劉艷玲，牟雁東

（西南醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

負載牙周祖細胞的鈦種植體治療單根牙缺失的實驗研究

劉艷玲，牟雁東

（西南醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000）

目的 探討自體牙祖細胞在鈦種植體表面形成生物工程牙周組織的能力。方法 拔除Lewis大鼠下頜第一磨牙（M1）和第二磨牙（M2），收獲和培養(yǎng)牙周祖細胞。檢測體外培養(yǎng)的牙周祖細胞的增殖、堿性磷酸酶活性、克隆形成能力及分化能力。制作含牙周祖細胞的鈦種植體，并植入宿主大鼠M1磨牙拔除處。評價生物工程牙周組織的形態(tài)和組織學(xué)特征。結(jié)果 源自牙髓細胞（DPCs）的軟牙周膜（PDL）表現(xiàn)出高增殖率、克隆形成力、脂肪，骨及神經(jīng)元細胞分化能力等生物學(xué)特性。生物工程牙周組織在鈦種植體表面形成骨質(zhì)樣組織，伴有貫穿纖維的PDL組織縱向插入種植體。結(jié)論 源自DPCs的PDL能夠用于下頜鈦種植體上自體PDL組織再生。

牙周膜；生物工程組織；鈦種植體

目前，用于提升鈦種植體性能和延長使用時間的主要方法包括：改變種植體表面形狀和構(gòu)造、改變控制細胞行為的表面構(gòu)型、覆蓋納米結(jié)構(gòu)的覆蓋物及使用生長因子等[1-3]。種植體與牙周骨組織的直接緊密結(jié)合被稱之為骨整合現(xiàn)象。骨融合是目前臨床上使用較為理想的一種種植體/骨表面，其本質(zhì)是形成的牙齒通過軟牙周膜（periodontal ligament，PDL）組織吸附到周圍的牙槽骨[4-6]。種植體植入后與牙槽骨形成骨性結(jié)合是種植體行使功能的生物學(xué)基礎(chǔ)，種植體能否種植成功與早期種植體表面骨融合形成密切相關(guān)。種植完成后能否促使鈦種植體與人體體液及組織相互作用，并在種植體表面產(chǎn)生骨性結(jié)合，是種植體能否產(chǎn)生良好生物相容性的關(guān)鍵。LE GUéHENNECL等[6]將骨融合定義為直接使骨種植體在無結(jié)締組織層干擾情況下與骨接觸。骨融合是比牙齦軟組織結(jié)合更為重要的一種生物固定，是義齒種植及其長期有效的前提。源自PDL的祖細胞具有自我更新、多向分化及參與牙周組織再生的功能，因此在PDL組織工程中應(yīng)用源自PDL的祖細胞是治療牙周疾病的潛在有效方法[7-8]。PDL再生的先決條件是能夠在口腔環(huán)境中原位傳遞具有增殖和分化的PDL祖細胞。PDL組織工程中使用的支架材料通常要求具有組織相容性、生物降解性、細胞黏附、傳遞生長因子和機械穩(wěn)定性等特性?；|(zhì)膠是基底膜基質(zhì)，廣泛用于細胞分化研究，本研究擬探討在鈦種植體表面采用基質(zhì)膠直接形成功能性PDL組織的可行性，以期為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 大鼠上頜磨牙拔除術(shù)及牙周組織收獲和細胞培養(yǎng)

麻醉狀態(tài)下，拔除21只6～8周齡LEWIS大鼠下頜第一磨牙（M1）和第二磨牙（M2）后，每天皮下注射姑息性鎮(zhèn)痛藥2次，飲用水中也加入鎮(zhèn)痛藥，連續(xù)3d，并采用軟食喂養(yǎng)。

