潘文平，康 浩，康 永

（1.荔浦師范學(xué)校，廣西 桂林 546600；2.南寧市第一中學(xué)，南寧 530012；3.西北工業(yè)大學(xué)，西安 710072）

構(gòu)筑山羊卵母細(xì)胞體外成熟體系的研究

潘文平1，康 浩2，康 永3

（1.荔浦師范學(xué)校，廣西 桂林 546600；2.南寧市第一中學(xué)，南寧 530012；3.西北工業(yè)大學(xué)，西安 710072）

在細(xì)胞核移植過程中，體細(xì)胞必須在卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重編程以恢復(fù)其全能性，卵母細(xì)胞成熟度直接影響體細(xì)胞重編程，故卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)是體細(xì)胞核移植極其重要的環(huán)節(jié)，而卵母細(xì)胞又受環(huán)境、培養(yǎng)液濃度、培養(yǎng)溫度等影響。文章通過探討不同濃度的FSH和LH及HMG影響山羊卵母細(xì)胞體外成熟因素的研究，建立了山羊卵母細(xì)胞體外成熟體系，為山羊核移植及以后的優(yōu)良育種奠定基礎(chǔ)。

卵母細(xì)胞；FSH；LH；HMG；體外成熟；山羊

卵母細(xì)胞的成熟是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的過程，有許多代謝事件發(fā)生，除了進(jìn)行積極的mRNAs轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成外，還有其他一些物質(zhì)的降解［1］。在體外成熟培養(yǎng)中，通常以第一極體排出來(lái)判斷卵母細(xì)胞的成熟，其實(shí)這只是核成熟的標(biāo)志。除了核成熟外，卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟也很重要，尤其是對(duì)用于核移植的卵母細(xì)胞而言，胞質(zhì)的成熟直接關(guān)系到能否使供體核實(shí)現(xiàn)徹底的再程序化、重構(gòu)胚能否維持正常的分裂發(fā)育［2］。從這個(gè)意義上說，目前所用的卵母細(xì)胞成熟體系還不盡完善，一些對(duì)卵母細(xì)胞成熟和后續(xù)發(fā)育非常重要的物質(zhì)不能完全合成。卵母細(xì)胞體外成熟中應(yīng)用最廣泛、效果穩(wěn)定的基礎(chǔ)培養(yǎng)液是TCM199。在牛和豬上，TCM199中添加10%的血清、促性腺激素和雌激素，獲得了90%的成熟率。小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟在CZB及K-SOMaa中也可得到很好的效果。由于血清成分復(fù)雜，人們?cè)诤铣膳囵B(yǎng)液（如SOFM、KSOM）中添加BSA、PVA及氨基酸來(lái)替代血清，使卵母細(xì)胞成熟并能進(jìn)行受精后的發(fā)育。

激素是卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)中必不可少的成分，特別是促性腺激素，它對(duì)細(xì)胞成熟的啟動(dòng)發(fā)揮主要作用。FSH和/或LH是成熟培養(yǎng)液中使用較多的促性腺激素［3］。FSH（卵泡刺激素）是調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的一種重要激素，它能促進(jìn)顆粒細(xì)胞加速有絲分裂并分泌卵泡液，從而使卵泡能夠成熟排卵。鑒于在卵泡發(fā)育過程中的重要作用，F(xiàn)SH被廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)，并證實(shí)能夠促進(jìn)卵母細(xì)胞周圍卵丘細(xì)胞的擴(kuò)展［4］。LH（黃體生成素）可使卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂，成熟卵泡分泌前列腺素（PGF2a）。因排卵前卵泡卵母細(xì)胞的成熟分裂恢復(fù)與LH峰的時(shí)間基本一致，一般認(rèn)為L(zhǎng)H是卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的誘導(dǎo)者。卵泡體外培養(yǎng)的研究結(jié)果亦表明，LH或HCG能誘導(dǎo)卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞成熟分裂的恢復(fù)［5］。因此，LH被廣泛用于卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)，并證實(shí)能提高卵母細(xì)胞成熟后的胚胎發(fā)育能力特別是在無(wú)血清的條件下。

