劉文榮丁若凡張一鳴李宇鵬李玲郭志云

（1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2. 成都市第三人民醫(yī)院病理科，成都 610031）

抗腫瘤多肽9R-P201誘導(dǎo)下的肝癌HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

劉文榮1丁若凡1張一鳴1李宇鵬1李玲2郭志云1

（1. 西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031；2. 成都市第三人民醫(yī)院病理科，成都 610031）

旨在探索多肽9R-P201處理肝癌HepG2細(xì)胞后基因融合、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）突變、可變剪接等事件，并分析差異表達(dá)基因所參與的生物學(xué)進(jìn)程與信號(hào)通路，以期解析多肽9R-P201在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)肝癌細(xì)胞的調(diào)控。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)9R-P201處理肝癌HepG2細(xì)胞前后基因差異表達(dá)情況，tophat-fusion軟件檢測(cè)基因融合，SAMTOOLS軟件檢測(cè)SNP位點(diǎn)，rMATS軟件鑒定可變剪接，使用基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析方法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。結(jié)果共檢測(cè)到可變剪接事件276個(gè)、SNP位點(diǎn)5 557個(gè)、基因融合事件45個(gè)；同時(shí)共得到顯著差異表達(dá)基因 403個(gè)，其中上調(diào)269個(gè)而下調(diào)134個(gè)，基因的功能富集分析結(jié)果顯示差異表達(dá)基因顯著富集細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移等腫瘤相關(guān)生物進(jìn)程，并參與多條與癌癥相關(guān)的信號(hào)通路。研究表明在9R-P201誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞后，導(dǎo)致表達(dá)差異基因顯著與腫瘤生物學(xué)進(jìn)程和通路相關(guān)，并發(fā)生了大量可變剪接、SNP突變、基因融合等事件，這暗示著該多肽有望作為后續(xù)肝癌介入治療潛在藥物分子。

9R-P201；肝細(xì)胞癌；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；基因

在全世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率高居所有腫瘤第二位［1］。目前除了肝移植、手術(shù)以及放化療等治療手段外，分子靶向藥物在治療肝細(xì)胞癌方面也取得了許多重要的進(jìn)展［2］。目前靶向肝細(xì)胞癌藥物主要包括化學(xué)藥物和多肽藥物，其中索拉菲尼、舒尼替尼、瓦他拉尼等分子靶向化學(xué)藥物已在臨床上應(yīng)用［3］。除此之外，靶向肝細(xì)胞癌的多肽藥物的研究也取得明顯進(jìn)展，多肽藥物是由人工合成的或經(jīng)分離純化得到的活性多肽，先前研究發(fā)現(xiàn)一些小分子多肽在抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用。例如，蛋氨酸腦啡肽（Methionine enkephalin，MENK）是具有增強(qiáng)體液免疫和提高細(xì)胞殺傷作用的內(nèi)源性多肽，研究表明MENK通過(guò)精確調(diào)控樹(shù)狀細(xì)胞的阿片類(lèi)藥物受體介導(dǎo)的功能來(lái)發(fā)揮抗腫瘤的活性［4］。研究證實(shí)從家蠶幼蟲(chóng)中分離得到的抗菌肽CecropinXJ 能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡，這暗示著CecropinXJ 或許可作為抗肝癌的多肽藥物［5］。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)噬菌體隨機(jī)12肽庫(kù)篩選得到了一個(gè)多肽9R-P201，實(shí)驗(yàn)證實(shí)9R-P201可顯著抑制肝癌HepG2細(xì)胞的存活、增殖和遷移并誘導(dǎo)凋亡［6，7］。為了探尋多肽9R-P201在轉(zhuǎn)錄組水平抑制肝細(xì)胞癌的形成發(fā)展的機(jī)理，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)?R-P201處理HepG2細(xì)胞前后的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，篩選出了一系列差異表達(dá)基因，并證明其生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株來(lái)自于四川大學(xué)生命學(xué)院，由本實(shí)驗(yàn)室保管；9R-P201購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Biowest公司；Trizol Regent購(gòu)自Invitrogen公司；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞用含有10% 胎牛血清（Biowest），100 IU/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素（Hyclone）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco），并置于37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞3.0×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞融合度達(dá)到80 %左右，用80 μg/mL的9R-P201（上海強(qiáng)耀生物）作用于HepG2細(xì)胞，處理24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)的RNA提取。

