李然，賈倩倩，沈明，鮑禮智，鄭興

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院 心血管內(nèi)科，上海 200433；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031）

肥厚型心肌病誘導(dǎo)多能干細胞模型的建立*

李然1，賈倩倩2，沈明1，鮑禮智1，鄭興1

（1.第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院 心血管內(nèi)科，上海 200433；2.中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院，上海 200031）

目的 擬構(gòu)建肥厚型心肌病特異性誘導(dǎo)多能干細胞模型。方法 通過收集肥厚型心肌病患者外周血液標本，分離培養(yǎng)其中的單核細胞；然后，將編碼Oct4、Sox2、Klf4、L-Myc、Lin28、mp53DD和EBNA1的附加型質(zhì)粒組合電轉(zhuǎn)外周血單核細胞進行重編程；最后，通過形態(tài)學(xué)、AP染色、干細胞多能表面標志物免疫熒光、RT-PCR及EB自發(fā)三胚層分化潛能實驗對獲得的誘導(dǎo)多能干細胞進行檢測分析。結(jié)果 誘導(dǎo)獲得的多能干細胞顯現(xiàn)出明顯的干細胞樣形態(tài)，AP染色、多能標志物檢測均符合干細胞特征，與人胚胎干細胞H9相似。此外，EB自發(fā)分化實驗也證實具有完全的三胚層分化發(fā)育潛力。結(jié)論 成功獲得肥厚型心肌病特異性誘導(dǎo)多能干細胞系，為后續(xù)疾病特異性心肌分化模型的建立、疾病發(fā)生機制的研究及藥物開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

肥厚型心肌病；外周血單核細胞；誘導(dǎo)多能干細胞；疾病模型

肥厚型心肌?。╤ypertrophic cardiomyopathy，HCM）是一種常見的復(fù)雜性遺傳性心臟病，臨床上以心室異常性肥厚而不能由其他心臟疾病或系統(tǒng)性疾病加以解釋作為診斷依據(jù)[1-2]。本病是青少年和運動員猝死的最常見原因，少數(shù)進展為終末期心力衰竭（心衰），另有少部分出現(xiàn)心衰、房顫和栓塞[3]。目前認為，HCM主要由心肌肌節(jié)蛋白基因突變引起，已發(fā)現(xiàn)至少11個疾病基因和1 400種變異[4]。隨著檢查成像技術(shù)及基因檢測技術(shù)進步，人們逐漸掌握該病人群發(fā)病率、病變形態(tài)學(xué)特征、患者臨床表現(xiàn)和自然病程等規(guī)律[5-6]。然而，一直以來，一方面由于人HCM活體心肌細胞獲取受限以及心肌細胞體外培養(yǎng)增殖較為困難；另一方面由于不同與其他疾病，HCM雖然歸類于遺傳性心肌病，但是患者個體間基因變異較大，而疾病機制研究需要含有患者特異性的遺傳背景模型，以往傳統(tǒng)意義上的疾病模型無法滿足需求[7]，使得人們對HCM發(fā)病過程中具體的分子機制仍不完全清楚，相關(guān)的治療措施也非常遲滯[8]。

2006年以來，由YAMANAK[9-10]開創(chuàng)的體細胞重編程技術(shù)有效避開胚胎干細胞相關(guān)倫理爭議和免疫排斥問題，可應(yīng)用于體外器官構(gòu)建、體內(nèi)病理修復(fù)和終末期疾病治療，特別是遺傳性疾病細胞模型構(gòu)建及藥物篩選等。該類誘導(dǎo)多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）疾病模型具有其他疾病模型無法企及的優(yōu)勢：保存有來源細胞特異性遺傳背景、無限增殖能力和三胚層分化發(fā)育的潛能[11]。這為肥厚型心肌病研究廣泛開展提供新的途徑。本研究借助重編程技術(shù)，將HCM患者血液細胞重編程為iPSCs。而且，在將人外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）重編程HCM-iPSCs模型過程中，采用無病毒、非整合及無飼養(yǎng)層細胞的誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系，高效安全的獲得iPSCs，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

肥厚型心肌患者血液標本源于長海醫(yī)院收治的2例男性患者，根據(jù)臨床癥狀、相關(guān)病史、心臟彩超及心導(dǎo)管檢查等，患者被確診為肥厚型心肌病。本研究獲得長海醫(yī)院倫理委員會批準（編號：CHEC2016-146），患者充分知情并簽署知情同意書。

