李霞 王順利

（北京農(nóng)學(xué)院城鄉(xiāng)發(fā)展學(xué)院，北京 102206）

高通量轉(zhuǎn)錄組在園藝植物色素代謝中的研究進(jìn)展

李霞 王順利

（北京農(nóng)學(xué)院城鄉(xiāng)發(fā)展學(xué)院，北京 102206）

色素代謝是園藝植物中最為重要的研究領(lǐng)域之一，目前相關(guān)研究主要集中在花青素代謝和類胡蘿卜素代謝上，其決定園藝植物的品質(zhì)性狀和觀賞性狀。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，可以從轉(zhuǎn)錄組水平上揭示園藝植物色素代謝的分子機(jī)理。綜述了轉(zhuǎn)錄組學(xué)在主要果樹、蔬菜和觀賞植物的色素節(jié)點(diǎn)分離、分支代謝、新基因分離、調(diào)控機(jī)制及環(huán)境對色素代謝影響方面的主要研究進(jìn)展，分析了目前應(yīng)用中存在的問題，并展望了轉(zhuǎn)錄組學(xué)在園藝植物色素代謝中的發(fā)展前景，以期為利用高通量測序技術(shù)分析色素代謝機(jī)制、分離關(guān)鍵基因并應(yīng)用于園藝作物品質(zhì)定向育種提供參考。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)；生物信息學(xué)；色素代謝

轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA（Non-coding RNA）。與差異顯示技術(shù)、基因芯片、數(shù)字基因表達(dá)譜等常規(guī)方法相比，轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-sequencing，RNA-seq）具有靈敏度高、信號數(shù)字化、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物體的多種功能研究。通過轉(zhuǎn)錄組分析，不僅可以獲得研究材料在某一狀態(tài)下全部已知基因的表達(dá)豐度、剪接方式等信息，還可以在無參考基因組物種中進(jìn)行基因及新轉(zhuǎn)錄本的挖掘。

色素代謝是園藝植物中最為重要的研究領(lǐng)域之一，目前相關(guān)研究主要集中在花青素代謝和類胡蘿卜素代謝上，其決定園藝植物的品質(zhì)性狀和觀賞性狀。轉(zhuǎn)錄組是研究色素代謝、環(huán)境因子調(diào)控及新基因挖掘等研究的一種重要方法。本文綜述了近年來轉(zhuǎn)錄組學(xué)在主要果樹、蔬菜和觀賞植物的色素節(jié)點(diǎn)分離、分支代謝、新基因分離、調(diào)控機(jī)制及環(huán)境對色素代謝影響方面的主要研究進(jìn)展，以期為利用高通量測序技術(shù)分析色素代謝機(jī)制、分離關(guān)鍵基因并應(yīng)用于園藝作物品質(zhì)定向育種提供參考。

1 色素代謝通路節(jié)點(diǎn)基因的分離

花青素苷和類胡蘿卜素分屬不同的代謝途徑，并且在分子結(jié)構(gòu)上存在顯著區(qū)別。花青素苷起源于苯丙烷代謝，類胡蘿卜素是在植物質(zhì)體中經(jīng)異戊二烯途徑合成的一種脂溶性萜類色素，兩者的合成途徑目前均已研究得較為清楚。

花青素和類胡蘿卜素的代謝在高等植物中屬于比較保守的類型?；ㄇ嗨匾员奖彼釣榈孜铮?jīng)過PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H、DFR、ANS和UFGT等一些列酶促反應(yīng)，最終形成矢車菊色素、飛燕草色素和天竺葵色素，分別決定粉色、藍(lán)色和紅色的果實(shí)、葉和花的呈色。類胡蘿卜素的生物合成在質(zhì)體中進(jìn)行，遵循類異戊二烯途徑。參與催化類胡蘿卜素生物合成的主要酶包括PSY、PDS、ZDS、CRTISO等合成番茄紅素上游的酶。首先番茄紅素環(huán)化生成α和β胡蘿卜素，接下來這些胡蘿卜素在LCYB、LCYE、BCH和ZEP等番茄紅素下游酶的催化下，形成葉黃素、玉米黃質(zhì)、紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)等黃色的類胡蘿卜素。另外，類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（Carotenoid cleavage dioxygenases，CCDs）是類胡蘿卜素氧化裂解分解類胡蘿卜素多烯鏈特異雙鍵形成脫輔基類胡蘿卜素的關(guān)鍵酶，能夠在類胡蘿卜素合成后將其降解，催化為揮發(fā)類物質(zhì)、脫落酸和獨(dú)腳金內(nèi)酯等激素物質(zhì)［1］。類胡蘿卜素調(diào)控方面，人們從模式植物，尤其是園藝作物果實(shí)中發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)錄因子，但是其中大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子都是通過調(diào)控植物果實(shí)的成熟發(fā)育從而間接影響類胡蘿卜素的積累，如番茄MADS-box轉(zhuǎn)錄因子、AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的AP2a、SIERF6以及具有NAC結(jié)構(gòu)域的NOR和SlNAC4［2］。而只有少數(shù)轉(zhuǎn)錄因子，如擬南芥PIF1和RAP2.2轉(zhuǎn)錄因子，可以直接作用于結(jié)構(gòu)基因以影響類胡蘿卜素的積累。因此，目前尚不明確是否有特定的轉(zhuǎn)錄因子家族調(diào)控類胡蘿卜素的生物合成［3］。

