)。①正常對照組(Control組);②H/R組:根據(jù)參考文獻造模［9］，缺氧培養(yǎng)4 h，復氧培養(yǎng)2 h，構建H9C2心肌細胞H/R損傷模型;③缺氧預處理組(HPC組):根據(jù)參考文獻造模［10］，缺氧培養(yǎng) 10 min，復氧培養(yǎng)30 min，重復3次后，在此基礎上構建H9C2心肌細胞H/R損傷模型;④TGF－β1預處理組(TGF－β1－Pre組):給予5μg/L的TGF－β1干預10 h，在此基礎上構建H9C2心肌細胞H/R損傷模型;⑤TGF－β1抑制劑干預組(SB431542組):給予10μM SB431542干預30 min后，給予5μg/L的TGF－β1干預10 h，在此基礎上構建H9C2心肌細胞H/R損傷模型。

1.4 檢測指標

1.4.1 Western blot檢測HIF－1α蛋白表達水平各組細胞干預結束后，裂解并提取各組細胞中總蛋白，測定細胞中總蛋白濃度。取30μg總蛋白于8%SDS－PAGE凝膠電泳，電泳結束后轉至PVDF膜，封閉2 h后，分別孵育HIF－1α單抗及內(nèi)參GADPH一抗于4℃過夜，洗去一抗，用二抗孵育2 h，PVDF膜用ECL化學發(fā)光法顯影，并放入凝膠掃描系統(tǒng)曝光拍照。運用Image Lab軟件計算分析各目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白條帶的灰度比值表示蛋白相對表達量。

1.4.2 LDH活性的測定 嚴格按照試劑盒說明書進行操作，各組干預結束后測定心肌細胞培養(yǎng)液中的LDH活性。

1.4.3 Tunel法測量各組細胞凋亡率 根據(jù)凋亡試劑盒檢測各組細胞凋亡率，用Image Pro Plus軟件分析圖像。

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(±s)表示，多個樣本比較在方差齊性檢驗的基礎上作單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Tukey＇s多重比較，以P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度的TGF－β1對HIF－1α蛋白表達的影響 1μg/L組、5μg/L組、10μg/L組與Control組相比，HIF－1α的蛋白表達均顯著升高(P＜0.05);5 μg/L組、10μg/L組與1μg/L組相比，HIF－1α的蛋白表達均顯著升高(P＜0.05);5μg/L組與10 μg/L組比，HIF－1α的蛋白表達未見明顯差異(P＞0.05)，見圖1。

圖1 不同濃度的TGF－β1對HIF－1α蛋白表達的影響(n=6)

2.2 5μg/L TGF－β1影響HIF－1α蛋白表達的時間依賴性 與10 h相比，其他時間點HIF－1α的蛋白表達均降低(P＜0.05)，但TGF－β1在干預第10 h時，HIF－1α蛋白表達最高，見圖2。

圖2 5μg/L TGF－β1影響HIF－1α蛋白表達的時間依賴性(n=6)

2.3 TGF－β1在常氧或缺氧條件下對HIF－1α蛋白表達影響的比較 在常氧條件下，TGF－β1干預與空白對照組相比，HIF－1α的蛋白表達增加(P＜0.05);在缺氧條件下，TGF－β1干預較未給予干預組HIF－1α的蛋白表達增加(P＜0.05)，見圖3。

2.4 各實驗分組對HIF－1α蛋白表達的影響 與Control組相比，H/R組、HPC組、TGF－β1－Pre組、SB431542組HIF－1α蛋白表達上調(diào)(P＜0.05);與H/R組相比，HPC組、TGF－β1－Pre組HIF－1α蛋白表達上調(diào)(P＜0.05)，但SB431542組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與HPC組相比，TGF－β1－Pre組、SB431542組差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖4。

圖3 TGF－β1干預在常氧或缺氧條件下對HIF－1α蛋白表達影響的比較(n=6)

圖4 各實驗分組對HIF－1α蛋白表達水平的影響(n=6)