另外，人們還通過添加一些生長(zhǎng)激素（如GH、GHRH等）、生長(zhǎng)因子（EGF、IGF-I、NGF、TGFb、激動(dòng)素等）和其他添加物質(zhì)如卵泡液、非離子型表面活性劑、副甲狀腺素相關(guān)蛋白（PTHrP）、成熟分裂激活物（MAS）等來(lái)提高卵母細(xì)胞的體外發(fā)育和成熟。

本文通過探討山羊卵母細(xì)胞在不同F(xiàn)SH、LH濃度下體外成熟的效果，建立山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，對(duì)山羊的繁殖、育種提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為山羊的種質(zhì)資源保護(hù)給予參考。

1 材料與方法

1.1 原料

山羊卵巢，采集于桂林某屠宰場(chǎng)；TCM199，上海聯(lián)碩生物科技有限公司；鏈霉素，華北制藥股份有限公司；青霉素，華北制藥股份有限公司；表皮生長(zhǎng)因子（SIGMAE -4127），上海昊海生物科技股份有限公司；轉(zhuǎn)鐵蛋白等三價(jià)因子（ITS）：SIGMAI-1884，上海玉博生物科技有限公司；尿嘧啶：SIGMA，U-1128，北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司；透明質(zhì)酸酶：SIGMA，H3506，北京鼎豐基業(yè)生物科技發(fā)展有限公司；肝素鈉，蘇州市蘇牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司；核染色機(jī)：Hochest33342：SIGMA，B-2261，蘇州市蘇牧動(dòng)物藥業(yè)有限公司；BSA：SIGMA，A6003，上海浩洋生物科技有限公司；丙酮酸鈉：SIGMA，P-4562，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司；L-谷氨酰胺（L-Glutamine）：SIGMA，G3126，上海聯(lián)碩生物科技有限公司；LH：寧波第二激素廠；FSH：寧波第二激素廠；HMG，西寶生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 主要儀器

倒置熒光顯微鏡：日本，OLMPUS，IX71；CO2培養(yǎng)箱：上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司MM-02470-00；電熱恒溫板：美國(guó)CT-946B；離心機(jī)：上海安亭，KA-1000；電子天平：德國(guó)，METTLER；體視顯微鏡：麥克奧迪SMZ-168；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海蘇達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器；雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺(tái)：江蘇凈化儀器制造廠；恒溫水浴鍋：北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠；超低溫冰箱：美國(guó)，F(xiàn)ORMA SCIENTIFIC；手術(shù)器械：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的收集 山羊卵巢采集于牛羊屠宰場(chǎng)，從屠宰場(chǎng)剛宰殺的母羊體內(nèi)剪下卵巢，保存在加有雙抗（青霉素與鏈霉素）的30～35℃滅菌生理鹽水的保溫瓶中，4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于試驗(yàn)。用預(yù)溫30～35℃的滅菌生理鹽水清洗3遍卵巢，并用剪刀修剪，減去多余的脂肪和結(jié)締組織，以減少對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。將處理好的卵巢放入盛有采卵液的平皿中，用無(wú)菌手術(shù)刀片切開卵巢表面2～6 mm大小的卵泡，使之釋放出卵泡液和COCs。用排卵針撿取卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，檢出的COCs分為A、B、C三級(jí)：A級(jí)，卵丘細(xì)胞完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；B級(jí)，卵丘細(xì)胞不完整，卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻；C級(jí)，卵母細(xì)胞裸露，或胞質(zhì)略有退化。選擇A，B級(jí)進(jìn)行培養(yǎng)。

采卵液：TCM199+1%FBS+100mg/mL肝素鈉+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL鏈霉素。

1.3.2 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的體外成熟培養(yǎng) 將收集到的A、B級(jí)COCs用洗卵液清洗3～4次，然后置于預(yù)平衡2～3 h含1 mL成熟液的U型皿中，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃，5%CO2飽和濕度，培養(yǎng)22～24 h。

