李曉曉 楊 旻 于 翔 周文浩 汪吉梅 胡黎園

·論著·

C-X3-C趨化因子配體1與新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的相關性

李曉曉1,4楊 旻2,4于 翔3周文浩1汪吉梅2胡黎園1

目的 探討血漿或腦脊液中的C-X3-C趨化因子配體1(CX3CL1)是否可作為判斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的指標。方法 以2015年12月至2016年5月復旦大學附屬兒科醫(yī)院新生兒病房中疑診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染行腰椎穿刺檢查的新生兒為感染組，根據(jù)臨床表現(xiàn)，腦脊液常規(guī)、生化和培養(yǎng)結果分為中樞感染亞組、敗血癥亞組和非敗血癥亞組。以同一時期復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科病房健康新生兒為對照組，根據(jù)出生體重分為<2 000 、 ～2 500 、～3 000 、～3 500 和>3 500 g亞組，根據(jù)孕周分為<33、～35、～37、～39和>39周亞組。對照組取新生兒在出生后的臍帶血；感染組于急性期或穩(wěn)定期行腰椎穿刺檢查，24 h后取靜脈血標本。采用Luminex技術檢測血或腦脊液標本中的CX3CL1水平，比較各組及其亞組間的差異。結果 對照組69例，感染組24例。中樞感染(化膿性腦膜炎)亞組8例，敗血癥亞組10例，非敗血癥亞組6例(腦積水2例，泌尿系統(tǒng)感染1例，新生兒驚厥2例、高膽紅素血癥伴食管氣管瘺1例)。對照組臍血CX3CL1水平為(97.8±13.3)pg·mL-1，臍血CX3CL1水平在不同體重亞組以及不同孕周亞組間差異無統(tǒng)計學意義，P均>0.05。 CX3CL1水平在感染組血漿 (95.1±8.2)pg·mL-1和對照組臍血比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.299)。CX3CL1水平感染組腦脊液中(210.0±11.9)pg·mL-1高于血漿，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。感染組中的中樞感染亞組、敗血癥亞組和非敗血癥亞組腦脊液CX3CL1水平分別為(243.1±13.3)、(208.2±20.1)和(168.7±20.6)pg·mL-1，3組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.046)；中樞感染亞組與非敗血癥亞組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.016)； 敗血癥亞組與非敗血癥亞組比較(P=0.180)、中樞感染亞組與敗血癥亞組比較(P=0.169)，差異均無統(tǒng)計學意義。結論 健康新生兒臍帶血和感染新生兒外周血CX3CL1表達水平相對穩(wěn)定，不適宜作為判斷是否存在感染的指標，CSF中CX3CL1作為輔助診斷中樞感染和判斷感染嚴重程度的分子標志物還需進一步擴大樣本量加以證實。

C-X3-C趨化因子配體1； 炎癥； 膠質細胞； 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

新生兒化膿性腦膜炎是一種常見的嚴重危害兒童健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，往往中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀不典型，缺乏特異性的臨床表現(xiàn)，病情進展迅速，病死率和后遺癥發(fā)生率高[1,2]。目前，新生兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的診斷手段有限，常通過腦脊液細胞數(shù)和培養(yǎng)等來判斷，尚無明確的分子診斷指標。C-X3-C趨化因子配體1(CX3CL1)是一種在炎癥反應中起重要作用的趨化因子[3]。在炎癥發(fā)生后，組織中CX3CL1水平可顯著升高，并誘導單核-巨噬細胞和T淋巴細胞等參與炎癥反應[4]。成人研究結果顯示[5]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者腦脊液中CX3CL水平顯著升高。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的新生兒外周血和腦脊液CX3CL1水平是否也和成人研究結果相似，是否可作為新型分子標志物或判斷感染嚴重程度？本研究擬對此進行探討。

1 方法

1.1 研究設計 以病例對照研究為設計方案，比較新生兒病房中疑診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染行腰椎穿刺檢查的新生兒(感染組)外周血與產(chǎn)院新出生的健康新生兒(對照組)臍血CX3CL1水平，比較感染組血和腦脊液的CX3CL1水平。

1.2 分組考慮 為比較感染組不同感染程度，根據(jù)臨床表現(xiàn)，腦脊液常規(guī)、生化和培養(yǎng)結果將其分為中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染(中樞感染)亞組、敗血癥亞組和非敗血癥亞組。為考察對照組體重和孕周對CX3CL1水平是否有影響，根據(jù)出生體重分為<2 000、～2 500、～3 000、～3 500和>3 500 g亞組，根據(jù)孕周分為<33、～35、～37、～39和>39周亞組。

