馮穎達(dá)，馮建宇，楊 陽，狄守印，張 偉，陸云陽，湯海峰，朱艷榮

·基礎(chǔ)研究·

PKCε信號通路介導(dǎo)甘青鐵線蓮活性成分APG抗心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

馮穎達(dá)，馮建宇，楊 陽，狄守印，張 偉，陸云陽，湯海峰，朱艷榮

目的 研究不同濃度甘青鐵線蓮活性成分APG對H9C2大鼠心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞，經(jīng)2μM/L和4μM/L的APG預(yù)處理24 h后，建立缺氧復(fù)氧損傷模型(I/R)(缺氧45 min，復(fù)氧3 h)。采用CCK－8法檢測細(xì)胞活力，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量、丙二醛(MDA)的釋放量和細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)的活力;采用Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶Cε(PKCε)、Caspase－3、Bax和Bcl－2表達(dá)情況，使用特異性PKCε抑制劑CHE觀察PKCε信號通路在此過程中的作用。結(jié)果 I/R處理可抑制H9C2細(xì)胞活性，細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH、MDA含量升高，SOD活力降低(與Control組比較，P＜0.05)。抑制PKCε表達(dá)，上調(diào)Caspase－3表達(dá)，下調(diào)Bcl－2/ Bax比例(與Control組比較，P＜0.05)。2μM/L和4μM/L的APG預(yù)處理均可發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，降低LDH與MDA釋放量，提高SOD活力(與I/R組比較，P＜0.05)。此外，APG處理對抗了I/R損傷引起的PKCε表達(dá)下調(diào)，抑制Caspase－3表達(dá)，提高了Bcl－2/Bax比例(與I/R組比較，P＜0.05)。CHE處理后細(xì)胞活力下降，Caspase－3表達(dá)上調(diào)，Bcl－2/Bax比例下降，凋亡增加(與APG+I/R組比較，P＜0.05)。結(jié)論 甘青鐵線蓮中活性成分APG可減輕心肌缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能是激活PKCε相關(guān)信號通路，最終抑制心肌細(xì)胞凋亡。

甘青鐵線蓮;心肌缺血再灌注損傷;蛋白激酶Cε;細(xì)胞凋亡

缺血性心臟病是威脅人類健康的一項(xiàng)重大疾病，心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是重要的損傷類型，其病理機(jī)制復(fù)雜，有很多信號通路和細(xì)胞因子參與其中［1－4］。心肌I/R損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞，恢復(fù)血液供應(yīng)后產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的損傷［5］。甘青鐵線蓮為藏藥材，其性辛、甘、溫，祛寒，增生胃火，活血通淤，破癖瘤積聚［6］，且其作為復(fù)方制劑益心康泰膠囊的主藥在臨床應(yīng)用中療效顯著。本課題組前期從甘青鐵線蓮中分離并鑒定出一種主要活性成分:芹菜素－7－O－β－D－(－6＇－p－香豆?；?－吡喃葡萄糖(簡稱APG)，經(jīng)過藥理活性篩選，發(fā)現(xiàn)APG可減輕腦I/R損傷，且未見毒副作用(相關(guān)結(jié)果已申請國家發(fā)明專利，專利號:ZL201210425548.1)［7］，而APG是否能發(fā)揮抗凋亡作用從而減輕心肌I/R損傷及其具體作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)H9C2大鼠心肌細(xì)胞模擬I/R損傷，探討APG對心肌I/R損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 大鼠H9C2心肌細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

1.2 藥物與試劑 APG單體由本課題組分離所得。乳酸鈉、4－羥乙基哌嗪乙磺酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫氧葡萄糖、連二亞硫酸鈉(Sigma公司)，胎牛血清(FBS)(Gibco公司)，高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司)，CCK－8試劑盒購(七海復(fù)泰公司)，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、丙二醛(MDA)檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(SOD)(南京建成生物工程研究所)。兔抗蛋白激酶Cε(PKCε)、兔抗Caspase－3、兔抗Bax抗體，兔抗Bcl－2(CST公司)，鼠抗β－actin抗體(Santa Cruz公司)。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)?？贵w公司說明該來源抗體可很好識別此種蛋白。

1.3 儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，超凈工作臺(蘇州富泰潔凈系統(tǒng)有限公司)，恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，臺式低速離心機(jī)(Sigma公司)，細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar公司)，酶標(biāo)儀(Thermo公司)，Western Blot電泳、轉(zhuǎn)膜及發(fā)光成像儀(Bio－Rad公司)。