收集拔除的磨牙和相應(yīng)牙周軟組織，并用滅菌漢克平衡鹽緩沖液（Hank'balanced salt solution，HBSS）平衡鹽緩沖液沖洗。將牙根置于50 ml含0.67 mg/ml膠原酶Ⅱ和0.3 mg/ml中性蛋白酶的HBSS中37℃孵育1 h，收集原代細胞。原代細胞用含20%小牛血清、2.0 mg/ml膠原酶Ⅰ及0.25%胰蛋白酶的DMEM高糖培養(yǎng)基37℃孵育消化1.5 h，HBSS沖洗細胞，40μm細胞濾網(wǎng)過濾，隨后將細胞重懸于含 20%小牛血清、100 u/ml青霉素及100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培基中，5%二氧化碳CO2及37℃條件中培養(yǎng)，每2～3 d更換1次新鮮培基。

1.2 大鼠PDL細胞增殖和堿性磷酸酶活性（alkaline phosphatase，ALP）及細胞克隆形成分析

大鼠PDL細胞增殖情況采用Pico Green dsDNA quantification kit（美國themofisher公司）進行檢測，并且實驗獨立重復(fù)進行3次。取80 μl標本、100μl磷酸對硝基苯酯及20 μl 2-氨基-2-甲基-1-丙醇混勻，37℃孵育1 h，檢測405 nm波長處OD值，通過與4-硝基苯酚405 nm波長處OD值標準曲線比較，計算標本中ALP含量。

收獲大鼠PDL細胞，以2 000個/孔濃度接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，用含20%小牛血清的DMEM培基培養(yǎng)細胞分別培養(yǎng)1、2及3周，10%甲醛固定細胞，結(jié)晶紫染色。當細胞克隆直徑＞2 mm時，計為細胞克隆，實驗重復(fù)進行5次。

1.3 PDL細胞分化潛能分析

成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基包含5mmol 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（isobutyl-methylxanthine，IBMX），1 mmol地塞米松，10 mmol胰島素，200 mmol吲哚美辛和50 mg/ml慶大霉素。神經(jīng)性分化培養(yǎng)基包含10 mmol基底膜提取物（BME），2%二甲亞砜和200 mmol丁羧基苯甲醚（butylated hydroxyanisole，BHA）。促成骨分化培養(yǎng)基含5 mmol/L磷酸二氫鉀（KH2PO3）、10-8mol/L地塞米松、50mg/ml L-抗壞血酸和50mg/ml慶大霉素。

1.4 免疫組織化學(xué)分析

通過免疫組織化學(xué)檢測骨唾液酸蛋白（Bone sialoprotein，BSP）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（Dentin sialophosphoprotein，DSPP）、基質(zhì)細胞抗原（stromal cell antigen-1，STRO-1）及骨鈣素（Osteocalcin，OCN）評估大鼠PDL細胞分化狀況，免疫組織化學(xué)檢測采用Vectastain ABC（美國Vector公司）染色試劑盒和快綠復(fù)染。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time polymerase chain-reaction，qRT-PCR）

Trizol（上海生物工程股份有限公司）試劑提取對照和分化組PDL細胞qRT-PCR，高保真互補脫氧核糖核酸（cDNA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。ABI Prism 7000型定量PCR儀（美國ABI公司）和Assays-on-DemandTM（美國TaqMan公司）基因表達試劑盒檢測BSP、DSPP、骨膜蛋白（Periostin，PN）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達。

1.6 種植體制作、制備、植入、收獲及處理

表面涂層種植體（2.0 mm×1.5 mm）采用大顆粒噴砂酸蝕處理。牙槽骨暴露后，用球鉆（直徑1.4 mm）和定制牙鉆（直徑1.5 mm）準備植入位點，2 mm時自動停止。P3收集P3培養(yǎng)的大鼠PDL細胞，重懸于基質(zhì)膠，每個定制的1.7 mm直徑模孔加入2μl （1×106個細胞）。將種植體也植入定制?？祝?7℃加熱1 h，使基質(zhì)膠固化，固化完成后，種植體表面覆蓋0.5 mm厚的基質(zhì)膠，能夠耐受壓力。由于種植體十分穩(wěn)定，種植床制備時要求在種植過程中避免摩擦。定制?？字蟹謩e放入至加入基質(zhì)膠作為對照組。每只拔除M1磨牙的大鼠右側(cè)種植細胞移植體，左側(cè)種植陰性對照移植體。