不同物種中控制其代謝的節(jié)點(diǎn)基因常呈現(xiàn)多態(tài)性，且通路上的結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)控基因（主要是MYB、bHLH和WD40家族基因）都以基因家族、超基因家族的形式存在，因此轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析是分離特定物種花青素代謝節(jié)點(diǎn)基因的重要手段［4］。由于顏色的可識別性很高，能夠很容易地找到自然界中存在的大量的植物顏色變異。例如，與我們?nèi)粘Ｉ钕⑾⑾嚓P(guān)的蔬菜、水果和觀賞植物，大部分來自于對這些顏色變異品種的培育。很多學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組開展突變體形成機(jī)理的分子解析，并得到了控制植物色素代謝的節(jié)點(diǎn)基因，這些結(jié)果將有助于新優(yōu)果實(shí)、蔬菜和觀賞植物的育種。

Li等［5］通過對獼猴桃花青素合成的相關(guān)基因的研究，結(jié)合不同發(fā)育期花青素積累水平的變化，證明ANS和UFGT7可能是決定獼猴桃花青素合成的關(guān)鍵基因。Liu等［6］以紅色果枸杞（Lycium barbarum）及黑果枸杞（L. Ruthenicum）為對照材料，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，證明PSY1，PDS，ZDS，CYC-B和CRTR-B2是枸杞中類胡蘿卜素合成的重要節(jié)點(diǎn)基因。通過構(gòu)建高密度 遺傳圖譜，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，SSRy和W2691位點(diǎn)之間的CCD4基因，其表達(dá)量與類胡蘿卜素合成之間存在相關(guān)性。由此證實(shí)白肉桃中，CCD4表達(dá)，降解其中的β類胡蘿卜素，而黃肉桃中該基因的不表達(dá)導(dǎo)致了黃肉性狀的產(chǎn)［7］。另外，在菊花和油菜中，也均發(fā)現(xiàn)了黃色品種是由于CCD4基因的不表達(dá)，導(dǎo)致類胡蘿卜素?zé)o法被降解，因此呈現(xiàn)黃色［8，9］。Ahn等［10］通過結(jié)縷草紅色和綠色品種‘Anyang-jungji’（AJ）和‘Greenzoa’（GZ）進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，紅色品種葉片中DFR和ANS的高表達(dá)是其紅葉性狀的成因。另外，研究者通過對馬鈴薯、紫蘇、菊花等園藝植物進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，均發(fā)現(xiàn)了響應(yīng)的控制花青素代謝的節(jié)點(diǎn)基因，且以DFR和ANS的高表達(dá)為主［11-13］。

調(diào)節(jié)基因方面，Wu［14］比較了紫色甘薯及其白色突變體的轉(zhuǎn)錄組，證明UFGT，CHS和CHI以及bHLH基因家族是決定其花青素是否積累的重要基因。通過對Silene littorea不同花色品種轉(zhuǎn)錄組的分析，結(jié)合QTL定位發(fā)現(xiàn)，其彩色花品種受同一連鎖群中F3'H和myb1a兩個(gè)基因的共同調(diào)控，myb1a通過結(jié)合F3'H啟動子對花青素代謝起到調(diào)控作用［15］。Mushtaq 等［16］通過對比紫葉及綠葉甘藍(lán)的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)花青素代謝通路上只有bHLH類轉(zhuǎn)錄因子TT8的表達(dá)顯著變化，且光系統(tǒng)II中的FTSHPROTEASE8（FTS8）、GLYCOLATEOXIDASE1（GOX1）和GLUTAMINESYNTHETASE1；4（GLN1；4）表達(dá)量降低。

2 在色素分支代謝中的作用

花青素代謝和類胡蘿卜素代謝都存在分支代謝的情況。花青素代謝中，以柚皮素為分支點(diǎn)，代謝流分別以F3'H、F3'5'H和F3H為催化酶，形成矢車菊色素、飛燕草色素和天竺葵色素，從而呈現(xiàn)不同顏色［1］。類胡蘿卜素代謝中，以番茄紅素為底物，在LCYE和LCYB催化下分別形成α和β兩種類胡蘿卜色素物質(zhì)。關(guān)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)在分支代謝上的調(diào)控機(jī)制研究，大部分研究集中在花青素分支代謝途徑上，而關(guān)于類胡蘿卜素的研究較少。

5 -羥色胺和 5-HIAA 均為內(nèi)源性物質(zhì)，難以獲得不含 5-羥色胺和 5-HIAA 的空白腦脊液，因此在方法學(xué)驗(yàn)證和制備隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，必須將大鼠空白腦脊液中待測物的峰面積作為本底扣除，以排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。不同大鼠腦脊液中待測物濃度可能不同，將多只大鼠腦脊液均勻混合作為空白腦脊液，能避免個(gè)體差異對測定結(jié)果的影響。本文中的大鼠腦脊液均為同一時(shí)間段采集，可以忽略節(jié)律對待測物濃度的影響。

