高 珊，孔立紅，余超超，姚國晉

·論著·

不同頻率電針治療阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)性病變的機(jī)制研究

高 珊，孔立紅*，余超超，姚國晉

目的 探討不同頻率電針治療阿爾茨海默病(AD)大鼠神經(jīng)性病變的機(jī)制，為臨床上采用電針治療AD提供理論依據(jù)。方法 2016年3—6月，選擇健康的SPF級Wistar雄性大鼠90只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行Morris水迷宮實驗，篩選合格后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組和50 Hz電針治療組(每組15只)。正常組不做任何處理。模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組和50 Hz電針治療組注射寡聚體Aβ1-42溶液建造AD模型。假手術(shù)組采用0.9 %氯化鈉溶液建造假手術(shù)模型，并再次進(jìn)行Morris水迷宮實驗確認(rèn)造模成功。造模完成后，2 Hz電針治療組采用G6805-Ⅱ型電針治療儀針刺百會穴、腎俞穴進(jìn)行治療，30 Hz電針治療組和50 Hz電針治療組除電針頻率分別選擇30 Hz和50 Hz外，其他所有參數(shù)和操作同2 Hz電針治療組。正常組、模型組、假手術(shù)組與2 Hz、30 Hz、50 Hz電針治療組同樣進(jìn)行抓取，但不做任何處理后放回。治療結(jié)束后處死各組大鼠，取大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)組織待測。采用Western blotting法檢測各組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Tau蛋白及其磷酸化〔Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)〕、14-3-3ζ、α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)表達(dá)水平。結(jié)果 模型組大腦海馬區(qū)Tau表達(dá)水平低于正常組，Tau(pS262)、Tau(pS396)表達(dá)水平高于正常組(P<0.05)；50 Hz電針治療組Tau表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，Tau(pS262)、Tau(pS396)表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組(P<0.05)。模型組大腦皮質(zhì)區(qū)Tau表達(dá)水平低于正常組，Tau(pS262)、Tau(pS404)表達(dá)水平高于正常組(P<0.05)；50 Hz電針治療組Tau表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，Tau(pS404)表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組(P<0.05)。模型組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ表達(dá)水平高于正常組，海馬區(qū)AMPA表達(dá)水平低于正常組(P<0.05)；50 Hz電針治療組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，海馬區(qū)AMPA表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組(P<0.05)。結(jié)論 不同電針治療AD大鼠可能是通過調(diào)節(jié)Tau蛋白及其磷酸化水平以及相關(guān)蛋白(14-3-3ζ、AMPA受體蛋白)的表達(dá)水平來改善AD大鼠的神經(jīng)性病變，進(jìn)而達(dá)到治療AD的效果。

阿爾茨海默??；電針；Tau蛋白質(zhì)類

高珊，孔立紅，余超超，等.不同頻率電針治療阿爾茨海默病大鼠神經(jīng)性病變的機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(12)：1449-1456.[www.chinagp.net]

GAO S,KONG L H,YU C C,et al.Mechanism of different frequencies of electroacupuncture in treating neuropathy in rats with Alzheimer′s disease [J].Chinese General Practice，2017，20(12)：1449-1456.

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿的慢性進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，又稱老年癡呆，其主要的病理改變?yōu)槔夏臧?senile plaques，SP)和神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)以及神經(jīng)元的損傷和丟失[1]。神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白Tau蛋白的異常磷酸化能夠形成雙螺旋細(xì)絲(PHF)，是NFTs發(fā)生、發(fā)展的重要原因[2]。Tau蛋白的異常磷酸化還會影響α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體的數(shù)量，造成AMPA受體功能異常，引發(fā)認(rèn)知功能障礙[3]。此外，14-3-3β/ζ蛋白與異常磷酸化的Tau蛋白關(guān)系密切，參與AD時NFTs的形成，與AD的患病進(jìn)程呈正相關(guān)[4]。本研究針對AD大鼠采用不同頻率的電針(低、中、高頻)對百會穴、腎俞穴[1,5]進(jìn)行針刺治療，采用Western blotting法和石蠟切片免疫熒光法從蛋白水平分別檢測各組大鼠治療前后的Tau蛋白及其磷酸化和14-3-3ζ、AMPA受體蛋白，觀察不同頻率電針對Tau蛋白及其磷酸化水平和14-3-3ζ、AMPA受體蛋白的影響，以探討不同頻率電針治療AD大鼠神經(jīng)性病變的機(jī)制，為臨床上采用電針治療AD提供理論依據(jù)。