1.4 大鼠H9C2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)，以含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)90%進(jìn)行傳代，每隔兩天換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 心肌細(xì)胞I/R模型的建立 I/R損傷通過缺血液模擬缺血環(huán)境，缺血液組成為MgCl21mM/L、KCl 16 mM/L、NaCl 134 mM/L、CaCl2·H2O 0.9 mM/L、NaS2O31.2 mM/L、HEPES 2 mM/L、脫氧葡萄糖5 mM/L、乳酸鈉10 mM/L。加入缺血液的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶置于持續(xù)通氣密閉容器(95%N2，5%CO2)中缺氧45 min，更換正常DMEM后在培養(yǎng)箱(95%O2，5%CO2)中復(fù)氧孵育3 h。

1.6 心肌細(xì)胞存活率檢測 將大鼠H9C2心肌細(xì)胞制成9×104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)孵育24 h，吸棄原培養(yǎng)液，用不同濃度(1μM/L、2μM/L、4μM/L、8μM/ L、16μM/L、32μM/L)APG處理24 h，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。結(jié)束后每孔加入10μl CCK－8試液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測光密度OD值。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組 首先實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為正常對照組(Control)、I/R組、APG預(yù)處理組(I/R損傷前分別加入終濃度為2μM/L、4μM/L APG預(yù)處理24 h)，觀察APG對I/R損傷后心肌細(xì)胞的保護(hù)作用;隨后在I/R處理前加入PKCε阻斷劑CHE阻斷PKCε預(yù)處理2 h，濃度為5μM/L(已證實(shí)在該濃度對細(xì)胞無明顯毒性作用)，分為I/R組、APG+I/R組、APG+CHE+I/R組、CHE+I/R組，觀察PKCε信號通路在心肌細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)中的作用。

1.8 CCK－8法檢測各組心肌細(xì)胞活力 將大鼠H9C2心肌細(xì)胞制成9×104/ml的細(xì)胞懸液接種于96孔板，在CO2培養(yǎng)箱中(37℃，5%CO2)孵育24 h。實(shí)驗(yàn)各組處理結(jié)束后每孔加入10μl CCK－8試液，于CO2培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中孵育2 h，酶標(biāo)儀450 nm波長下檢測光密度OD值，每組設(shè)10個(gè)復(fù)孔。

1.9 生化指標(biāo)檢測 各組處理結(jié)束后取細(xì)胞培養(yǎng)液和提取細(xì)胞蛋白分別按照檢測試劑盒說明書，檢測LDH、MDA含量及SOD活力，各重復(fù)5次。

2.0 Western Blot法檢測PKCε蛋白及凋亡指標(biāo)變化 各組處理后的細(xì)胞置于冰上(每組4個(gè)樣本)，用PBS洗一遍，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液裂解 20 min(4℃條件下)后，離心20 min(12 000 r/min，4℃)，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，BCA蛋白定量后根據(jù)蛋白濃度加入相應(yīng)量的5×loading buffer，煮沸8 min。以每孔30μg蛋白上樣進(jìn)行電泳(SDS－PAGE)并用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，根據(jù)所需蛋白分子量切膜，條帶用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h。分別孵育PKCε(1∶800)、Caspase－3(1∶1 000)、Bax(1∶1 000)和Bcl－2(1∶1 000)，4℃過夜。用TBST洗滌5遍，每遍6 min，常溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)孵育2 h。用TBST洗滌5遍，每遍6 min，配制發(fā)光液，用Bio－Rad發(fā)光成像，用Image Lab軟件進(jìn)行分析。

2.1 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均以±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x± s)表示，采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析(ANOVA)，若總體差異顯著，再以t檢驗(yàn)分析相應(yīng)兩組間的顯著性差別。P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度APG對心肌細(xì)胞增殖的影響 如圖1所示，當(dāng)藥物濃度達(dá)到4μM/L時(shí)，細(xì)胞成活率最高，但隨著藥物濃度升高，細(xì)胞成活率逐漸降低，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定APG高低濃度分別為4μM/L和2μM/L。

2.2 APG預(yù)處理對I/R損傷后各組心肌細(xì)胞活力的影響 如圖2和圖3所示，實(shí)驗(yàn)1中I/R處理顯著降低了H 9C2細(xì)胞活力(與Control組比較，P＜0.05)。APG預(yù)處理24 h顯著提高了細(xì)胞活力(與I/R組比較，P＜0.05)，其中4μM/L的APG保護(hù)效果更明顯(與APG 2μM/L+I/R組比較，P＜0.05)。在倒置顯微鏡下觀察，I/R損傷后H9C2細(xì)胞形態(tài)變圓皺縮，體積縮小，可見大量死細(xì)胞。APG預(yù)處理的細(xì)胞死亡減少，細(xì)胞形態(tài)顯著改善。