Lou等［17］建立了葡萄風(fēng)信子M. armeniacum 及其白色突變體轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫。通過生物信息學(xué)比對發(fā)現(xiàn)143 條花青素代謝的相關(guān)基因，其中28條在不同花色的葡萄風(fēng)信子中存在顯著差異。結(jié)合藍(lán)白葡萄風(fēng)信子花色物質(zhì)代謝譜信息，最終確定DFR基因的低表達(dá)是決定葡萄風(fēng)信子由藍(lán)色變?yōu)榘咨年P(guān)鍵功能基因。FLS基因通過對底物的競爭，進(jìn)一步將原先應(yīng)該用于飛燕草素合成的底物導(dǎo)向無色的黃酮類物質(zhì)，從而導(dǎo)致白色花的形成。Jin等［18］構(gòu)建了瓜葉菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，分離得到43個(gè)編碼花青素代謝通路的結(jié)構(gòu)基因與調(diào)節(jié)基因，并分析了瓜葉菊白、黃、粉、洋紅和藍(lán)色花的呈色機(jī)制。結(jié)果表明，ScbHLH17和ScCHI1/2編碼區(qū)的突變，分別導(dǎo)致了白色和黃色花品種無法積累花青素；3個(gè)分支酶ScF3'H1、ScF3'5'H和ScDFR1/2對柚皮素的競爭，導(dǎo)致了瓜葉菊中花青素分支流分別向矢車菊素方向、飛燕草素方向和天竺葵素方向流動。

宿福園等［19］利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了黑色柿子果皮的成色機(jī)制，發(fā)現(xiàn)黑柿果皮轉(zhuǎn)色過程中花青苷代謝途徑的CHS家族基因有多個(gè)且大量上調(diào)表達(dá)，由此產(chǎn)生大量的底物。雖然CHI和F3H兩個(gè)基因家族沒有表現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)，但由于底物較多，會打開通路。F3'H和F3'5'H為競爭關(guān)系，反應(yīng)底物相同，在轉(zhuǎn)色過程，F(xiàn)3'H表達(dá)量升高，而F3'5'H表達(dá)量下降。由此可以推斷，在生成二氫山柰酚之后，經(jīng)F3'H催化產(chǎn)生二氫槲皮素。ANS與LAR共同競爭底物無色花色素，在轉(zhuǎn)色過程差異表達(dá)基因中沒有找到LAR，而ANS大量表達(dá)，因此大量產(chǎn)生花色素使得‘黑柿’果皮色素中最終呈現(xiàn)出由于高花青素積累形成的黑色。

3 在色素代謝調(diào)控上的研究進(jìn)展

色素基因的表達(dá)除了轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還會出現(xiàn)在序列差異、甲基化、miRNA甚至蛋白層面，利用轉(zhuǎn)錄組獲得差異表達(dá)基因，繼而進(jìn)行下游研究工作，研究者們獲得了大量關(guān)于花青素和類胡蘿卜素代謝調(diào)控機(jī)制方面的可喜成果。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面，Yamagishi等［20］通過對百合花瓣飛濺部位和正常著色部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)合序列分析發(fā)現(xiàn)，LhMYB12不同剪接形式?jīng)Q定了花瓣性狀的形成。猴面花中，通過轉(zhuǎn)錄組測序找到了在花瓣、條紋及蜜腺處特異表達(dá)的不同的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員［21］。Lee等［22］通過在挖掘番茄類胡蘿卜素代謝調(diào)控機(jī)制時(shí)結(jié)合使用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，首先明確了番茄果實(shí)成熟過程中各類胡蘿卜素組分的含量變化，繼而取對應(yīng)點(diǎn)的果肉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，共檢測到953個(gè)unigenes 能夠至少與一個(gè)組分呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，并找到了6個(gè)與前人報(bào)道一致的基因，包括RIN-MADS、CNR、LeEIL、Le-HB1、SlAP2a和TAGL1，以及一個(gè)新的編碼AP2類轉(zhuǎn)錄因子家族的SlERF6基因。RNAi實(shí)驗(yàn)證明，抑制該基因造成了轉(zhuǎn)基因植株類胡蘿卜素含量的大幅降低。另外，基因轉(zhuǎn)錄過程中的剪接加工是基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制，可變剪接是轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜多樣性的重要來源。Bashandy等［23］通過對非洲菊紅色品種‘Estelle’及其白色突變體‘Ivory’進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，非洲菊共有4個(gè)DFR基因，但在‘Ivory’中，兩個(gè)在天竺葵色素苷合成中起重要作用的DFR基因序列上發(fā)生了可變剪接變異，因此出現(xiàn)白色花 突變體。

除轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，近來有研究表明，在花青素和類胡蘿卜素的合成過程中，DNA甲基化可使器官顏色發(fā)生明顯改變。El-Sharkawy對紅皮蘋果‘Kidd’s D-8’（KID）及其黃皮突變體Blondee’（BLO）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，22個(gè)差異表達(dá)基因中，MdMYB10（MDP0000259614）和MdGST（MDP0000252292）的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，但兩者在序列上無明顯差異。甲基化測序證明，MdMYB10啟動子區(qū)的MR3和MR7區(qū)域發(fā)生了甲基化，而在BLO中該基因呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，使得其無法正常轉(zhuǎn)錄，繼而影響下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)［24］。在蘋果其他品種中，MdMYB10啟動子序列中發(fā)生超甲基化還會導(dǎo)致條紋果皮的出現(xiàn)［25］。