本研究創(chuàng)新之處：

從Tau蛋白及下游靶蛋白表達(dá)水平的角度研究不同頻率電針治療阿爾茨海默病的分子機(jī)制。從海馬和皮質(zhì)兩方面探討不同頻率電針刺激對阿爾茨海默病大鼠腦中Tau及其磷酸化和下游蛋白的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康的SPF級Wistar雄性大鼠90只，4～5個月，體質(zhì)量(300±50)g，由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK(鄂)2008-0005，屏障環(huán)境飼養(yǎng)，平均溫度(22±2)℃，濕度55%左右。整個動物實驗過程遵守實驗動物倫理學(xué)規(guī)定。

1.2 實驗儀器 DW-5大鼠腦立體定位儀和Morris水迷宮系統(tǒng)購于成都泰盟科技有限公司；G6805-Ⅱ型電針治療儀購于上海醫(yī)療器械股份有限公司；HT7700透射電鏡購于日立公司(日本)；EMUC7切片機(jī)和石蠟切片機(jī)購于萊卡公司(德國)；28號1寸不銹鋼毫針購于蘇州華佗醫(yī)療用品廠有限公司；IMS圖像分析系統(tǒng)購于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；倒置顯微鏡購于OLYMPUS公司(日本)；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購于上海天能科技有限公司。

1.3 Morris水迷宮實驗及空間探索實驗 (1)Morris水迷宮實驗裝置及動態(tài)圖像分析系統(tǒng)：迷宮水池中的平臺位于第3象限正中，水面高出平臺1 cm，將大鼠面向池壁分別從4個象限放入池中，由計算機(jī)記錄各種參數(shù)。大鼠2 min內(nèi)找到并爬上平臺的時間即為逃避潛伏期，逃避潛伏期最長為2 min。如果大鼠2 min內(nèi)未找到平臺，需將其牽引至平臺，這時逃避潛伏期記錄為2 min。2次/d，連續(xù)記錄5 d大鼠找到平臺所需的逃避潛伏期及運動軌跡，然后計算測試結(jié)果的平均成績。(2)空間探索實驗：第5天撤去平臺，任意選擇一個入水點將大鼠放入池中，記錄大鼠的運動軌跡，并計算大鼠跨越平臺的時間和次數(shù)。

1.4 實驗時間及分組 2016年3—6月，將90只SPF級Wistar雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行Morris水迷宮實驗，檢測大鼠的行為記憶能力，篩選并剔除不合格大鼠(平均逃避潛伏期>2 min)，并隨機(jī)補(bǔ)充至90只。將篩選出的合格SPF級Wistar雄性大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、假手術(shù)組、模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組和50 Hz電針治療組，每組15只。

1.5 實驗動物造模 正常組不做任何處理。模型組注射寡聚體Aβ1-42溶液建造AD模型，具體為：采用磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成濃度為1 μg/μl的Aβ1-42溶液，置于37 ℃恒溫箱中孵育7 d，使其變成具有神經(jīng)毒性的寡聚體狀態(tài)；大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 g/kg)麻醉后，將其在DW-5大鼠腦立體定位儀上俯臥位固定，要求前后囟水平，將頭皮剪開，使前囟充分暴露，并參照腦立體定位圖譜予以定位，使用牙科鉆在前囟門向后3.2 mm，中線左右分別旁開2.5 mm處，分別鉆開一個直徑為1 mm左右的小孔穿顱，將微量注射器針尖從顱骨表面緩慢垂直插入3.5 mm，分別到達(dá)雙側(cè)海馬齒狀回(DG)區(qū)；5 min內(nèi)分別注射Aβ1-425 μl，注射完成后繼續(xù)留針5 min，以1.0 mm/min速度拔針，以防止藥物溢出；連續(xù)3 d。假手術(shù)組采用0.9 %氯化鈉溶液建造假手術(shù)模型，具體處理方法與模型組相同，但在雙側(cè)腦室DG區(qū)注射5 μl 0.9 %氯化鈉溶液，連續(xù)3 d。2 Hz、30 Hz、50 Hz電針治療組均建造AD模型，具體方法與試劑同模型組。2周后(以造模第1天開始計算)對各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實驗，記錄各組大鼠平均逃避潛伏期和空間探索實驗中在原平臺象限的停留時間和次數(shù)，如果大鼠60 s內(nèi)未找到平臺，即認(rèn)為造模成功。