1.2.2 RNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 收集好的9R-P201處理和未處理的HepG2細(xì)胞用Trizol試劑（Invitrogen）按試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。1 %瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀（Biotech）鑒定RNA的純度、濃度及完整性，合格的總RNA保存于-80℃冰箱待用。

1.2.3 RNA文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序 RNA檢測(cè)合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠進(jìn)行富集并隨機(jī)打斷，以短片段RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物（random hexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase和DNA polymerase I合成二鏈cDNA。純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR富集得到鏈特異性cDNA文庫(kù)，使用Illumina HiSeq 4000測(cè)序儀進(jìn)行文庫(kù)測(cè)序。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的處理、比對(duì)和組裝 測(cè)序原始測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)去除帶接頭和低質(zhì)量的reads后獲得高質(zhì)量的clean reads。使用Tophat2軟件將clean reads比對(duì)到hg19參考基因組上，用Cufflinks軟件按照hg19參考基因組進(jìn)行組裝［8］。

1.2.5 可變剪接鑒定、基因融合事件鑒定和SNP位點(diǎn)分析 使用rMATS軟件進(jìn)行可變剪接的鑒定，在本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析中我們主要對(duì)常見(jiàn)的5種可變剪接類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用tophat-fusion軟件來(lái)鑒定基因融合，最后使用Circos可視化工具來(lái)繪制基因融合示意圖［9］。將每個(gè)樣品的測(cè)序結(jié)果與參考基因組相比，使用SAMTOOLS軟件檢測(cè)SNP位點(diǎn)，并使用ANNOVAR工具對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)?0］。

1.2.6 差異表達(dá)基因及功能富集分析 采用Audic S算法進(jìn)行差異表達(dá)分析，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate，F(xiàn)DR）校正后的q< 0.05且差異倍數(shù)|log2FC|≥1的視為差異表達(dá)基因，并對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO與信號(hào)通路富集分析，以q < 0.05為顯著性閾值［11，12］。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與差異分析基因分析

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到對(duì)照組和處理組總的reads數(shù)分別有46 698 580和39 332 045條，過(guò)濾得到clean reads數(shù)所占的比例分別為99.45%和97.46%。本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序共檢測(cè)到18 152個(gè)基因，按照差異表達(dá)篩選標(biāo)準(zhǔn)得到差異表達(dá)基因 403個(gè)，其中上調(diào)269個(gè)下調(diào)134個(gè)，我們對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因分析表明9R-P201處理后基因整體呈上調(diào)趨勢(shì)（圖1）。

2.2 可變剪接與基因融合事件鑒定

對(duì)常見(jiàn)的5種可變剪接類(lèi)型的數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中一共檢測(cè)到276個(gè)可變剪接，其中外顯子跳躍（Exon skipping，ES）最多有126個(gè)而內(nèi)含子保留（Intron Retention，RI）最少有12個(gè)，此外3'端可變剪接（Alternative 3' splice site，A3SS）有54個(gè)、5'端可變剪接（Alternative 5' splice site，A5SS）有60個(gè)、互斥外顯子（Mutually exclusive exon，MXE）有24個(gè)（圖2-A）。

異常的融合基因可以引起惡性血液疾病以及腫瘤，為此進(jìn)行了基因融合分析。結(jié)果共鑒定得到45個(gè)基因融合，發(fā)現(xiàn)基因融合事件主要發(fā)生在11號(hào)、12號(hào)和19號(hào)染色體上（圖2-B）。在這45個(gè)基因融合中，F(xiàn)TH1、GAPDH、KRT7等基因與其它基因發(fā)生融合的頻率比較高（表1）。