MicroRNA在色素代謝中亦發(fā)揮著重要作用。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，其調(diào)控機(jī)理亦開始被人們關(guān)注。Saminathan等［26］通過對石榴種子進(jìn)行小RNA測序發(fā)現(xiàn)，miR156在果皮成熟后期高峰度表達(dá)，以抑制SPL類轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而調(diào)控花青素代謝的積累。在心里美蘿卜的根中，結(jié)合MiRNA和mRNA測序發(fā)現(xiàn)了52個(gè)已知miRNA（如miR156、miR828和 miR858）和20個(gè)新的miRNA參與其著色，預(yù)測其靶基因包括MYBs、bHLH、WD40、SPLs、ARF、EIN3、WRKY、MADS-box和ABC transporter等參與花青素代謝調(diào)控及轉(zhuǎn)運(yùn)的基因。Xu等［27］利用高通量測序的方法分析了‘暗柳’和其類胡蘿卜素突變體‘紅暗柳’甜橙花后170 d的果實(shí)中microRNA 的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60個(gè)microRNA有顯著性表達(dá)差異，進(jìn)一步對差異表達(dá)的microRNA靶定到的418個(gè)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這些基因大多參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、光合作用和蛋白修飾。

4 色素代謝新基因的分離

隨著對以上兩類色素的研究深入，其在園藝植物呈色上的機(jī)制被越來越多地提出，如色素的修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)和下包內(nèi)環(huán)境等，均有可能對呈色造成差異。尤其在類胡蘿卜素方面，由于其調(diào)控機(jī)制較花青素更為保守，調(diào)控等方面的基因很少，利用轉(zhuǎn)錄組深入探尋上述機(jī)制，挖掘新基因是一種很好的方法。

Tzuri等［28］在研究南瓜果肉中類胡蘿卜素積累時(shí)，利用bulk segregant transcriptome 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分離了控制類胡蘿卜素積累的關(guān)鍵基因。由于數(shù)量性狀位點(diǎn)控制的表型性狀在作圖群體中呈現(xiàn)近似正態(tài)分布，分別選取F3群體中兩種極端表型個(gè)體，等量RNA混合后構(gòu)成兩個(gè)混合池，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，即BSR-Seq（Bulked Segregant RNA-Seq）。BSR-Seq除了能在基因表達(dá)水平揭示差異表達(dá)基因，還能在序列變異水平篩選出與極端表型相關(guān)的位點(diǎn)。這種新的分析思路有效地縮小了候選基因范圍，為數(shù)量性狀相關(guān)基因定位提供了新選擇。Tzuri等利用黃色果肉與白色果肉南瓜品種進(jìn)行雜交，獲得顏色分離的F3代群體后，分離得到了控制果肉顏色的golden SNP，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)位于類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因Or內(nèi)。該方法目前被越來越多地引入到新基因分離的研究中，Sagawa等［29］利用化學(xué)誘變得到了Mimulus lewisii類胡蘿卜素合成減少的突變體，繼而通過雜交群體構(gòu)建及混合池測序的方法，得到了調(diào)控該物種類胡蘿卜素合成的1個(gè)R2R3類MYB 轉(zhuǎn)錄因子RCP1。

此外，亦有很多學(xué)者利用遺傳群體結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序，分離得到色素代謝中的關(guān)鍵基因。Zhou等［30］通過QTL定位將紅葉桃紅葉性狀定位于其6號染色體的Gr區(qū)段內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)該區(qū)段內(nèi)的MYB10.4基因在綠葉與紅葉品種中差異表達(dá)，瞬時(shí)表達(dá)證明其能夠使轉(zhuǎn)基因煙草積累花青素。而在桃果肉中，其花青素積累機(jī)制與葉片中并不相同，Han和Zhou等通過遺傳作圖及轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)MYB類基因表達(dá)并不與果實(shí)中的花青素積累呈現(xiàn)正相關(guān)，利用找到的NAC類轉(zhuǎn)錄因子BLOOD，經(jīng)VIGS分析發(fā)現(xiàn)，抑制株系果肉中的花青素含量大幅減少［31］。

朱滿蘭等［32］通過對睡蓮花色表型以及類黃酮成分的分析發(fā)現(xiàn)，耐寒睡蓮和熱帶藍(lán)色睡蓮花瓣中Dp型色素與Cy型色素含量的比例不同、糖苷化位置也不同。在熱帶藍(lán)色睡蓮花瓣中，花青素苷全部是3'位發(fā)生?；腄p型糖苷；在耐寒睡蓮花瓣中，只檢測到了3位Dp型糖苷。進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，藍(lán)色花瓣呈色是通過糖苷化位置從3位移到3'位來實(shí)現(xiàn)，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較兩者之間的表達(dá)譜，結(jié)合基因表達(dá)分析及上述代謝組分析，找到了控制該過程的新基因UA3GT［33］。

5 環(huán)境對色素代謝的影響

色素合成與積累過程往往與植物發(fā)育過程密切相關(guān)，并由內(nèi)外因子共同控制。環(huán)境因子通過誘導(dǎo)植物體內(nèi)色素合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)來調(diào)控其呈色反應(yīng)。利用環(huán)境因子調(diào)控花色將會極大地提高花卉的觀賞價(jià)值。影響色素代謝及呈色的外界環(huán)境因子主要包括光、溫度、激素和糖等［34］。