1.3 倫理和知情同意 本研究經(jīng)過復旦大學附屬兒科醫(yī)院倫理委員會和復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院倫理委員會批準。感染組新生兒腦脊液的采集取得其監(jiān)護人的知情同意，對照組新生兒臍血采集告知監(jiān)護人并取得知情同意。

1.4 診斷標準

1.4.1 化膿性腦膜炎診斷標準[6]①體溫異常，精神反應異常，拒奶、驚厥或膿毒癥表現(xiàn)；②前囟飽滿、顱縫增寬，腦膜刺激征；③腦脊液細胞數(shù)>20 ×106·L-1，多核細胞>0.6，蛋白增高，糖降低；④腦脊液培養(yǎng)有細菌生長或涂片革蘭染色發(fā)現(xiàn)細菌。具備①～③項即可臨床診斷，若符合④可確診。

1.4.2 敗血癥診斷標準[7](1)體溫改變、精神反應差、不吃、不哭、黃疸，嚴重者休克、DIC。(2)各系統(tǒng)表現(xiàn)：①皮膚黏膜：膿皰疹、皮下壞疽、硬腫癥、瘀點、瘀斑；②呼吸系統(tǒng)：呼吸困難、發(fā)紺、呼吸不規(guī)則或呼吸暫停；③消化系統(tǒng)：吃奶減少、腹脹、嘔吐、腹瀉，嚴重者出現(xiàn)中毒性腸麻痹或NEC；④中樞神經(jīng)系統(tǒng)：合并化膿性腦膜炎，表現(xiàn)嗜睡、激惹、驚厥、肌張力增高、前囟飽滿等；⑤血液系統(tǒng)：PLT減少，出血傾向，甚至DIC。(3)非特異性檢查：①WBC減少<5×109·L-1或>20×109·L-1；②中性粒細胞為主；③CRP≥8 μg·mL-1；④PLT≤100×109·L-1；⑤ESR≥15 mm·1 h-1。(4)特異性檢查：①細菌培養(yǎng)可見致病菌；②病原菌抗原及DNA檢測陽性。具有(1)、(2)的臨床表現(xiàn)并符合(3)非特異性檢查≥2條或(4)特異性檢查②即可診斷，符合(4)特異性檢查①可確診。本研究中敗血癥組均除外化膿性腦膜炎。

1.4.3 非敗血癥標準 ①體溫異常、黃疸、咳嗽、嘔吐、抽搐等臨床表現(xiàn)；②白細胞異?；駽RP≥8μg·mL-1；非敗血癥組為除外中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染及敗血癥的其他類型感染患兒。

1.5 感染組納入和排除標準 2015年12月至2016年5月復旦大學附屬兒科醫(yī)院新生兒病房中因疑診中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染而行腰椎穿刺檢查的病例；排除先天性免疫缺陷性疾病、先天性遺傳代謝性疾病和染色體異常病例。

1.7 觀察指標及檢測方法

1.7.1 標本的收集 對照組取出生后的臍帶血。感染組患兒入院后疾病急性期或穩(wěn)定期行腰椎穿刺檢查，獲得腦脊液(1 mL)，靜脈血標本(2 mL)采集于腰椎穿刺后24 h內(nèi)。

1.7.2 CX3CL1的檢測 在中國科學院神經(jīng)科學研究所采用德國默克密理博公司HCYTOMAG-60K-06試劑盒行CX3CL1檢測，按照試劑盒說明書操作，原始吸光度數(shù)據(jù)采用5PL曲線擬合后得到絕對蛋白量。

1.8 統(tǒng)計學分析 用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用Stata12.0軟件進行統(tǒng)計分析。多組或兩組間比較的計量資料行方差齊性及正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差表示，同組內(nèi)兩不同指標比較，采用配對t檢驗；兩組獨立樣本比較采用t'檢驗；多組樣本指標方差不齊，比較采用Kruskal-Wallis法秩和檢驗；不符合正態(tài)分布時，數(shù)據(jù)進行相應變換，以中位數(shù)(P25，P75)表示。檢驗水準取0.05。

2 結果

2.1 一般情況 符合本文感染組納入和排除標準的患兒24例進入本文分析，男13例，女11例，平均(36.5±3.6)孕周，平均出生體重(2 706±865)g。符合本文對照組納入標準的新生兒69例,<2 000 、～2 500 、～3 000、～3 500和>3 500 g亞組分別為14、14、17、17和7例；孕周為<33、～35、～37、～39和>39周亞組分別為8、14、21、9和17例。