1.6 治療方法 造模完成后，2 Hz電針治療組采用G6805-Ⅱ型電針治療儀針刺百會穴、腎俞穴，百會穴向前平刺3～5 mm，腎俞穴稍向內(nèi)斜刺5 mm，百會穴、腎俞穴分別接負(fù)極和正極，左右側(cè)腎俞每日交替使用；選擇連續(xù)波，頻率2 Hz，電壓2～4 V，電流1～2 mA，留針20 min；1次/d，7 d為1療程，2個療程間休息1 d，共治療2個療程。30 Hz電針治療組和50 Hz電針治療組除電針頻率分別選擇30 Hz和50 Hz外，其他所有參數(shù)和操作同2 Hz電針治療組。正常組、模型組、假手術(shù)組與2 Hz、30 Hz、50 Hz電針治療組同樣進(jìn)行抓取，但不做任何處理后放回。治療結(jié)束后各組大鼠斷頭處死，迅速取腦組織，冰凍保存待測。

1.7 石蠟切片免疫熒光染色 將大鼠海馬區(qū)組織和皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行石蠟包埋與固定，對石蠟切片脫蠟至水，采用PBS(pH=7.4)洗滌3次，3 min/次，抗原修復(fù)后使用PBS洗滌3次，3 min/次；洗滌結(jié)束后將玻片置于3%雙氧水中，濕盒孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再采用PBS洗滌3次，3 min/次；加入一抗稀釋液置于濕盒中4 ℃過夜或室溫孵育1 h；孵育時間結(jié)束后使用PBS洗滌3次，5 min/次；洗滌后將玻片置于濕盒中，加入熒光二抗稀釋液置于37 ℃孵育1 h(避光孵育)，孵育結(jié)束后采用PBS洗滌5次，3 min/次；最后在玻片上滴加抗熒光猝滅封片劑(含DAPI染色液)15～20 μl，蓋上蓋玻片，避免氣泡。采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，拍照記錄〔抗體信息及稀釋比例：Tau(ab80579；1∶100)、Tau(pS262)(ab131354；1∶100)、Tau(pS396)(ab109390；1∶50)、Tau(pS404)(ab131338；1∶200)〕。

1.8 Western blotting法檢測大鼠海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)組織中Tau蛋白及其磷酸化水平、14-3-3ζ受體蛋白水平、AMPA受體蛋白水平 將大鼠海馬區(qū)組織和皮質(zhì)區(qū)組織剪碎后加入一定量的組織裂解液，勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后4 ℃下12 000×g離心15 min，取上清液，采用BCA比色法測定蛋白含量。取10 μg加熱變性的蛋白12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)轉(zhuǎn)膜，然后加入5 %脫脂牛奶溶液進(jìn)行封固，加一抗4 ℃振蕩過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗結(jié)合1 h，采用ECL顯色試劑盒顯示目的條帶，最后采用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀進(jìn)行檢測。使用AlphaEaseFC軟件對Western blotting圖片進(jìn)行灰度定量分析〔抗體信息及稀釋比例：Tau(ab80579；1∶500)、Tau(pS262)(ab131354；1∶500)、Tau(pS396)(ab109390；1∶20 000)、Tau(pS404)(ab131338；1∶500)、14-3-3ζ(SC1019；1∶200)、AMPA(AB109450；1∶2 000)、β-actin(#4970；1∶1 000)〕。

2 結(jié)果

2.1 各組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Tau蛋白及其磷酸化水平比較 6組大腦海馬區(qū)Tau(pS404)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；6組大腦海馬區(qū)Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大腦海馬區(qū)Tau表達(dá)水平低于正常組，Tau(pS262)、Tau(pS396)表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；50 Hz電針治療組Tau表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，Tau(pS262)、Tau(pS396)表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1、圖1)。各組大鼠大腦海馬區(qū)Tau蛋白及其磷酸化的免疫熒光結(jié)果同Western blotting結(jié)果一致(見圖2～5，本文圖2～5彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章)。6組大腦皮質(zhì)區(qū)Tau(pS396)表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；6組大腦皮質(zhì)區(qū)Tau、Tau(pS262)、Tau(pS404)表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大腦皮質(zhì)區(qū)Tau表達(dá)水平低于正常組，Tau(pS262)、Tau(pS404)表達(dá)水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；50 Hz電針治療組Tau表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，Tau(pS404)表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖6)。