光是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一?；ㄇ嗨剀盏暮铣膳c否及其合成量與光受體和光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子密切相關(guān)［35］。Hong等［13］以光合成花青素的菊花品種‘麗金’為材料，使用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)比對了正常光照與遮光后舌狀花不同發(fā)育階段的基因表達(dá)情況，證明CmHY5的表達(dá)量與花青素苷的含量呈正相關(guān)關(guān)系，而CmPHYA、CmPHYB、CmCRY1a、CmCRY1b和CmCRY2等5個(gè)光受體基因的表達(dá)與花青素苷的依光合成相關(guān)性較弱；CmCOP1基因的表達(dá)與花青素苷的含量也沒有明顯的相關(guān)性。而荔枝中的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究證明，HY5、NAC、ATHBs、FHY是其果皮花青素依光合成的節(jié)點(diǎn)基因［36］。Wu等［37］在進(jìn)行葡萄花青素研究中發(fā)現(xiàn)，‘京秀’經(jīng)過去光處理后果皮變成綠色，而‘京艷’經(jīng)過去光處理后果皮仍為紅色，表現(xiàn)為光不依賴型。通過兩者遮光后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在‘京艷’果皮中，UFGT 和VvMYBA1 的表達(dá)不依賴于光。其調(diào)控是由于HY5泛素化通路的COP9、cullins、RINGBox 1和COP1結(jié)合蛋白的表達(dá)量發(fā)生了顯著變化。

花青素和類胡蘿卜素均受溫度調(diào)控，一般情況下，溫度升高會導(dǎo)致類胡蘿卜素和花青素的減少或消失，而低溫會誘導(dǎo)兩類色素的積累。目前，低溫誘導(dǎo)機(jī)制研究的較為清晰，Li等［38］發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)花青素糖基化酶基因UFGT的植株能夠積累更多花青素以抵御低溫，這種誘導(dǎo)是由于UFGT基因受到了上游抗性基因CBF1誘導(dǎo)。而低溫誘導(dǎo)番茄花青素合成是由bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，Qiu等［39］通過對轉(zhuǎn)bHLH類轉(zhuǎn)錄因子基因AH番茄株系進(jìn)行高通量測序發(fā)現(xiàn)，其不僅能夠在低溫條件下誘導(dǎo)花青素合成，而且能夠促進(jìn)活性氧清除等抗逆基因的表達(dá)。Movahed等［40］發(fā)現(xiàn)，同樣是活性氧通路的VviPrx31基因在葡萄高溫下花青素降解途徑中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。類胡蘿卜素研究方面，其本身就是高等植物在逆境脅迫下非常重要的響應(yīng)逆境的次生代謝物質(zhì)，但目前關(guān)于該通路與脅迫通路之間的交聯(lián)作用報(bào)道很少，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，是解決這一問題的有效技術(shù)手段。

激素、氮或磷的含量亦是影響色素合成的重要環(huán)境因子。研究發(fā)現(xiàn)GA可以通過誘導(dǎo)CHS、CHI、DFR、ANS和RT基因的表達(dá)，促進(jìn)花青素苷的合成［35］。茉莉酮酯酸（Jasmonic acid，JA）和脫落酸（Abscisic acid，ABA）能與糖協(xié)同作用于花青素苷合成途徑［41］。在紅肉蘋果愈傷組織培養(yǎng)基中施加2，4-D 和 NAA，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè) Aux/IAA和7個(gè)ARF基因表達(dá)上調(diào)，而MYB家族MYB75（MdMYB10）、MYB12、MYB111、MYB113、TT2和TT8表達(dá)量下降［42］。對擬南芥獨(dú)腳金內(nèi)酯max突變體轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)，MYB類轉(zhuǎn)錄因子PAP表達(dá)量降低，證明該激素通過max基因調(diào)控PAP表達(dá)，從而對花青素積累起作用［43］。Hsieh等［44］通過高通量RNA 測序結(jié)果表明，缺磷脅迫能夠同時(shí)誘導(dǎo)擬南芥miR828及其靶基因PAP1/MYB75、PAP2/MYB90和MYB113 的上調(diào)表達(dá)，過表達(dá)miR828 擬南芥轉(zhuǎn)基因植株中TAS4、PAP1/MYB75、PAP2/MYB90 和MYB113 的表達(dá)量均顯著下調(diào)，花青素含量降低。

6 基于基因組學(xué)的園藝植物色素代謝分析

隨著第二代測序技術(shù)的誕生，測序通量大幅提升，單位數(shù)據(jù)量測序價(jià)格顯著下降，還允許使用組合的測序策略，使多個(gè)樣品可同時(shí)在一個(gè)反應(yīng)池中進(jìn)行測序［45-47］。在此背景下，越來越多的園藝植物基因組完成了全基因組測序和草圖繪制（如黃瓜、番茄、蘋果、鳳梨和梅花等）［48-52］，同時(shí)以模式物種為起點(diǎn)的重測序也陸續(xù)得到展開。通過群體結(jié)構(gòu)及選擇壓力分析等研究策略，一些在進(jìn)化中決定色素合成的重要基因資源被挖掘。