1.1 主要材料與試劑

細胞培養(yǎng)板（美國Corning公司），人胚胎干細胞H9（美國WiCell干細胞庫），聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑盒（美國Thermo公司），F(xiàn)icoll淋巴細胞分離液（美國GE公司），KBM502培養(yǎng)液（美國Corning公司），DMEM/F12培養(yǎng)液，Knockout血清替代培養(yǎng)物、Dispase消化酶、NEAA、bFGF、Epi5TM重編程試劑盒、Trizol試劑（美國Invitrogen公司），DPBS，E8培養(yǎng)液（美國Gibco公司），mTeSR1（美國Stem cell公司），Gelatin，TritonX-100，DAPI染液（美國Sigma公司），AP染色試劑盒（上海斯丹賽公司），F(xiàn)astQuant RT Kit（北京天根公司），Ex Tag試劑盒（日本TaKaRa株式會社），干細胞級的matrixgel（美國BD Biosciences公司），實驗用引物（上海生物工程股份有限公司），抗體OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、Desmin和山羊抗兔二抗（美國CST公司），抗體TRA-1-60、Nestin、AFP-01和山羊抗小鼠二抗（英國Abcam公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

熒光顯微鏡Olympus-IX71（日本奧林巴斯公司），臺式離心機、恒溫水浴鍋、超凈臺、生物安全柜、PCR儀和培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），Neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（美國Invitrogen公司），電泳儀（美國Major Science公司）凝膠圖像分析儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 外周血單核細胞分離培養(yǎng)

采用密度梯度離心法分離外周血獲得PBMCs。采集患者外周血3 ml，用DPBS稀釋1倍后緩慢加入等體積淋巴細胞分離液，1 500轉(zhuǎn)/min，減速度1，離心30min后小心吸取中間層細胞；用DPBS再次稀釋洗滌；1 500轉(zhuǎn)/min，離心10 min，吸棄上清液，重復(fù)洗滌1次，然后將細胞用2 ml KBM502培養(yǎng)液重懸，取細胞總量1/3接種到1個6孔板孔中，其余冷凍保存。細胞接種后第2天補液2 ml，第4天2 ml換液，第6天補液2 ml，第8天補液2 ml。

1.4 電轉(zhuǎn)附加體方式建系

使用Invitrogen公司Epi5TM重編程試劑盒對PBMCs進行重編程。具體過程為：取體外培養(yǎng)PBMCs，計數(shù)1×105～2×105，1 200轉(zhuǎn)/min離心5 min，吸棄上清液，DPBS稀釋清洗，離心吸棄上清液，重復(fù)洗滌1次。按照說明加入含有Sox2、Klf4、Oct4、L-Myc、Lin28、mp53DD和EBNA1混合附加體及電轉(zhuǎn)液并充分混勻，設(shè)置電轉(zhuǎn)參數(shù)1550V，10ms，3次，10 μl體系，然后進行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)完成后，將細胞接種到含有KBM502預(yù)溫培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)（已包被matrigel）。隔夜后（記為第1天）補充培養(yǎng)液0.5 ml（100 ng/ml bFGF+mTeSR1培液），此后連續(xù)4d，每天補液0.5ml/孔；第6天至第8天，連續(xù)3 d每天1 ml/孔換液；第9天開始培養(yǎng)液更換為E8培養(yǎng)液，其余同前每天換液并觀察克隆生長情況。

1.5 iPSCs挑選及傳代培養(yǎng)

機械法挑傳細胞。初始幾代誘導(dǎo)多能干細胞，換液后用玻璃針（末端經(jīng)燒灼成球狀）將iPSCs克隆分割成小片，周邊輕推使其懸浮，玻璃管吸取后接種matrigel包被的mTesR1培養(yǎng)液中培養(yǎng)。每日換液，觀察去除分化細胞。細胞穩(wěn)定傳代后，改用dispase酶消化傳代。

1.6 iPSCs多能性檢測

選取人胚胎干細胞H9與肥厚型心肌病患者的外周血誘導(dǎo)獲得的多能干細胞（HCM-iPSCs）同時鋪板培養(yǎng)，對比分析HCM-iPSCs多能性。

1.6.1 堿性磷酸酶染色 使用斯丹賽AP染色試劑盒。具體為：細胞傳代后培養(yǎng)2 d，吸去培養(yǎng)液，PBS潤洗2次，然后4%PFA固定1 min；PBS洗2次，TBST潤洗2次，加入染色試劑，室溫避光放置15min；吸出染色液，PBS潤洗1次，加適量PBS顯微鏡下觀察以藍/紫染色為陽性。