注：1～3為正常組，4～6為假手術(shù)組，7～9為模型組，10～11為2 Hz電針治療組，12～13為30 Hz電針治療組，14～16為50 Hz電針治療組

圖1 各組大鼠大腦海馬區(qū)Tau蛋白及其磷酸化水平

Figure 1 Expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein in the hippocampus of rats in 6 groups

表1 6組大腦海馬區(qū)Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)表達(dá)水平比較±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與2 Hz電針治療組比較，cP<0.05；與30 Hz電針治療組比較，dP<0.05

注：A為正常組，B為假手術(shù)組，C為模型組，D為2 Hz電針治療組，E為30 Hz電針治療組，F(xiàn)為50 Hz電針治療組

圖2 6組大鼠海馬區(qū)石蠟切片Tau蛋白水平(免疫熒光染色，×400)

Figure 2 Expression levels of Tau protein in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A為正常組，B為假手術(shù)組，C為模型組，D為2 Hz電針治療組，E為30 Hz電針治療組，F(xiàn)為50 Hz電針治療組

圖3 6組大鼠海馬區(qū)石蠟切片Tau(pS262)水平(免疫熒光染色，×400)

Figure 3 Expression levels of Tau(pS262) in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A為正常組，B為假手術(shù)組，C為模型組，D為2 Hz電針治療組，E為30 Hz電針治療組，F(xiàn)為50 Hz電針治療組

圖4 6組大鼠海馬區(qū)石蠟切片Tau(pS396)水平(免疫熒光染色，×400)

Figure 4 Expression levels of Tau(pS396)in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

注：A為正常組，B為假手術(shù)組，C為模型組，D為2 Hz電針治療組，E為30 Hz電針治療組，F(xiàn)為50 Hz電針治療組

圖5 6組大鼠海馬區(qū)石蠟切片Tau(pS404)水平(免疫熒光染色，×400)

Figure 5 Expression levels of Tau(pS404)in paraffin sections of the hippocampus of rats in the 6 groups

表2 6組大腦皮質(zhì)區(qū)Tau、Tau(pS262)、Tau(pS396)、Tau(pS404)表達(dá)水平比較±s)

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與2 Hz電針治療組比較，cP<0.05；與30 Hz電針治療組比較，dP<0.05

2.2 各組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ、AMPA表達(dá)水平比較 6組大腦皮質(zhì)區(qū)AMPA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；6組大腦海馬區(qū)14-3-3ζ、AMPA表達(dá)水平及大腦皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ表達(dá)水平高于正常組，海馬區(qū)AMPA表達(dá)水平低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；50 Hz電針治療組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ表達(dá)水平低于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，海馬區(qū)AMPA表達(dá)水平高于模型組、2 Hz電針治療組、30 Hz電針治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3、圖7～8)。

表3 6組大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ、AMPA表達(dá)水平比較±s)

注：AMPA=α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與2 Hz電針治療組比較，cP<0.05；與30 Hz電針治療組比較，dP<0.05

注：1～3為正常組，4～6為假手術(shù)組，7～9為模型組，10～11為2 Hz電針治療組，12～13為30 Hz電針治療組，14～16為50 Hz電針治療組

圖6 6組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)Tau蛋白及其磷酸化水平

Figure 6 Expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein in the cerebral cortex of rats in 6 groups

注：1～3為正常組，4～6為假手術(shù)組，7～9為模型組，10～11為2 Hz電針治療組，12～13為30 Hz電針治療組，14～16為50 Hz電針治療組；AMPA=α氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸

圖7 6組大鼠大腦海馬區(qū)14-3-3ζ、AMPA受體蛋白表達(dá)水平

Figure 7 Expression levels of 14-3-3ζ and AMPA receptor protein in the hippocampus of rats in 6 groups

注：1～3為正常組，4～6為假手術(shù)組，7～9為模型組，10～11為2 Hz電針治療組，12～13為30 Hz電針治療組，14～16為50 Hz電針治療組

圖8 6組大鼠大腦皮質(zhì)區(qū)14-3-3ζ、AMPA受體蛋白表達(dá)水平

Figure 8 Expression levels of 14-3-3ζ and AMPA receptor protein in the cerebral cortex of rats in 6 groups