黃三文等［53］對115個(gè)黃瓜品系進(jìn)行了深度重測序，并構(gòu)建了包含360多萬個(gè)位點(diǎn)的全基因組遺傳變異圖譜。黃瓜基因組中有100多個(gè)區(qū)域受到了馴化選擇，包含2 000多個(gè)基因。上述研究創(chuàng)造性地運(yùn)用了群體分化這一新分析算法，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)西雙版納黃瓜特有的突變。該突變導(dǎo)致了編碼β-胡蘿卜素羥化酶的基因失效，從而導(dǎo)致西雙版納黃瓜在果實(shí)成熟期不能降解β-胡蘿卜素，使得西雙版納黃瓜具有特有的橙色果肉，而不是大部分黃瓜所呈現(xiàn)的白色或淺綠色果肉顏色。國際番茄變異組研究團(tuán)隊(duì)通過對世界各地的360份番茄種質(zhì)進(jìn)行了重測序分析，構(gòu)建了完整的番茄遺傳變異組圖譜。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)了決定粉果果皮顏色的關(guān)鍵變異位點(diǎn)，此位點(diǎn)的變異導(dǎo)致SlMYB12基因啟動子區(qū)域的缺失，進(jìn)而影響該基因的表達(dá)，從而使得成熟的粉果番茄果皮中不能積累類黃酮，這一發(fā)現(xiàn)為培育粉果番茄品種提供了有效的分子育種工具［54］。2016年，胡蘿卜全基因組測序完成。該研究利用兩個(gè)作圖群體，確定了在黃色和暗橙色根中都是Y基因調(diào)節(jié)類胡蘿卜素的大量累積，精細(xì)的定位分析確定了5號染色體上含有Y基因的一段75 Kb區(qū)域，但此區(qū)域預(yù)測的8個(gè)基因中沒有一個(gè)與已知異戊二烯生物合成基因具有同源性，該區(qū)域中DCAR_032551是唯一含有突變而造成類胡蘿卜素差異的基因。DCAR_032551在其第二個(gè)外顯子上含有一個(gè)212 nt的插入，導(dǎo)致黃色和暗橙色胡蘿卜中形成了移碼突變［55］。

7 展望

近20年來，基于高通量分析的系統(tǒng)生物學(xué)研究飛速發(fā)展，組學(xué)研究不斷拓展。組學(xué)研究涉及核酸、蛋白、代謝物、表型等各個(gè)層次，包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等，已成為系統(tǒng)生物學(xué)研究的重要方向。另外，雖然轉(zhuǎn)錄組能夠得到大量表達(dá)序列標(biāo)簽，但鑒于基因表達(dá)調(diào)控發(fā)生在染色體、DNA水平、轉(zhuǎn)錄后、翻譯及翻譯后水平，且存在微效多基因效應(yīng)，因此，僅依靠轉(zhuǎn)錄組分析色素合成的節(jié)點(diǎn)基因仍存在困難。隨著越來越多園藝植物全基因框架的完成及多態(tài)性分子標(biāo)記的開發(fā)，利用QTL定位主效位點(diǎn)，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分離重要基因，是一條行之有效的方法。

［1］ Tanaka Y, Sasaki N, Ohmiya A. Biosynthesis of plant pigments：anthocyanins, betalains and carotenoids［J］. The Plant Journal, 2008, 54（4）：733-749.

［2］ Liu L, Shao Z, Zhang M, et al. Regulation of carotenoid metabolism in tomato［J］. Molecular Plant, 2015, 8：28-39.

［3］ 高慧君, 明家琪, 張雅娟, 等. 園藝植物中類胡蘿卜素合成與調(diào)控的研究進(jìn)展. 園藝學(xué)報(bào)［J］. 2015, 42：1633-1648.

［4］ Jaakola L. New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruits［J］. Trends in Plant Science, 2013, 18（9）：477-483.

［5］ Li W, Liu Y, Zeng S, et al. Gene expression profiling of development and anthocyanin accumulation in kiwifruit（Actinidia chinensis）based on transcriptome sequencing［J］. PLoS One, 2015, 10（8）：e0136439.

［6］ Liu Y, Zeng S, Sun W, et al. Comparative analysis of carotenoid accumulation in two goji（Lycium barbarum L. and L. ruthenicum Murr.）fruits［J］. BMC Plant Biology, 2014, 14（1）：269.

［7］ Ma J, Li J, Zhao J, et al. Inactivation of a gene encoding carotenoid cleavage dioxygenase（CCD4）leads to carotenoid-based yellow coloration of fruit flesh and leaf midvein in peach［J］. Plant Molecular Biology Reporter, 2014, 32（1）：246-257.

［8］ Ohmiya A, Kishimoto S, Aida R, et al. Carotenoid cleavage Dioxygenase（CmCCD4a）contributes to white color formation in chrysanthemum petals［J］. Plant Physiology, 2006, 142：1193-1201.

［9］ Zhang B, Liu C, Wang YQ, et al. Disruption of a CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 4 gene converts flower colour from white to yellow in Brassica species［J］. New Phytologist, 2015, 206（4）：1513-1526.

［10］ Ahn JH, Kim JS, Kim S, et al. De novo transcriptome analysis to identify anthocyanin biosynthesis genes responsible for tissue-specific pigmentation in zoysiagrass（Zoysia japonicaSteud.）［J］. PLoS One, 2015, 10（4）：e0124497.

［11］ Liu Y, Linwang K, Deng C, et al. Comparative transcriptome analysis of white and purple potato to identify genes involved in anthocyanin biosynthesis［J］. PLoS One, 2015, 10（6）：e0129148.

［12］ Fukushima A, Nakamura M, Suzuki H, et al. High-throughput sequencing and de novo assembly of red and green forms of the Perilla frutescens var. crispa transcriptome［J］. PLoS One, 2015, 10（6）：e0129154.

［13］ Hong Y, Tang X, Huang H, et al. Transcriptomic analyses reveal species-specific light-induced anthocyanin biosynthesis in chrysanthemum［J］. BMC Genomics, 2015, 16（1）：1-18.

［14］ Wu ZG, Jiang W, Mantri N, et al. Transciptome analysis reveals flavonoid biosynthesis regulation and simple sequence repeats in yam（Dioscorea alata L.）tubers［J］. BMC Genomics, 2015, 16（1）：346.

［15］ Casimiro-Soriguer I, Narbona E, Buide M, et al. Transcriptome and biochemical analysis of a flower color polymorphism in Silene littorea（Caryophyllaceae）［J］. Frontiers in PlantScience, 2016, 7（939）：204.