洗卵液：TCM199+2%FBS。

收集到的卵母細(xì)胞分8組，第一組用TCM199作為空白對(duì)照組，其他7組使用不同的培養(yǎng)液進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)，同一實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

對(duì)照組：TCM199。

基礎(chǔ)成熟液：TCM199+10mg/mLBSA+1×ITS+50μg/mL尿嘧啶+2.5 mM谷氨酰胺+1 mM丙酮酸鈉+50 μg/mL EGF+1 μg/mLβ-E2。

OMⅠ：基礎(chǔ)成熟液+100 μg/mLFSH+20 μg/mLLH；

OMⅡ：基礎(chǔ)成熟液+200 μg/mLFSH+40 μg/mLLH；

OMⅢ：基礎(chǔ)成熟液+300 μg/mLFSH+60 μg/mLLH；

OMⅣ：基礎(chǔ)成熟液+0.05 IU/mLHMG；

OMⅤ：基礎(chǔ)成熟液+0.10 IU/mLHMG；

OMⅥ：基礎(chǔ)成熟液+0.15 IU/mLHMG；

OMⅦ：基礎(chǔ)成熟液+0.20 IU/mLHMG。

1.3.3 卵母細(xì)胞體外成熟效果判斷 將成熟培養(yǎng)后的COCs置于含0.3%透明質(zhì)酸酶的D-PBS液內(nèi)，用移液器輕輕吹打以除去成熟卵母細(xì)胞表面的卵丘細(xì)胞。在體視顯微鏡下，以異物針撥動(dòng)卵母細(xì)胞進(jìn)行觀察，觀察第一極體是否排出，或使用含有Hochest33342的洗卵液染色，通過熒光顯微鏡觀察是否有發(fā)光的極體分布于卵母細(xì)胞透明帶以內(nèi)。以排出第一極體的定為成熟，否則定為不成熟。

2 結(jié)果與討論

2.1 FSH和LH對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

在成熟液中添加不同濃度的FSH和LH，對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟有不同程度的影響，COCs在體外培養(yǎng)22 h時(shí)，都可以觀察到卵丘細(xì)胞不同程度的擴(kuò)散（圖1）。隨著添加激素濃度的升高，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散度增加，其中擴(kuò)散直徑，空白對(duì)照（圖1-A）＜OMI（圖1-B）＜OMII（圖1-C）＜OMIII（圖1-D）。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)激素FSH＞300μg/mL，LH＞60 μg/mL時(shí)，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散直徑不再增加，這表明，添加激素對(duì)山羊卵母細(xì)胞的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散有一定的影響作用。同時(shí)運(yùn)用imageJ2x軟件測(cè)定不同激素濃度下卵母細(xì)胞在卵丘細(xì)胞包裹中的投影，計(jì)算激素對(duì)卵母細(xì)胞的影響。測(cè)定結(jié)果運(yùn)用SPSS軟件分析，結(jié)果表明不添加激素的對(duì)照組的擴(kuò)散距離與OMI、OMⅡ和OMⅢ的擴(kuò)散距離均差異顯著（P＜0.05）。OMI、OMⅡ和OMⅢ的擴(kuò)散距離間均差異不顯著（P＞0.05）。但OMⅡ中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離優(yōu)于OMI和OMⅢ中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離，如圖2所示。

圖1 FSH與LH對(duì)山羊卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體擴(kuò)散度的影響（100×）

圖2 不同F(xiàn)SH和LH激素濃度卵母細(xì)胞的擴(kuò)增距離

由表1可知，在山羊卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的FSH和LH，對(duì)卵母細(xì)胞成熟率有不同的影響，成熟培養(yǎng)液中加入100μg/mLFSH和20μg/mLLH，成熟率57.9%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。添加200 μg/mL FSH和40μg/mLLH的OMⅡ成熟率為68.8%，與對(duì)照組也差異顯著（P＜0.05）。添加300 μg/mLFSH和60 μg/mLLH的OMⅢ成熟率54.6%，與對(duì)照組同樣差異顯著（P＜0.05）。且OMⅡ的成熟率與OMⅠ的成熟率和OMⅢ的成熟率間也差異顯著（P＜0.05）。說明在成熟液中添加適度濃度的FSH和LH對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟有著非常重要的影響，而過高的激素濃度對(duì)卵母細(xì)胞的成熟有抑制作用。