2.3 SNP分析

通過(guò)在對(duì)照組和處理組進(jìn)行SNP分析發(fā)現(xiàn)在對(duì)照組和處理組中分別得到SNP位點(diǎn)2 180個(gè)和3 377個(gè)，其中對(duì)照組的2 180個(gè)SNP包括816個(gè)非同義突變SNP（Nonsynonymous SNP）和1 364個(gè)同義突變SNP（Synonymous SNP），處理組的3 377個(gè)SNP包括1 249個(gè)非同義突變SNP（Nonsynonymous SNP）和2 128個(gè)同義突變SNP（Synonymous SNP）；同義突變SNP和非同義突變SNP中都包括6種類(lèi)型SNP突變，結(jié)果（圖2-C）發(fā)現(xiàn)C/T的突變頻率最高而A/T的突變頻率最低。

圖1 差異表達(dá)基因分析

2.4 差異表達(dá)基因功能分析

通過(guò)GO和KEGG富集分析對(duì)403個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋?zhuān)詑 < 0.05為顯著性閾值。GO富集分析一共富集上34條GO term，包括生物學(xué)過(guò)程（BP）18條、細(xì)胞成分（CC）8條以及分子功能（MF）8條，其中富集上與腫瘤相關(guān)的GO term有細(xì)胞生長(zhǎng)（q = 5.05E-08）、細(xì)胞移動(dòng)（q = 8.19 E-07）、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（q = 9.91 E-06）等（圖3-A）。KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果（圖3-B）表明，差異表達(dá)基因顯著地富集上腫瘤轉(zhuǎn)錄失調(diào)（q = 4.66 E-08）、細(xì)胞因子受體相互作用（q = 3.84 E-06）、細(xì)胞間隙連接（q = 3.40E-05）等信號(hào)通路。

表1 基因融合事件統(tǒng)計(jì)

3 討論

本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選得到顯著性差異表達(dá)基因有403個(gè)，其中上調(diào)的有269個(gè)而下調(diào)的有134個(gè)。GO和KEGG分析結(jié)果表明差異表達(dá)基因顯著參與了與腫瘤相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程和信號(hào)通路。對(duì)5種主要的可變剪接類(lèi)型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，共得到可變剪接位點(diǎn)276個(gè)。本研究中一共得到SNP位點(diǎn)5 557個(gè)。在SNP位點(diǎn)中，非同義突變SNP位點(diǎn)有2 065個(gè)而同義突變SNP位點(diǎn)有3 492個(gè)，同義突變所占的比例在70%左右而非同義突變占30%左右，這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致［13］。同時(shí)在SNP突變類(lèi)型中，C/T和A/G突變的頻率最高，這可能是因?yàn)樵谌祟?lèi)基因組中存在大量的CpG島，同時(shí)CpG島中的C常常是甲基化的并容易發(fā)生脫氨基而轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)［14］。另外，我們這些獲取的SNP位點(diǎn)還存在一定的假陽(yáng)性，如肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，其染色體經(jīng)常存在非整數(shù)倍的染色體變化并且包含如刪除和復(fù)制等的染色體改變，這些染色體的變化會(huì)直接影響SNP的檢測(cè)結(jié)果［15］。由于RNA-seq檢測(cè)的RNA在進(jìn)行編輯的過(guò)程中也會(huì)導(dǎo)致序列變異從而可能被錯(cuò)誤地注釋為SNP，因此一些檢測(cè)到的序列變異有可能是RNA編輯位點(diǎn)，而不是真正的SNP［16，17］。此外，由于無(wú)法保證對(duì)照組與處理組RNA樣本的完全一致，多肽9R-P201處理后導(dǎo)致的SNP中還會(huì)存在由于對(duì)照組與處理組RNA樣本不一致導(dǎo)致的SNP假陽(yáng)性。對(duì)基因融合進(jìn)行鑒定，共得到45個(gè)基因融合位點(diǎn)，其中FTH1基因與其它基因發(fā)生融合的次數(shù)有17次；研究發(fā)現(xiàn)FTH1基因在離子儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用并調(diào)控細(xì)胞內(nèi)離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)［18］。