1.6.2 免疫熒光檢測 獲得iPSCs經(jīng)穩(wěn)定傳代后，選取第10代iPSCs克隆，按照免疫熒光常規(guī)步驟，經(jīng)PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX-100通透，5%山羊血清封閉，一抗4℃過夜孵育，孵育二抗，最后DAPI染色后用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.6.3 擬胚體（embryoid body，EB）自發(fā)分化 選取第10代HCM-iPSCs克隆用Dispase消化后接種到低黏附培養(yǎng)板，先用mTeSR1培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)2 d，然后改用EB培養(yǎng)液（20%KSR+DMEM/FF12+2 mmol/L L-Glu+0.1 mol/L NEAA）懸浮培養(yǎng)，8 d后將懸浮EB接種到明膠包被的培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)8 d，培養(yǎng)期間均是每2 d換液1次。最后，將部分實驗細胞進細胞固定、通透、封閉，分別孵育內(nèi)胚層AFP-01、中胚層Desmin和外胚層Nestin標記抗體，孵育二抗，DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察；部分分化細胞抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增后與H9和PBMCs進行電泳對比分析。

1.6.4 RT-PCR Trizol法抽提RNA。H9、PBMCs 和iPSCs經(jīng)Trizol裂解，氯仿分離抽提，異丙醇沉淀，75%酒精漂洗，DEPC水稀釋后計量分裝。cDNA按照天根公司Fast Quant RT Kit操作說明逆轉(zhuǎn)錄獲得。PCR反應(yīng)按照TaKaRa Ex Tag試劑盒說明書進行操作，引物來源參考文獻[12]。

1.6.5 凝膠電泳 常規(guī)制備0.8%瓊脂糖凝膠液，取10 μl DNA樣品與上樣液混勻后上樣，電壓5 V/cm，電泳結(jié)束后進行成像分析。

2 結(jié)果

2.1 HCM患者PBMCs的原代培養(yǎng)細胞

培養(yǎng)HCM外周血分離得到的PBMCs，細胞生長活躍，數(shù)量大量增加，培養(yǎng)1周左右顯微鏡下觀察見大量簇狀細胞克隆。見圖1。

圖1HCM-PBMCs擴增與培養(yǎng)

2.2 HCM患者PBMCs重編程

電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)初期，細胞增殖緩慢，部分細胞形態(tài)發(fā)生改變，數(shù)量增加。第12天顯微鏡下見形態(tài)明顯變化的細胞克隆，隨后細胞快速增殖，聚集密度逐漸增大，克隆也不斷擴大。第21天挑傳細胞繼續(xù)培養(yǎng)。多次傳代后仍保持干細胞樣形態(tài)。見圖2。

2.3 HCM患者特異性iPSCs多能性檢測結(jié)果

HCM-iPSCs堿性磷酸酶染色、干細胞多能性標記抗體OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4及TRA-1-60染色結(jié)果呈陽性；與DAPI共染圖像顯示出良好細胞形態(tài)；iPSCs半定量PCR電泳條帶顯示，iPSCs多次傳代后仍具有與對照組H9相似表達譜，外周血單核細胞則未見表達。見圖3。

2.4 HCM患者血液源性iPSCs的分化發(fā)育潛能檢驗結(jié)果

HCM-iPSCs自發(fā)分化實驗，免疫熒光檢測顯示內(nèi)胚層、中胚層和外胚層標記物染色呈陽性；多次傳代后，HCM-iPSCs自發(fā)分化實驗，PCR凝膠電泳顯示分化細胞有相關(guān)三胚層基因表達，對照組未見表達。見圖4。

圖2HCM患者PBMCs重編程

圖3HCM-iPSCs多能性檢測結(jié)果

圖4HCM-iPSCs自發(fā)分化實驗

3 討論

肥厚型心肌病基礎(chǔ)研究進展緩慢。有關(guān)HCM文獻描述，最早可追溯到19世紀70年代HALLOPEAU等人在《Gazette Medecine Paris》雜志上對該類患者的報道，距今已有150多年的歷史。目前，HCM研究已有很大發(fā)展，越來越多的基因突變位點被發(fā)現(xiàn)報道。但是總體上，HCM研究取得的進展仍多局限于臨床研究，如心電圖影像學(xué)等研究[13]。HCM疾病模型構(gòu)建困難，是相關(guān)基礎(chǔ)研究進展遲滯的重要原因。