圖1 不同濃度APG對心肌細(xì)胞增殖的影響

圖2 APG對I/R損傷后H9C2細(xì)胞活力的影響

圖3 APG對I/R損傷后H9C2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響(倒置顯微鏡，200倍)

2.3 APG預(yù)處理對I/R損傷后H9C2心肌細(xì)胞的影響 如圖4所示，實(shí)驗(yàn)1中I/R損傷后的H9C2細(xì)胞乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)釋放量明顯升高，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力顯著降低(P＜0.05)。APG預(yù)處理24 h后，劑量依賴性降低LDH和MDA的釋放，提高和SOD活力(P＜0.05)。

圖4 APG對I/R損傷后各組心肌細(xì)胞LDH、MDA含量和SOD活力變化

2.4 APG預(yù)處理對I/R損傷后PKCε及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)1Western Blot結(jié)果顯示(見圖5)，與Control組相比，I/R處理降低PKCε表達(dá)水平(P＜0.05)，明顯上調(diào)Caspase－3表達(dá)水平(P＜0.05)、下調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)，上調(diào)凋亡蛋白Bax表達(dá)(P＜0.05);與I/R組相比，2μM/L和4 μM/L的APG處理對抗了I/R損傷引起PKCε表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，降低了Caspase－3表達(dá)(P＜0.05)，上調(diào)了抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)，下調(diào)凋亡蛋白Bax表達(dá)(P＜0.05)。且4μM/L APG保護(hù)效果更為明顯(P＜0.05)。

圖5 APG對I/R損傷后H9C2細(xì)胞PKCε、Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達(dá)影響

2.5 APG和CHE共處理對I/R損傷后各組心肌細(xì)胞活力的影響 前期結(jié)果顯示4μM/L的APG具有較好的保護(hù)效果。如圖6所示，實(shí)驗(yàn)2中給予PKC抑制劑CHE后檢測細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，與APG+ I/R相比，APG+CHE+I/R組細(xì)胞活力顯著降低(P＜0.05)。與I/R組相比，CHE+I/R對細(xì)胞活力沒有影響(P＞0.05)。

圖6 APG和CHE共處理對I/R損傷后H9C2細(xì)胞活力的影響

2.6 APG和CHE共處理對I/R損傷后PKCε及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)2 Western Blot結(jié)果顯示(見圖7)，與I/R組相比，APG+I/R處理劑量依賴性對抗了I/R損傷引起的PKCε表達(dá)下調(diào)(P＜0.05)，導(dǎo)致了Caspase－3表達(dá)下降(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)增加，凋亡蛋白Bax表達(dá)下降(P＜0.05);與APG+I/R組相比，APG+CHE+ I/R組PKCε表達(dá)顯著降低(P＜0.05)，Caspase－3表達(dá)增加(P＜0.05)，抗凋亡蛋白Bcl－2表達(dá)下降，凋亡蛋白Bax表達(dá)增加(P＜0.05)。與I/R組相比，CHE+I/R組蛋白表達(dá)未顯著變化(P＞0.05)。

圖7 APG和CHE共處理對I/R損傷后H9C2細(xì)胞PKCε、Bax、Bcl－2和Caspase－3蛋白表達(dá)影響

3 討論

甘青鐵線蓮作為復(fù)方制劑益心康泰膠囊的主藥，具有養(yǎng)陰補(bǔ)血、化瘀通脈、清腑降濁的功效，而且該藏藥組方治療心肌缺血再灌注損傷原理與中醫(yī)治療思想一致。APG為芹菜素與對香豆酸經(jīng)葡萄糖苷相連的結(jié)構(gòu)，其中芹菜素具有抗氧化、抗凋亡、抗炎及擴(kuò)張血管調(diào)節(jié)血脂的作用［8－9］。Delazar等采用1，1－二苯基－2－三硝基苯肼(DPPH)分析其抗氧化活性，結(jié)果表明APG具有優(yōu)良的抗氧化效果，抗氧化值幾乎與槲皮素相當(dāng)［10］。本實(shí)驗(yàn)在H9C2心肌細(xì)胞缺血再灌注模型上探討了APG的心肌保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)了有類似的保護(hù)效果。結(jié)果顯示缺血再灌注處理的H9C2細(xì)胞凋亡明顯增加，而APG可抑制凋亡。