綜上所述，這些顯著差異表達(dá)的基因可能在多肽9R-P201激活的生物學(xué)功能和信號(hào)通路中起著重要的功能。同時(shí)可變剪接、SNP位點(diǎn)、基因融合等基因組結(jié)構(gòu)的改變也暗示多肽9R-P201在這些事件上對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的調(diào)控影響。當(dāng)然，9R-P201對(duì)于肝癌細(xì)胞的調(diào)控不僅局限于基因來(lái)發(fā)揮作用，通過(guò)發(fā)現(xiàn)更多的9R-P201下游調(diào)控因子以及信號(hào)通路將為基于9R-P201多肽為基礎(chǔ)的藥物開(kāi)發(fā)將提供更多的支撐。

圖2 可變剪接、基因融合、SNP分析結(jié)果

4 結(jié)論

在肝癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中涉及多個(gè)與癌癥相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路的改變。本研究分析了肝癌HepG2細(xì)胞在9R-P201作用下基因差異表達(dá)情況、可變剪接、SNP位點(diǎn)和基因融合等。共得到可變剪接位點(diǎn)276個(gè)、SNP位點(diǎn)5 557個(gè)及基因融合位點(diǎn)45個(gè)。此外，還得到顯著差異表達(dá)的基因 403個(gè)，其中上調(diào)269個(gè)，下調(diào)134個(gè)?；蚬δ茏⑨尳Y(jié)果表明差異表達(dá)基因富集上多個(gè)與腫瘤密切相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程和信號(hào)通路，預(yù)示這些基因在9R-P201對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

［1］Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide：sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012［J］. Int J Cancer, 2015, 136（5）：E359-386.

［2］Brito AF, Abrantes AM, Tralh?o JG, et al. Targeting hepatocellular carcinoma：what did we discover so far?［J］. Oncology Reviews, 2016, 10（2）：302.

［3］Deng GL, Zeng S, Shen H. Chemotherapy and target therapy for hepatocellular carcinoma：New advances and challenges［J］. World Journal of Hepatology, 2015, 7（5）：787-798.

［4］Meng Y, Gao X, Chen W, et al. Methionine enkephalin（MENK）mounts antitumor effect via regulating dendritic cells（DCs）［J］. International Immunopharmacology, 2017, 44：61-71.

［5］Xia L, Wu Y, Ma JI, et al. The antibacterial peptide from Bombyxmori cecropinXJ induced growth arrest and apoptosis in human hepatocellular carcinoma cells［J］. Oncology Letters, 2016, 12（1）：57-62.

［6］Cui J, Huang J, Guo T, et al. Expression and selection of human foxm1c binding peptides and yheir inhibitions on MCF7 cancer cells［J］. Int J Pept Res Ther, 2014, 20（4）：447-456.

［7］Bi Z, Liu W, D ing R, et al. A novel peptide, 9R-P201, strongly inhibits the viability, proliferation and migration of liver cancer HepG2 cells and induces apoptosis by down-regulation of FoxM1 expression［J］. Eur J Pharmacol, 2017, 796：175-189.

［8］Trapnell C, Roberts A, Goff L, et al. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq e xperiments with TopHat and Cufflinks［J］. Nature Protocols, 2012, 7（3）：562-578.

［9］Kim D, Salzberg SL. TopHat-Fusion：an algorithm for discovery of novel fusion transcripts［J］. Genome Biol, 2011, 12（8）：R72.

［10］Li HD, Menon R, Omenn GS, et al. The emerging era of genomic data integration for analyzing splice isoform function［J］. Trends in Gene tics：TIG, 2014, 30（8）：340-347.