2.5 各實驗組培養(yǎng)液LDH活性 與Control組相比，H/R組、HPC組、TGF－β1－Pre組、SB431542組培養(yǎng)液LDH活性升高(P＜0.05);與H/R組相比，HPC組、TGF－β1－Pre組培養(yǎng)液的LDH活性降低(P＜0.05)，SB431542組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05); HPC組與TGF－β1－Pre組、SB431542組差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖5。

圖5 各組間細胞培養(yǎng)液LDH活性的比較(n=6)

2.6 TUNEL法熒光標記的細胞凋亡率 與Control組相比，H/R組、HPC組、TGF－β1－Pre組、SB431542組細胞凋亡率均增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與H/R組相比，HPC組、TGF－β1－Pre組細胞凋亡率降低(P＜0.05)，但SB431542組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);與HPC組相比，TGF－β1－Pre組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見圖6，圖7。

圖6 各組間細胞凋亡率(%)的比較(n=6)

3 討論

在缺氧預處理過程中，HIF－1α的表達量明顯增加，并且HIF－1α在其心肌保護效應中發(fā)揮著中心作用［11］。許多研究表明，除了依賴氧濃度調(diào)節(jié)外，一些非缺氧因素同樣會增加HIF－1α蛋白水平的表達。常氧條件下，在不同的細胞系如人肝癌細胞、纖維肉瘤細胞，給予TGF－β1刺激后，HIF－1α的蛋白表達水平增高，其機制與TGF－β1降低脯氨酸羥化酶的表達水平從而增加HIF－1α的穩(wěn)定性有關［7］。因此，本研究以TGF－β1穩(wěn)定HIF－1α的蛋白表達為切入點，觀察TGF－β1干預在心肌細胞H/ R誘導的心肌損傷中的作用。研究發(fā)現(xiàn)TGF－β1預處理與缺氧預處理組相比同樣可以增加HIF－1α的蛋白水平，并且與H/R組相比培養(yǎng)液LDH活性及細胞凋亡率明顯降低，說明TGF－β1預處理在心肌細胞H/R誘導的心肌損傷中發(fā)揮抗凋亡作用。

HIF－1是缺血或缺氧損傷后內(nèi)源性保護機制的始動因子，是誘導心肌保護分子機制的關鍵因素，其調(diào)控的靶基因有130余種，這些靶基因可參與血管新生、細胞分化/生存、紅細胞合成、調(diào)節(jié)糖代謝、氧轉運等機體對缺血缺氧的適應性反應［12］。HIF－1α是HIF－1的氧調(diào)節(jié)蛋白，在常氧狀態(tài)下HIF－1α的半衰期非常短，只有5 min，很快被降解［13］。但在缺氧條件下，通過抑制脯氨酸羥化酶的活性阻斷泛素蛋白酶體途徑而使HIF－1α穩(wěn)定表達，與HIF－1的基礎表達蛋白HIF－1β結合，最終調(diào)控相關靶基因，使細胞及組織適應缺氧的環(huán)境［14］。

圖7 熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡率(×40)(n=6)

為探索在H9C2心肌細胞中，如何給予TGF－β1干預可以達到最佳的干預效果，筆者使用了不同的干預濃度及干預時間，雖然10μg/L增加HIF－1α蛋白水平較5μg/L高，但無統(tǒng)計學差異。使用不同時間點干預發(fā)現(xiàn)在10 h時，HIF－1α蛋白水平最高。因此可認為使用5μg/L的干預劑量，10 h的持續(xù)干預時間可達到最佳干預條件。

在缺氧條件下，HIF－1α降解受阻可以穩(wěn)定表達。缺氧時給予TGF－β1刺激，TGF－β1增加HIF－1α的表達是否會被缺氧掩蓋?本研究在缺氧條件下同時給予TGF－β1干預，發(fā)現(xiàn)在低氧環(huán)境下，當TGF－β1刺激心肌細胞時，在增加HIF－1α的蛋白穩(wěn)定性方面可產(chǎn)生疊加效應。筆者推斷，其原因可能與脯氨酸羥化酶的活性有關，機制尚待進一步研究。