［16］ Mushtaq MA, Pan Q, Chen D, et al. Comparative leaves transcriptome analysis emphasizing on accumulation of anthocyanins in brassica：molecular regulation and potential interaction with photosynthesis［J］. Frontiers in Plant Science, 2016, 7：311.

［17］ Lou Q, Liu Y, Qi Y, et al. Transcriptome sequencing and metabolite analysis reveals the role of delphinidin metabolism in flower colour in grape hyacinth［J］. Journal of Experimental Botany, 2014, 65（12）：3157-3164.

［18］ Jin X, Huang H, Wang L, et al. Transcriptomics and metabolite analysis reveals the molecular mechanism of anthocyanin biosynthesis branch pathway in different senecio cruentus cultivars［J］. Frontiers in Plant Science, 2016, 7（107）：1307.

［19］ 宿福園, 姚延興, 李長林, 等. 中國園藝學(xué)會2015年學(xué)術(shù)年會論文摘要集：黑柿花青苷累積的轉(zhuǎn)錄組和表達(dá)譜分析［C］.北京：中國林業(yè)出版社, 2015.

［20］ Yamagishi M, Toda S, Tasaki K. The novel allele of the LhMYB12 gene is involved in splatter-type spot formation on the flower tepals of Asiatic hybrid lilies（Lilium spp.）［J］. New Phytologist, 2014, 201（3）：1009-1020.

［21］ Yuan YW, Sagawa JM, Frost L, et al. Transcriptional control o f floral anthocyanin pigmentation in monkeyflowers（Mimulus）［J］. New Phytologist, 2014, 204（4）：1013-1027.

［22］ Lee JM, Joung JG, Mcquinn R, et al. Combined transcriptome, genetic diversity and metabolite profiling in tomato fruit reveals that the ethylene response factor SlERF6 plays an important role in ripening and carotenoid accumulation［J］. Plant Journal, 2012, 70（2）：191-204.

［23］ Bashandy H, Pieti?inen M, Carvalho E, et al. Anthocyanin biosynthesis in gerbera cultivar ‘Estelle’ and its acyanic sport‘Ivory’［J］. Planta, 2015, 242（3）：601-611.

［24］ EI-Sharkawy I, Liang D, Xu K. Transcriptome analysis of an apple（Malus×domestica）yellow fruit somatic mutation identifies a gene network module highly associated with anthocyanin and epigenetic regulation［J］. Journal of Experimental Botany, 2015, 47 Suppl 1（22）：218-225.

［25］ Xu Y, Feng S, Jiao Q, et al. Comparison of MdMYB1 sequences and expression of anthocyanin biosynthetic and regulatory genes between Malus domestica Borkh. cultivar ‘Ralls’ and its blushed sport. ［J］. Euphytica, 2012, 185（2）：157-170.

［26］ Saminathan T, Bodunrin A, Singh NV. Genome-wide identification of microRNAs in pomegranate（Punica granatum L.）by highthroughput sequencing［J］. BMC Plant Biology, 2016, 16（1）：1-16.

［27］ Xu Q, Liu Y, Zhu A, et al. Discovery and comparative profiling of microRNAs in a sweet orange red-flesh mutant and its wild type［J］. BMC Genomics, 2010, 11（1）：1-17.

［28］ Tzuri G, Zhou X, Chayut N, et al. A ‘golden’ SNP in CmOr governs the fruit flesh color of melon（Cucumis melo）［J］. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2015, 82（2）：267-279.

［29］ Sagawa JM, Stanley LE, Lafountain AM, et al. An R2R3-MYB transcription factor regulates carotenoid pigmentation in Mimulus lewisii flowers［J］. New Phytologist, 2016, 209（3）：1049-1057.

［30］ Zhou Y, Zhou H, Linwang K, et al. Transcriptome analysis and transient transformation suggest an ancient duplicated MYB transcription factor as a candidate gene for leaf red coloration in peach［J］. BMC Plant Biology, 2014, 14（1）：1-13.

［31］ Zhou H, Linwang K, Wang H, et al. Molecular genetics of bloodfleshed peach reveals activation of anthocyanin biosynthesis by NAC transcription factors［J］. Plant Journal, 2015, 82（1）：105-121.

［32］ 朱滿蘭, 王亮生, 張會金, 等. 耐寒睡蓮花瓣中花青素苷組成及其與花色的關(guān)系［J］. 植物學(xué)報(bào), 2012, 47（5）：437-453.

［33］ Wu Q, Wu J, Li SS, et al. Transcriptome sequencing and metabolite analysis for revealing the blue flower formation in wate rlily［J］. BMC Genomics, 2016, 17（1）：897.

［34］ Weiss D. Regulation of flower pigmentation and growth：Multiple signaling pathways control anthocyanin synthesis in expanding petals［J］. Physiologia Plantarum, 2000, 11 0（2）：152-157.

［35］ 胡可, 韓科廳, 戴思蘭. 環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機(jī)理［J］. 植物學(xué)報(bào), 2010, 45（3） ：307-317.

［36］ Zhang HN, Li WC, Wang HC, et al. Transcriptome profiling of light-regulated anthocyanin biosynthesis in the pericarp of litchi［J］. Frontiers in Plant Science, 2016, 07（225）.

［37］ Wu BH, Cao YG, Gu an L, et al. Genome-wide transcriptional profiles of the berry skin of two red grape cultivars（Vitis vinifera）in which anthocyanin synthesis is sunlight-dependent or -independent［J］. PLoS One, 2014, 9（9）：e105959.