表1 不同F(xiàn)SH和LH濃度對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.2 HMG對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟的影響

在卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)液中添加HMG（FSH∶LH≈1∶1）可替代FSH和LH激素的添加，不同HMG濃度也可促進(jìn)COCs的擴(kuò)散（圖3），在培養(yǎng)22 h后卵丘細(xì)胞擴(kuò)散直徑表現(xiàn)為對(duì)照組（圖3-A）＜OMⅣ（圖3-B）＜OMⅤ（圖3-C）＜OMⅥ（圖3-D）＜OMⅦ（圖3-E）。隨著激素濃度的增加，擴(kuò)散直徑也在增加，但當(dāng)濃度大于0.2 IU/mL時(shí)，擴(kuò)散度不再增加。同樣運(yùn)用imageJ2x軟件測(cè)定各組成熟液中的卵母細(xì)胞擴(kuò)增距離顯示，不加激素的對(duì)照組與添加激素的OMⅣ、OMⅤ、OMⅥ、OMⅦ各組中卵母細(xì)胞的擴(kuò)增距離間差異顯著（P＜0.05）。添加激素的各組之間差異不顯著（P＞0.05）。如圖4顯示。

圖3 HMG對(duì)卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）擴(kuò)散的影響（100×）

圖4 不同HMG激素濃度卵母細(xì)胞的擴(kuò)增距離

從表5山羊卵母細(xì)胞成熟率可看出：其中添加0.1 IU/mLHMG成熟液的成熟率為69.6%，與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。這表明在成熟液中添加0.1IU/mLHMG有利于卵母細(xì)胞的成熟。而隨著濃度的不斷增加，成熟率逐漸下降，說明過多的HMG對(duì)山羊卵母細(xì)胞的成熟有抑制作用。

表5 HMG濃度對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響

哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)技術(shù)是利用類固醇激素和促性腺激素在體外模擬卵泡的環(huán)境，進(jìn)而誘發(fā)卵母細(xì)胞成熟的一項(xiàng)研究。在卵母細(xì)胞成熟過程中，促卵泡素FSH和促黃體素LH等促性腺激素具有協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟。研究表明，在體外成熟卵母細(xì)胞培養(yǎng)中FSH能顯著提高成熟率和早期胚胎的發(fā)育能力。其中FSH能誘導(dǎo)卵丘擴(kuò)散、暫時(shí)抑制生發(fā)泡的存在，改變了減數(shù)分裂第一次所需的時(shí)間，從而促進(jìn)了卵母細(xì)胞的體外成熟。LH也有類似作用，LH另一方面通過除去成熟分裂抑制因子激活卵母胞的減數(shù)分裂發(fā)生［6］。

FSH在卵泡發(fā)育中起至關(guān)重要的作用，它通過cAMP途徑促進(jìn)卵丘細(xì)胞增生并產(chǎn)生相應(yīng)的LH受體［7］，促使卵丘細(xì)胞膨散，通過刺激顆粒細(xì)胞分泌成熟促進(jìn)物，直接或間接地作用于卵母細(xì)胞，啟動(dòng)卵母細(xì)胞成熟分裂［8］。將FSH加入培養(yǎng)基中促進(jìn)人卵母細(xì)胞體外成熟，獲得81%的成熟率［9］。對(duì)于LH，一般認(rèn)為通過兩條途徑發(fā)揮作用：一是引起卵丘發(fā)生變化，促進(jìn)卵丘細(xì)胞擴(kuò)散，可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞上孕酮受體的表達(dá)及孕酮的產(chǎn)生，孕酮通過Connexin 43導(dǎo)致生發(fā)泡破裂（GVBD），便于精子通過卵丘細(xì)胞間隙到達(dá)透明帶［10］；二是顯著增強(qiáng)了卵母細(xì)胞的存活力，降低了異常卵母細(xì)胞的數(shù)量，從而提高了卵母細(xì)胞的受精率［11］。