［11］Thomas PD, Mi H, Lewis S. Ontology annotation：mapping genomic regions to biological function［J］. Current Opinion in Chemical Biology, 2007, 11（1）：4-11.

［12］Kanehi sa M, Araki M, Goto S, et al. KEGG for linking genomes to life and the environment［J］. Nucleic Acids Res, 2008, 36：D480-484.

［13］ Koberle B, Koch B, Fischer BM, et al. Single nucleotide polymorphisms i n DNA repair genes and putative cancer risk［J］. Archives of Toxicology, 2016, 90（10）：2369-2388.

［14］Shastry BS. SNPs：impact on gene function and phenotype［J］. Methods in Molecular Biology, 2009, 578：3-22.

［15］Chen J, Driguneswar P, Shravan K, et al. Selecting c ell lines for SNP human identification assay development［J］. Atlas Journal of Biotechnology, 2011, 1（1）：21-26, 2011.

［16］Gommans WM, Tatalias NE, Sie CP, et al. Screening of human SNP database identifies recoding sites of A-to-I RNA editing［J］. RNA, 2008, 14（10）：2074-2085.

［17］Eisenberg E, Adamsky K, Cohen L, et al. Identification of RNA editing sites in the SNP database［J］. Nucleic Acids Research, 2005, 33（14）：4612-4617.

［18］Guo J, Xu N, Yao Y, et al. Efficient expression of rec ombinant human heavy chain ferritin（FTH1）with modified peptides［J］. Protein Expression and Purification, 2016, 131：101-108.

圖3 差異表達(dá)基因功能富集分析

（責(zé)任編輯 李楠）

Transcriptome Sequencing Analysis of Hepatocellular Carcinoma HepG2 Cells Induced by Antitumor Peptide 9R-P201

LIU Wen-rong1DING Ruo-fan1ZHANG Yi-ming1LI Yu-peng1LI Ling2GUO Zhi-yun1
（1. School of Life Science and Engineering，Southwest Jiaotong University，Chengdu 610031；2. Department of Pathology，the Third People’s Hospital of Chengdu，Chengdu 610031）

This wok aims to elucidate the regulation of 9R-P201 on hepatoma cells（HepG2）at transcriptome level by investigating the gene fusion，SNP（Single Nucleotide Polymorphism）mutation，alternative splicing and other events after 9R-P201 treating HepG2，and analyzing the biological processes and signaling pathways involved by differentially expressed genes. The expression differences of the genes before and after the 9R-P201 treating HepG2 cell line were detected by transcriptome sequencing. Meanwhile，gene fusion，SNPs，and alternative splicing were identified by tophat-fusion，SAMTOOLS software，and rMATS respectively. Functional enrichment analysis of differentially expressed genes were performed by GO（Gene Ontology）and KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）. As results，276 alternative splicing events，5 557 SNP sites，and 45 gene fusion events were detected in the transcriptome sequencing. In addition，403 differentially expressed genes including 269 up-regulated and 134 down-regulated were detected. Gene GO and KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes were significantly involved in the biological processes of cell growth，locomotion，as well as a number of cancer-related signaling pathways. In conclusion，the study revealed that the differentially expressed genes resulted from 9R-P201 treating HepG2 were significantly correlated with the biological processes and signaling pathways related to cancer and hepatocellular carcinoma HepG2 cell line，and a large number of alternative splicing events，SNP mutations，gene fusion events after 9R-P201 inducement occurred，suggesting this peptide may be used as a potential drug for subsequent hepatocellular carcinoma interventional therapy.

9R-P201；hepatocellular carcinoma；transcriptome sequencing；gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0053

2017-01-26

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金（2682016YXZT04），國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（201610613066）

劉文榮，男，碩士研究生，研究方向：非編碼RNA結(jié)構(gòu)與功能；E-mail：liuzimu1992@gmail.com

郭志云，男，副教授，研究方向：生物信息學(xué)；E-mail：zhiyunguo@gmail.com