分離鼠下顎，用10%福爾馬林固定。其中7只大鼠下頜骨脫水，樹脂滲透包埋，150μm切片，砂紙盤拋光至35～50μm，最后用氧化鋁拋光膏拋光至0.3μm，熒光和組織形態(tài)學(xué)分析后，Stevenel's blue 和Van Geison's picro-fuschin（這個目前也無中文名稱）聯(lián)合染色。余下14只未脫鈣大鼠下頜骨種植體采用甲基丙烯酸甲酯進行塑料包埋，400μm厚度縱向切片，拋光至150μm，甲苯胺藍和堿性復(fù)紅染色。

1.7 生物工程PDL組織形態(tài)學(xué)和組織形態(tài)學(xué)評價

熒光顯微鏡下觀察種植體切片形態(tài)，并直接評估種植體和骨整合率。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用t檢驗進行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠PDL細胞特征

第3代大鼠PDL細胞持續(xù)增長＞33d（見圖1A）。第3代PDL細胞ALP活性在培養(yǎng)前20 d持續(xù)升高，第20只30 d呈下降趨勢（見圖1B）。第1代和第2代大鼠PDL DPCs形成的菌落形成單位（colonyforming units，CFUs）大致相同，直徑在0.5～3.0 mm，隨著時間增加，無論是第1代還是第2代PDL細胞，CFUs均下降，第1代PDL第3周CFUs低于第2周和第1周（t=7.823和8.966；P=0.003和0.001），第2周低于第1周（t=5.382，P=0.001）。見圖1C。

2.2 大鼠PDL細胞分化

第3代PDL細胞內(nèi)富含脂質(zhì)空泡油紅O染色陽性，而對照組細胞陰性（見圖1F、I）。成骨誘導(dǎo)培基茜素紅S染色后，可見富含礦物質(zhì)的陽性組織，而對照組細胞培養(yǎng)基陰性（見圖1G、J）。神經(jīng)性分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞可見神經(jīng)元陽性細胞體和胞漿延伸，而對照組細胞則沒有（見圖1H、K）。茜素紅S染色定量分析表明成骨誘導(dǎo)培基培養(yǎng)的細胞礦物質(zhì)含量是對照組的3倍以上（見圖1D）。qRT-PCR結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)培基培養(yǎng)的PDL細胞中BSP，DSPP和骨膜蛋白表達上升，而成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和神經(jīng)性分化培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞中骨膜蛋白表達下降（見圖1E）。免疫組織化學(xué)分析表明，正常培基培基的大鼠PDL DPCs中STRO-1陽性表達率為10%左右（圖2A、E），神經(jīng)元誘導(dǎo)培基培養(yǎng)的細胞神經(jīng)核抗原（neuronal nuclear antigen，NeuN）表達陽性（見圖2B、F），成骨誘導(dǎo)培基培養(yǎng)細胞BSP和DSPP表達陽性（見圖2C、D、G、H）。

2.3 鈦種植體表面硬組織和軟組織形成分析

21例實驗和對照種植體中2例種植位點炎癥，排除在本次研究之外。8例基質(zhì)膠覆蓋，而未加PDL細胞的種植體中，僅1例出現(xiàn)種植體骨整合，其余7例被血供豐富的肉芽組織圍繞。9例基質(zhì)膠覆蓋，且加PDL細胞的種植體中，沒有出現(xiàn)種植體骨整合，也未出現(xiàn)血供差，結(jié)構(gòu)完整的PDL樣組織形成（見圖3 A、B）。單獨鈦種植體在8周時骨和種植體表面出現(xiàn)肉芽組織，18周時出現(xiàn)骨整合。見圖3C。