3 討論

AD是老年人常見的多因素致病的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，而NFTs是其主要的病理改變之一。Tau蛋白是神經(jīng)元中最主要的微管相關(guān)蛋白，可促進(jìn)微管組裝并維持微管的穩(wěn)定性。在AD形成過程中Tau蛋白的過度磷酸化擾亂微管的穩(wěn)定性，以配對螺旋絲結(jié)構(gòu)形成NFTs并聚積在神經(jīng)元內(nèi)[6-7]。此外，有研究顯示，Tau蛋白的異常磷酸化與AD患者學(xué)習(xí)記憶障礙和神經(jīng)變性的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)系[3,8]。以上研究均表明，Tau蛋白的異常磷酸化在AD發(fā)病中起重要作用。14-3-3蛋白具有廣泛的生物學(xué)功能，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，細(xì)胞凋亡、增殖、生存等基本生命進(jìn)程。而卜碧濤等[4]、夏亦元[9]的實驗也證實，14-3-3蛋白參與NFTs的形成，并參與調(diào)控Tau蛋白的磷酸化。此外，除NFTs外，神經(jīng)突觸可塑性改變也是AD發(fā)生的病理特征之一[10]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)棘突觸后膜的興奮性氨基酸受體AMPA受體數(shù)量的改變和受體轉(zhuǎn)運是造成神經(jīng)突觸可塑性改變的重要因素之一[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Tau蛋白的過度磷酸化能夠顯著減少突觸后膜AMPA受體的數(shù)量，進(jìn)而造成AMPA受體在突觸后膜上的運輸功能異常，最終導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[3]。

臨床研究顯示，針灸治療AD有一定療效，且安全性較好，在療效和總有效率上較藥物治療有優(yōu)勢[11]。對AD模型大鼠來說，電針治療可通過改善AD模型大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白表達(dá)水平或者改善海馬神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)(神經(jīng)元線粒體、突觸形態(tài)可塑性等)來提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[10,12-13]。吳羽楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，電針治療可通過抑制小鼠海馬區(qū)Tau蛋白磷酸化水平來改善轉(zhuǎn)基因癡呆模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。但電針治療AD與Tau蛋白及其磷酸水平之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

此外，電針頻率作為電針刺激的重要參數(shù)之一，不同頻率的電針刺激對疾病的影響有所不同。肖貽財?shù)萚15]研究發(fā)現(xiàn)，不同電針頻率對局灶性腦缺血大鼠腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性不同，其中中頻電針的效應(yīng)最好，可能有神經(jīng)保護(hù)作用，但100 Hz高頻電針處理則無明顯影響。而在張亢亢等[16]研究發(fā)現(xiàn)，電針能夠通過增強(qiáng)突觸可塑性實現(xiàn)對AD大鼠的治療，且治療作用與電針頻率有關(guān)，50 Hz高頻電針效果最佳。針對電針治療神經(jīng)疾病，有些是高頻電針的作用優(yōu)于低頻電針，有些是低頻電針的作用優(yōu)于高頻。

本研究構(gòu)建AD大鼠模型，采用不同頻率的電針儀針刺百會穴、腎俞穴治療AD大鼠。與正常組比較，模型組大鼠大腦海馬區(qū)、皮質(zhì)區(qū)Tau表達(dá)水平降低，Tau蛋白磷酸化水平以及參與Tau蛋白磷酸化影響AD進(jìn)程的14-3-3ζ蛋白水平均明顯升高；此外，受Tau蛋白磷酸化水平影響的突觸后膜AMPA受體蛋白的表達(dá)水平在AD大鼠海馬區(qū)中明顯下調(diào)。而使用電針治療后，尤其是50 Hz電針治療組大鼠Tau蛋白及其磷酸化水平均有所恢復(fù)，同時14-3-3ζ、AMPA受體蛋白水平也有所恢復(fù)；表明高頻電針可改善AD大鼠的神經(jīng)元纖維纏結(jié)，進(jìn)而改善學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，本研究提示不同頻率電針治療AD大鼠可能是通過調(diào)節(jié)Tau蛋白及其磷酸化水平以及相關(guān)蛋白的表達(dá)水平來改善AD大鼠的神經(jīng)性病變，進(jìn)而達(dá)到治療AD的效果。