缺血再灌注損傷的機(jī)制目前尚未徹底闡明，一般認(rèn)為，能量代謝障礙、自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等因素是其主要機(jī)制［11］。為了探討APG的抗心肌I/R損傷保護(hù)作用是否依賴于其對PKCε蛋白表達(dá)的上調(diào)，筆者采用特異性PKCε抑制劑CHE，在不影響基礎(chǔ)水平PKCε生理功能的濃度下，比較APG預(yù)處理組和APG加CHE組心肌細(xì)胞在I/R損傷后細(xì)胞活力、PKCε及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果顯示4μM/L的APG預(yù)處理24 h能有效減輕I/R對心肌細(xì)胞的損害，提高細(xì)胞存活率，上調(diào)Bcl－2/Bax比例且伴有PKCε表達(dá)的上調(diào)，該保護(hù)作用具有劑量依賴性。本研究亦證實(shí)，在經(jīng)I/R損傷的心肌細(xì)胞，APG預(yù)處理所產(chǎn)生的抗凋亡效應(yīng)可被PKCε抑制劑CHE明顯削弱。

蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是一組具有單一肽鏈結(jié)構(gòu)而又廣泛分布的絲氨酸－蘇氨酸激酶，在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，且是心肌缺血再灌注損傷中多種信號傳遞中的信號分子之一。PKC可轉(zhuǎn)位到胞核內(nèi)或者啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用，但并非所有亞型均有作用，目前僅發(fā)現(xiàn)PKCε、δ、α、β和η(PKCε尤為突出)有心肌保護(hù)作用［12－13］。研究表明，PKCε在心肌缺血預(yù)處理、運(yùn)動(dòng)預(yù)處理、及多種藥物預(yù)處理抗MI/R損傷過程中發(fā)揮重要作用，缺血再灌注損傷后可引發(fā)線粒體氧化應(yīng)激損傷［14－18］。有研究報(bào)道 PKCε可作為mKATP通道的上游激活分子，在缺血預(yù)處理的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中，PKCε激活后引起線粒體mKATP通道的開放，從而維持保護(hù)線粒體，發(fā)揮心肌保護(hù)作用［19］。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了APG預(yù)處理可以對抗I/R損傷引起的心肌細(xì)胞PKCε表達(dá)的下調(diào)，但仍需進(jìn)一步探討PKCε發(fā)揮心肌保護(hù)作用的相關(guān)分子及上下游關(guān)系。APG的心肌保護(hù)作用涉及PKCε信號通路，這為筆者深入研究APG作為心血管保護(hù)藥物的作用機(jī)制提供了新的思路。

［1］ Zhu L，Wei T，Chang X，etal.Effects of Salidroside onmyocardial injury in vivo in vitro via regulation of Nox/NF－κB/AP1 pathway［J］.Infammation，2015，38(1):1589－1598.

［2］ 楊陽，段維勛，金振曉，等.姜黃素對血管內(nèi)皮細(xì)胞過氧化氫損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，9 (4):239－242.

［3］ 楊陽，段維勛，周京軍，等.γ－分泌酶抑制劑對正常乳鼠心肌細(xì)胞的影響［J］.中國體外循環(huán)雜志，2011，9(2):89－92.

［4］ 楊陽，段維勛，王寧，等.γ－分泌酶抑制劑對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用［J］.中國體外循環(huán)雜志，2013，11(1):41－44.

［5］ 趙國龍，張秋芳，翟蒙恩，等.褪黑素受體對大鼠心肌缺血再灌注損傷的調(diào)控及其機(jī)制研究［J］.中國體外循環(huán)雜志，2015，13 (2):113－122.

［6］ 中國科學(xué)院西北高原生物研究所.藏藥志［M］.西寧:青海人民出版社，1991:250.

［7］ CaiM，Ma YL，ZhangW，etal.Apigenin－7－O－β－D－(－6＇－p－coumaroyl)－Glucopyranoside treatmentelicitsneurotective effect against experimental ischemic stroke［J］.Int JBiol Sci，2016，12 (1):42－52.

［8］ Lee SJ，Mun GI，An SM，et al.Evidence for the association of peroxidaseswith the antioxidant effect of p－coumaric acid in endothelial cells exposed to high glucose plus arachidonic acid［J］.BMB Rep，2009，42(9):561－567.

［9］ Jyoti Roy A，Stanely Mainzen Prince P.Preventive effects of pcoumaric acid on lysosomal dysfunction andmyocardial infarct size in experimentally induced myocardial infarction［J］.Eur JPharmacol，2013，699(1－3):33－9.

［10］ Delazar A，Celik S，Gokturk RS，et al.Two acylated flavonoid glycosides from stachys bombycina，and their free radical scavenging activity［J］.Pharmazie，2006，60(11):878－880.