本研究借助電轉(zhuǎn)技術(shù)，將編碼重編程轉(zhuǎn)錄因子的附加體質(zhì)粒組合導(dǎo)入外周血細胞進行重編程，并經(jīng)鑒定成功獲得2例患者特異性PBMCs-iPSCs。雖然，研究人員借助HCM模型小鼠在一些機制研究中也取得很多成果[14-17]，但是模型動物和人體細胞代謝等很多方面存在較大差異。與之相比，iPSCs來源患者體細胞，攜帶患者全部基因，可短時大量擴增，有望解決HCM患者活體心肌細胞采集困難，無法擴增，不能滿足研究大量需求等問題，具有很好的研究應(yīng)用前景[18]。

為避免初始淋巴細胞基因重排的影響，按照DOWEY等[19]報道方法，實驗中沒有將PBMCs分離后直接電轉(zhuǎn)附加體進行重編程，而是在體外培養(yǎng)8～ 14 d后，再進行電轉(zhuǎn)誘導(dǎo)獲得HCM-iPSCs。而且，在HCM患者iPSCs建立過程中，和LIU等[20]已有報道不同，本研究簡化電轉(zhuǎn)后誘導(dǎo)培養(yǎng)過程。電轉(zhuǎn)后，培養(yǎng)早期（前8 d）使用mTesR1添加bFGF培養(yǎng)液（100 ng/ml），后期使用E8培養(yǎng)液，同樣成功獲得iPSCs，簡化培液種類，降低費用消耗，更利于研究廣泛開展。此外，盡管HAN等[21]報道利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將經(jīng)典重編程轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入患者皮膚成纖維細胞，誘導(dǎo)也獲得HCM-iPSCs。但是，HAN等研究的皮膚取樣涉及麻醉、縫合及后期拆線，對患者身體創(chuàng)傷較大。而且，HAN使用病毒載體導(dǎo)入轉(zhuǎn)錄因子的方式有基因插入的風(fēng)險。相對而言，本研究采用人外周血作為初始細胞，標本容易獲得，取材方便，常規(guī)靜脈穿刺就可得到大量的外周血細胞，可大大縮短初始細胞制備時間，較Han方法在HCM-iPSCs建立上更具優(yōu)勢?？傊?，通過采集肥厚型心肌病患者少量外周血細胞，并從中分離培養(yǎng)單核細胞，應(yīng)用電轉(zhuǎn)非整合附加體方式，成功獲得2例HCM患者的iPSCs。HCM-iPSCs可用于定向誘導(dǎo)分化為心肌細胞建立肥厚型心肌病特異心肌細胞模型，這為缺乏合適疾病研究模型找到解決辦法，對后續(xù)疾病機制的深入研究具有重要的現(xiàn)實意義。

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Establishment of induced pluripotent stem cell model of hypertrophic cardiomyopathy*

Ran Li1,Qian-qian Jia2,Ming Shen1,Li-zhi Bao1,Xing Zheng1
(1.Department of Cardiovasology,Changhai Hospital,Second Military Medical University, Shanghai,200433,China;2.Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences,Shanghai,200031,China)

Objective To establish patient-specific induced pluripotent stem cell model of hypertrophic cardiomyopathy(HCM).Methods Peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)were isolated and cultured from whole blood of patients with HCM.And then,episomal combinations coding Sox2,Klf4,Oct4,L-Myc,Lin28, mp53DD,EBNA1 were electroporated into PBMCs.Pluripotency and stability of the induced pluripotent stem cells (iPSCs)were tested by standard procedures including cell morphology,alkaline phosphatase staining, pluripotency markers staining,and potential differentiation of all three germ layers was detected through embryonic body (EB)formation test.Results The patient-specific iPSCs possessed the characteristic of human embryonic stem cells (ESC),confirmed by methods including clearly ESC-like colonies,alkaline phosphatase staining,immunofluorescence and RT-PCR for expression of pluripotency markers,which were similar to human ESC H9.Additionally,EB formation test demonstrated that iPSCs hold potential to differentiate into all three germ layers.Conclusions Hypertrophic cardiomyopathy patient-specific iPSCs are successfully obtained, which lays the foundation of further construction of induced cardiomyocytes HCM disease model,mechanism study and drug discovery.

hypertrophic cardiomyopathy;peripheral blood mononuclear cells;induced pluripotent stem cells;disease model

R542.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.001

1005-8982（2017）05-0001-06

2016-12-15

國家自然科學(xué)基金（No：81170092）

鄭興，E-mail：zhengxing57530@163.com；Tel：021-311161262