作者貢獻(xiàn)：孔立紅進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；高珊進(jìn)行研究的實施與可行性分析、數(shù)據(jù)收集、撰寫論文；余超超進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；姚國晉進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理；高珊、姚國晉進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；高珊、孔立紅進(jìn)行論文修訂；孔立紅進(jìn)行負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：毛亞敏)

Mechanism of Different Frequencies of Electroacupuncture in Treating Neuropathy in Rats with Alzheimer′s Disease

GAOShan,KONGLi-hong*,YUChao-chao,YAOGuo-jin

HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430000，China

*Correspondingauthor:KONGLi-hong，Professor；E-mail:xiyu1618@sina.com

Objective To explore the mechanism of different frequencies of eletroacupuncture in the treatment of neuropathy in Alzheimer′s disease(AD) rats,so as to provide a theoretical basis for clinical treatment of AD with electroacupuncture.Methods This study was conducted between March and June 2016.Ninety healthy male Wistar rats(SPF) were selected and qualified rats were screened by Morris water maze after 1 week of adaptive feeding.Then the qualified rats were divided into normal group,sham operation group,model group,2 Hz,30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups according to the random number table method with 15 in each.The normal group was not given any treatment.The AD rats were established by injecting Aβ1-42oligomer into the lateral cerebral ventricle in model group,2 Hz,30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups,whereas the rats in the sham operation group were constructed with 0.9% sodium chloride solution.And the success of modeling was confirmed by Morris water maze test again.After that,the rats in 2 Hz electroacupuncture treatment group were treated by G6805-Ⅱtype electroacupuncture instrument stimulation at Baihui and Shenshu acupoints with the frequency of 2 Hz.The rats in the 30 Hz and 50 Hz electroacupuncture treatment groups received the same treatment with the same parameters and operations as the 2 Hz electroacupuncture treatment group received except for electroacupuncture frequencies,30 Hz was selected for the 30 Hz electroacupuncture treatment group,and 50 Hz for the 50 Hz electroacupuncture treatment group.The rats in normal group,model group and sham operation group were grabbed in the same way as those rats in the electroacupuncture treatment groups but were put back without any treatment.The rats were sacrificed after intervention and samples of brain hippocampus,cortical tissues were collected.The expression levels of Tau protein,levels of phosphorylated Tau protein at serine 262,369,404 sites〔Tau(pS262),Tau(pS396),Tau(pS404)〕,14-3-3ζ and AMPA receptor protein in hippocampus and cortical tissue of rats were detected by Western blotting.Results Compared with the normal group,the expression levels of Tau protein in hippocampus tissue of AD rats in model group significantly decreased(P<0.05),whereas the levels of Tau(pS262) and Tau(pS396) increased obviously(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had higher expression level of Tau protein but lower expression levels of Tau(pS262) and Tau(pS396) in the hippocampus tissue than model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).Compared with the normal group,the model group had lower expression level of Tau protein and higher expression levels of Tau(pS262) and Tau(pS404) in the cerebral cortex(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had higher expression level of Tau protein whereas lower expression level of Tau(pS404) in the cerebral cortex than the model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).The expression levels of 14-3-3ζ in the hippocampus and cortex of the model group were higher than those in the normal group,whereas the expression level of AMPA receptor protein in hippocampus was lower than that in the normal group(P<0.05).The 50 Hz electroacupuncture treatment group had lower expression levels of 14-3-3ζ in hippocampus and cortex but higher expression level of AMPA receptor protein in hippocampus than the model group,2 Hz and 30 Hz electroacupuncture treatment groups(P<0.05).Conclusion Different frequencies of electroacupuncture treatment probably improved the neuropathy of AD rats by regulating the expression levels of Tau protein and phosphorylated Tau protein and related proteins(14-3-3ζ and AMPA),and thus achieved the effect of the treatment of AD.

Alzheimer′s disease；Electroacupuncture；Tau proteins

國家自然科學(xué)基金資助項目(81373741)——電針不同頻率調(diào)控糖原合酶激酶3β對阿爾滋海默大鼠神經(jīng)突觸可塑性影響及機(jī)制的研究

R 745.7

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.12.009

2017-01-12；

2017-03-09)

430000湖北省武漢市，湖北中醫(yī)藥大學(xué)

*通信作者：孔立紅，教授；E-mail:xiyu1618@sina.com