圖1 大鼠PDL細胞體外培養(yǎng)特征

圖2 免疫組織化學(xué)分析誘導(dǎo)培養(yǎng)的PDL細胞

圖3 鈦種植體表面硬組織和軟組織形成情況

3 討論

1982年，NYMAN等證實PDL細胞能夠用于重建粘附于牙齒的結(jié)締組織。還有研究發(fā)現(xiàn)，PDL能夠沉積于牙骨質(zhì)，并與膠原共同粘附至牙種植體；PDL還能在真空鈦種植體上與骨有機結(jié)合，該研究結(jié)果提示PDL組織具有再生功能，并表明牙種植體具有新潛能，人類中自體PDL組織再生潛能[9-10]。本實驗利用源自大鼠磨牙牙根的自體PDL細胞在下頜中植入的鈦種植體上重建PDL組織。以往大量研究對源自DPC的PDL細胞自我更新、克隆形成、分化及在牙骨質(zhì)和周圍牙槽骨間重建結(jié)締組織的能力[11-13]。

本研究結(jié)果表明基質(zhì)膠、富含基本細胞外基質(zhì)成分的三維生物基質(zhì)支架能夠在鈦種植體和牙槽骨表面形成大鼠PDL再生組織。盡管只有10%的PDL細胞實驗種植體形成生物工程牙骨質(zhì)樣組織，并伴有垂直于種植體表面的膠原纖維，與自然形成的PDL組織類似，結(jié)果提示合適的膠原纖維分布有利于后續(xù)牙骨質(zhì)組織形成。21例種植體中2例發(fā)生種植體周圍感染，但是由于人類口腔衛(wèi)生保持良好、采用抗炎治療及種植體位點保護等原因，筆者預(yù)計人類中軟組織收口愈合效果會優(yōu)于動物實驗結(jié)果。

本研究結(jié)果表明，源自DPCs的PDL能夠用于下頜鈦種植體上自體PDL組織再生。源自DPCs的PDL表現(xiàn)出高增殖率、克隆形成力、脂肪，骨及神經(jīng)元細胞分化能力等生物學(xué)特性。生物工程牙周組織在鈦種植體表面形成骨質(zhì)樣組織，伴有貫穿纖維的PDL組織縱向插入種植體?？傊?，本研究證實覆蓋于鈦種植體表面的含有自體細胞的生物工程牙周組織能夠修復(fù)牙體缺損。

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Effect of bioengineered periodontal tissue on titanium dental implant

Yan-ling Liu,Yan-dong Mu
(School of Stomatology,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Objective To investigate the ability of autologous dental progenitor formed bioengineered periodontal tissue on titanium dental implants.Methods The Lewis rats maxillary first and second molars(M1 and M2)were extracted and the periodontal ligament(PDL)-derived dental progenitor cells(DPCs)were harvested and cultured.The proliferation,alkaline phosphatase activity,colony-forming and differentiation potential of DPCs were detected.Implants were prepared by DPC,and placed at the healed M1 extraction site of each rat host.Bioengineered PDL tissues were evaluated morphologically and histomorphometricly.Results Cultured PDL-derived DPCs exhibited high proliferation rates,clonogenicity,and adipose,bone,and neural cell differentiation.Bioengineered periodontal tissues formed cementum-like tissue on the titanium implant surface.PDL tissue with sharpey's fibers inserted perpendicular to the implant.Conculsions PDL-derived DPCs could potentially be used to regenerate autologous PDL tissues on titanium implants grown in the jaw.

periodontal ligament;bioengineered tissue;titanium dental implant

R782.12

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.003

1005-8982（2017）05-0013-05

2016-11-14

牟雁東，E-mail：995448060@qq.com