3 結(jié)論

本研究比較了FSH和LH配合使用或HMG單獨(dú)使用時(shí)對(duì)山羊卵母細(xì)胞體外成熟的影響。結(jié)果表明，200 μg/mL FSH和40μg/mLLH配合使用對(duì)卵母細(xì)胞成熟的效果稍差于0.1IU/mLHMG的添加效果，這與有些研究結(jié)果略有不同，推斷差異可能是由于激素的不同生產(chǎn)廠家造成的。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，在不添加激素的情況下山羊卵母細(xì)胞同樣會(huì)獲得一定的成熟率。但在成熟培養(yǎng)過程中添加一定濃度的FSH和LH或HMG對(duì)山羊卵母細(xì)胞的第一極體排出有明顯的促進(jìn)作用，但濃度過高也會(huì)出現(xiàn)對(duì)山羊卵母細(xì)胞成熟率有抑制的表現(xiàn)。

［1］孫曉萍，郎俠，楊博輝，等.提高山羊繁殖性能的幾種方法［J］.畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（3）：91-92.

［2］Edwards R G.Maturation in vitro of mouse，sheep，cow，pig，rhesus，monkeyand human ovarian oocytes［J］.Nature，1965，208：349-351

［3］武浩.小鼠、山羊交互異種核移植研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2004.

［4］石德順，盧克煥.牛卵泡液對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］.廣西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994（13）：1-5.

［5］徐建祥，周木清，陳小武，等.不同條件對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響［J］.黑龍江動(dòng)物繁殖，1996，4（2）：13-14.

［6］謝常青，林戈，楊蘇安，等.人類不成熟卵母細(xì)胞體外成熟影響的因素初探［J］.生殖與避孕，2000，20（3）：6-7.

［7］Masayuki S，Takato T.FSH and LH induce progesterone production and progesterone receptor synthesis in cumulus cells：a requirement for meiotic resumption in porcine oocytes［J］.Molecular Human Reproduction，2002，8（7）：612-618.

［8］R Roberts，AIatropoulou，DCiantar，et al.Follicle-stimulatinghormone affects metaphase I chromosome alignment and increases aneuploidy in mouse oocytes matured in vitro［J］.BiologyofReproduction，2005，72（9）：107-118.

［9］J K O'Brien，S L Catt，K A Ireland，et al.In vitro and in vivo developmental capacityofoocytesfromprepubertaland adultsheep［J］.Theriogenology，1997，47：1433-1443.

［10］敖紅，孫桂金，尹遜河，等.綿羊卵母細(xì)胞體外成熟的研究［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2006，26（6）：14-16.

［11］賽務(wù)家甫.提高綿羊體細(xì)胞核移植效率的研究［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007.

Study on In Vitro Maturation System of Goat Oocytes

Pan Wenping1，KangHao2，KangYong3
（1.Lipu Normal School，Guilin 546600，China；2.The First Middle School ofNanningCity，Nanning530012，China；3.Northwestern Polytechnical University，Xi’an 710072，China）

The oocyte in vitro maturation plays an extremely important role in somatic cell nuclear transfer，for it affects the reprogramming and totipotence of somatic cell directly.However，the oocyte in vitro maturation are affected by environment，mediumconcentration，culture temperature and soon.In this paper，the effects ofdifferentdensities ofFSH，LH，mixture ofFSH and LH，HMGon oocyte in vitro maturation in goatwere studied，and a systemofoocyte in vitro maturation was established，which would layafoundationforadvancedbreedingandnuclear transfer ofgoat.

oocyte；FSH；LH；HMG；in vitro maturation；goat

S827.3

A

2095-3887（2017）02-0004-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.002

2017-01-04

潘文平(1983-),女，本科，從事生物教學(xué)及新型生物材料應(yīng)用研究。

康永,男，博士，從事生物復(fù)合材料研究。