TGF－β1作為TGF－β超家族成員之一，是一種多功能的生長因子，它在免疫調(diào)節(jié)、胚胎的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的形成與發(fā)展、炎癥反應、創(chuàng)傷愈合等方面具有重要的作用［15］。盡管TGF－β1在許多細胞中具有促凋亡作用，但被證實TGF－β1在心臟再灌注損傷方面可發(fā)揮心肌保護作用［16］，在體內(nèi)和體外都可以產(chǎn)生抗損傷作用［17］。TGF－β1產(chǎn)生細胞信號內(nèi)轉導發(fā)揮作用不僅通過經(jīng)典信號通路即Smad信號通路，也包括非典型信號通路ERK1/2及PI3KAKT的激活［18－19］。筆者發(fā)現(xiàn)，TGF－β1減少心肌細胞H/R損傷的凋亡，這個作用可以被抑制I型受體活化素受體樣激酶ALK5的抑制劑SB431542所減弱，ALK5具有識別Smad2和Smad3，并且誘導其增多并磷酸化的作用。因此TGF－β1預處理在H/R誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮抗凋亡可能通過Smad信號通路發(fā)揮作用。與研究報道的TGF－β1依賴的Smad信號通路的激活與TGF－β1介導的抗H/R損傷誘導的凋亡保護作用相一致［20］。

總的來說，本研究結果表明，不論在常氧條件還是在缺氧環(huán)境下，TGF－β1均可以增加HIF－1α的蛋白表達水平，并且可以在H/R誘導的心肌細胞損傷中發(fā)揮抗凋亡作用，這種作用與調(diào)控HIF－1α的蛋白水平有關。這為圍術期心肌缺血再灌注損傷的治療提供了新的研究思路。

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Effects of hypoxia inducible factor－1 alphamediated by transform ing grow th factor beta 1 pre－conditioning on hypoxia/reoxgenation injury of cardiomyocytes

Ma Xiao－yuan，Yu Jin，Ma Hai－ping，Ilyar Mamtili，Zheng Hong，Wang Jiang
Department of Anesthesiology，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，xinjiang Urumqi 830054，China

Wang Jiang，Email:710985359@qq.com

Objective To investigate whether the HIF－1αprotein level regulated by TGF－β1 preconditioning can affect the cardiomyocytes hypoxia/reoxgenation－induced injury of cardiomyocytes.M ethods H9C2 cardiomyocyteswere used to establish hypoxia/reoxgenation－induced injurymodel.Cardiomyocyteswere randomly divided into five groups:controlgroup(Control)，hypoxia/reoxgenation group(H/R)，hypoxic preconditioning group(HPC)，TGF－β1 preconditioning group(TGF－β1－Pre)，TGF－β1 inhibitor group(SB431542).Lactic dehydrogenase(LDH)activity，HIF－1αprotein content and cardiomyocytes apoptosis rate weremeasured at the end of the reperfusion.Results The LDH activity of Control group，H/R group，HPC group，TGF－β1－Pre group，SB431542 group were(201.2±48.9)U/L，(936.6±93.7)U/L，(727.0±75.9)U/L，(747.3±63.1)U/L，(957.3±55.3)U/L，respectively.The cell apoptosis rate of Control group，H/R group，HPC group，TGF－β1－Pre group，SB431542 group were(25.5±3.2)%，(71.8 ±5.5)%，(42.8±6.1)%，(54.1±4.1)%，(82.8±9.7)%，respectively.The LDH activity and cell apoptosis rate in HPC group and TGF－β1－Pre group were both decreased compared with that in H/R group，meanwhile accompanied by increased HIF－1αprotein content(P＜0.05).There was no significantly difference between HPC group and TGF－β1－Pre group.Conclusion TGF－β1 could increase the expression levelof HIF－1αprotein nomatter in normoxia or hypoxia circumstance，TGF－β1 exertantiapoptotic effect in hypoxia/reoxgenation－induced injury of cardiomyocytes，which is associated with themodulation of HIF－1α.

Transforming growth factor－β1;Hypoxia/reoxgenation injury;Hypoxia inducible factor－1α;Pre－conditioning

2016-10-09)

2016-10-28)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.13

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金面上項目(2014211C038)

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科

王江，Email:710985359@qq.com