［11］ Zhu XH，Yuan HJ，Wu YN，et al.Non－nvasive limb ischemic pre－conditioning reduces oxidative stress and attenuatesmyocardium ischemia－reperfusion injury in diabetic rats［J］.Free Radic Res，2011，45(2):201－210.

［12］ Akita Y.Protein kinase C－epsilon(PKC－epsilon):its unique structure and function［J］.JBiochem，2002，132(6):847－852.

［13］ Chen Y，Tian Q.The role of protein kinase C epsilon in neural signal transduction and neurogenic diseases［J］.Front Med，2011，5(1):70－76.

［14］ Hund TJ，Lerner DL，Yamada KA，et al.Protein kinase Cepsilon mediates salutary effects on electrical coupling induced by ischemic preconditioning［J］.Heart Rhythm，2007，4(9):1183－1193.

［15］ Inagaki K，Churchill E，Mochly－Rosen D.Epsilon protein kinase C as a potential therapeutic target for the ischemic heart［J］.Cardiovas Res，2006，70(15):222－230.

［16］ Hao Z，Pan SS，Shen YJ，et al.Exercise preconditioning－induced early and late phase of cardioprotection is associated with protein kinase C epsilon translocation［J］.Circ J，2014，78(7): 1636－1645.

［17］ Tang L，Peng Y，Xu T，et al.The effects of quercetin protect cardiomyocytes from A/R injury is related to its capability to increasing expression and activity of PKC epsilon protein［J］.Mol Cell Biochem，2013，382(1):145－152.

［18］ Yang Y，Wang J，Li Y，et al.Ho－1 signaling activation by pterostilbene treatment attenuatesmitochondrial oxidative damage induced by cerebral ischemia reperfusion injury［J］.Mol Neurobiol，2016，53(4):2339－2353.

［19］ Costa AD，Garlid KD.Intramitochondrial signaling:interactions amongmito KATP，PKC epsilon，ROS，and MPT［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，295(2):874－882.

Com pound APG derived from Clematis tangutica amelioratesm yocardial ischem ia/reperfusion injury via activating PKCεand inhibiting apoptosis

Feng Ying－da，F(xiàn)eng Jian－yu，Yang Yang，Di Shou－yin，Zhang Wei，Lu Yun－yang，Tang Hai－feng，
Zhu Yan－rong
Institute of Materia Medica，School of Pharmacy，F(xiàn)ourth Military Medical University，Shaan＇xi Xi＇an 710032，China Corresponding author:Tang Hai－feng，E－mail:tanghaifeng71@163.com Zhu Yan－rong，E－mail:zyr19830812@163.com

Ob jective To investigate the protective effects of APG on myocardial ischemia/reperfusion(I/R)injury(IRI) and its possiblemechanism.M ethods The cultured H9C2 cells were treated with APG for 24 h，and subjected to IRI(I 45min，R 3 h).After the 3 h reperfusion，cell viability，serum LDH and serum MDA，cell SOD activity，apoptotic index，PKCεexpression，Caspase－3 expression，Bax expression and Bcl－2 expression were detected，then the specific inhibitor of PKCεCHEwas applied to evaluate the roles of PKCεin this process.Results I/R treatment reduced cell viability significantly，decreased SOD activity and the Bcl－2/Bax ratio，down－regulated PKCεexpression，up－regulated LDH levels，MDA levels and Caspase－3 expression(vs the control group，P＜0.05).Moreover，APG treatment(both 2μM/L and 4μM/L)increased the cell viability，SOD activity and the Bcl－2/Bax ratio，down－regulated LDH levels，MDA levels and Caspase－3 expression，up－regulated PKCεexpression in a dose dependentmanner (vs the I/R group，P＜0.05).In addition，compared with the APG+IR group，CHE treatment reduced the cell viability，up－regulated Caspase－3 expression，decreased the Bcl－2/Bax ratio(vs the APG+I/R group，P＜0.05).Conclusion APG treatment ameliorates I/R injury via activating PKCεpathway and inhibiting apoptosis.

Clematis tangutica;Myocardial ischemia/reperfusion injury;PKCε;Apoptosis

2016-09-23)

2016-10-24)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.11

國家自然科學(xué)基金(81403182，81503285，81570231)

710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所(馮穎達(dá)、陸云陽、湯海峰);710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科(馮建宇)，藥劑科(朱艷榮、張 偉);710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系(楊 陽);710032西安，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院胸外科(狄守印)

湯海峰，E－mail:tanghaifeng71@163.com;朱艷榮，E－mail:zyr19830812@163.com