［38］ Li P, Li YJ, Zhang FJ, et al. The Arabidopsis UDP-glycosyltransferases UGT79B2 and UGT79B3, contribute to cold, salt and drought stress tolerance via modulating anthocyanin accumulation［J］. The Plant Journal, 2017, 89（1）：85-103.

［39］ Qiu Z, Wang X, Gao J, et al. The tomato hoffman’s anthocyaninless gene encodes a bHLH transcription factor involved in anthocyanin biosynthesis that is developmentally regulated and induced by low temperatures［J］. PLoS One, 2016, 11（3）：e0151067.

［40］ Movahed N, Pastore C, Cellini A, et al. The grapevine VviPrx31 peroxidase as a candidate gene involved in anthocyanin degradation in ripening berries under high temperature［J］. Journal of Plant Research, 2016, 129（3）：513-526.

［41］ Loreti E, Povero G, Novi G, et al. Gibberellins, jasmonate and abscisic acid modulate the sucrose-induced expression of anthocyanin biosynthetic genes in Arabidopsis［J］. New Phytologist, 2008, 179（4）：1004-1016.

［42］ Ji XH, Zhang R, Wang N, et al. Transcriptome profiling reveals auxin suppressed anthocyanin biosynthesis in red-fleshed apple callus（Malus sieversii f. niedzwetzkyana）［J］. Plant Cell, Tissue and Organ Culture（PCTOC）, 2015, 123（2）：389-404.

［43］ Ito S, Nozoye T, Sasaki E, et al. Strigolactone regulates anthocyanin accumulation, acid phosphatases production and plant growth under low phosphate condition in arabidopsis［J］. PLoS One, 2015, 10（3）：e0119724.

［44］ Hsieh L-C, Lin S-I, Shih AC-C, et al. Uncovering small RNA-mediated responses to phosphate deficiency in Arabidopsis by deep sequencing［J］. Plant Physiology, 2009, 151（4）：2120-2132.

［45］ Mardis ER. The impact of next-generation sequencing technology on genetics［J］. Trends in Genetics, 2008, 24（3）：133-141.

［46］ 王云生. 基于高通量測序的植物群體基因組學(xué)研究進(jìn)展［J］.遺傳, 2016, 38（8）：688-699.

［47］ Craig DW, Pearson JV, Szelinger S, et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing［J］. Nature Methods, 2008, 5（10）：887-893.

［48］ Ming R, Vanburen R, Wai CM, et al. The pineapple genome and the evolution of CAM photosynthesis［J］. Nature Genetics, 2015, 47（12）：1435-1442.

［49］ Huang S, Li R, Zhang Z, et al. The genome of the cucumber, Cucumis sativus L.［J］. Nature Genetics, 2009, 41（12）：1275-1281.

［50］ Bolger A, Scossa F, Bolger ME, et al. The genome of the stresstolerant wild tomato species Solanum pennellii［J］. Nature Genetics, 2014, 46（9）：1034-1038.

［51］ Zhang Q, Chen W, Sun L, et al. The genome of Prunus mume［J］. Nature Communications, 2011, 3（4）：187-190.

［52］ Velasco R, Zharkikh A, Affourtit J, et al. The genome of the domesticated apple（Malus × domestica Borkh.）［J］. Nature Genetics, 2010, 42（10）：833-839.

［53］ Qi JJ, Liu X, Shen D, et al. A genomic variation map provides insights into the genetic basis of cucumber domestication and diversity［J］. Nature Genetics, 2013, 45（12）：1510-1515.

［54］ Lin T, Zhu G, Zhang J, et al. Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding［J］. Nature Genetics, 2014, 46（11）：1220-1226.

［55］ Iorizzo M, Ellison S, Senalik D, et al. A high-quality carrot genome assembly provides new insights into carotenoid accumulation and asterid genome evolution［J］. Nature Genetics, 2016, 48（6）：657.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Advances of Transcriptomics in Horticulture Plants Pigments Metabolism

LI Xia WANG Shun-li
（College of Urban and Rural Development，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206）

Pigments mechanism is one of the most important research fields in horticultural plants. Related researches mainly include anthocyanin and carotenoid biosynthesis，which decide the quality and ornamental character of horticultural plants. Using transcriptomic technology，the transcriptional regulation mechanism of horticulture plants can be investigated at the transcriptome level. This paper summarized the recent reports about the isolation of code genes，branch mechanism，new genes isolation，regulatory mechanism，and environment- pigments interaction of fruit trees，vegetables and ornamental plants. The current problems in application were analyzed. The development prospect of transcriptomics in horticultural plants pigments metabolism was also prospected. We hope that it will provide useful information for the regulation mechanism study，important gene isolation and quality orientation breeding of horticulture plants by using transcriptomic technology.

transcriptomics；bioinformatics；pigment metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0018

2017-01-17

2015年度北京農(nóng)學(xué)院青年科學(xué)基金項(xiàng)目（QZK2015007），2015年度北京農(nóng)學(xué)院大北農(nóng)青年教師科研基金項(xiàng)目（15ZK008）

李霞，女，博士，講師，研究方向：園林植物栽培與應(yīng)用、園林植物遺傳育種；E-mail：lixia5966@163.com

王順利，女，博士，副教授，研究方向：園林植物栽培、園林植物遺傳育種和農(nóng)林廢棄物資源化利用；E-mail：wangshunli80@163.com