感染組中，中樞感染亞組8例，均為化膿性腦膜炎，男女各4例，平均(42.3±1.4)孕周，平均出生體重(3 176±625)g；敗血癥亞組10例，男女各5例，平均(36.3±3.2)孕周，平均出生體重(2 561±736)g；非敗血癥亞組6例，男4例，女2例，平均(35.0±4.8)孕周，平均出生體重(2 354±753)g，包括腦積水2例，泌尿系統(tǒng)感染、新生兒驚厥伴肺炎、新生兒驚厥伴早產(chǎn)兒、高膽紅素血癥伴食管氣管瘺各1例。

2.2 對照組不同出生體重及不同孕周亞組臍血CX3CL1水平比較 表1顯示，不同體重亞組和孕周亞組臍血CX3CL1水平中位數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義，P均>0.05。

表1 不同出生體重、孕周亞組的CX3CL1水平比較(pg·mL-1)

2.3 感染組血漿CX3CL1水平和對照組臍血CX3CL1水平的比較 CX3CL1水平感染組血漿[(95.1±8.2)pg·mL-1] 與對照組臍血[(97.8±13.3) pg·mL-1] 比較，差異無統(tǒng)計學意義(t'=-1.045,P=0.299)。

2.4 感染組血漿和腦脊液CX3CL1水平比較 CX3CL1水平腦脊液(210.0±11.9)pg·mL-1高于血漿，差異有統(tǒng)計學意義(t'=10.287，P<0.001)。

2.5 感染組不同亞組腦脊液CX3CL1水平的比較 中樞感染亞組、敗血癥亞組和非敗血癥亞組腦脊液CX3CL1水平分別為(243.1±13.3)、(208.2±20.1)和(168.7±20.6)pg·mL-1，3組間差異有統(tǒng)計學意義(F=6.141，P=0.046)；中樞感染亞組與非敗血癥亞組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t'=3.029，P=0.016)；敗血癥亞組與非敗血癥亞組比較(t'=1.370，P=0.180)、中樞感染亞組與敗血癥亞組比較(t'=1.450，P=0.169)，差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

免疫趨化因子CX3CL1通過和受體CX3CR1結合，誘導細胞黏附和細胞遷移[3]。在外周系統(tǒng)CX3CL1主要由血管內(nèi)皮細胞表達，CX3CR1多在單核巨噬細胞和T淋巴細胞等細胞表達[4]；在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，CX3CL1在神經(jīng)元和星形膠質細胞中表達，其受體CX3CR1只在小膠質細胞中表達[5]。有報道顯示CX3CL1在炎癥過程中可升高，并誘導單核巨噬細胞和小膠質細胞等參與炎癥反應[4，5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥發(fā)生時，CX3CL1和CX3CR1結合，引起小膠質細胞短暫的鈣內(nèi)流，合成MMP2和MMP9，同時激活下游蛋白磷酸化和酶，在炎癥反應中起重要作用，包括破壞血腦屏障[8]； CX3CL1升高可抑制小膠質細胞釋放促炎癥因子[9，10]。CX3CL1具有神經(jīng)保護作用，促進過多的谷氨酸代謝，減輕神經(jīng)毒性[11～13]，也可減少Fas介導的小膠質細胞的凋亡，具有抗凋亡的作用[14]。目前關于CX3CL1在臨床上的研究主要集中在成人相關疾病，在新生兒的臨床研究尚無報道。

對成人HIV感染患者的臨床研究顯示， HIV感染組(9例明確HIV感染且已行抗病毒治療患者)與無HIV感染對照組(16例，其中6例為干擾素治療的丙肝患者，10例健康對照)比較，外周血中CX3CL1表達水平相似[15]。本研究顯示，出生體重<2 000、～2 500、～3 000、～3 500和>3 500 g的健康新生兒，以及孕周<33、～35、～37、～39和>39周的健康新生兒，臍血CX3CL1水平差異均無統(tǒng)計學意義，說明出生體重和孕周對CX3CL1的表達沒有影響；CX3CL1水平感染組新生兒外周血中與健康新生兒臍血差異也無統(tǒng)計學意義，說明外周血和臍帶血中CX3CL1水平相對穩(wěn)定，無法作為疾病感染的判斷指標。胚胎時期血液中巨噬細胞來源于CX3CR1+的細胞， CX3CL1/CX3CR1在外周主要發(fā)揮維持巨噬細胞自我更新和恢復功能性穩(wěn)態(tài)的作用[16]。

在Kastenbauer等[17]學者關于血清及腦脊液中的CX3CL1水平在成人不同類型的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(化膿性腦膜炎14例、病毒性腦炎14例、多發(fā)性硬化15例、格林巴利綜合癥12例)的病例研究顯示，中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者腦脊液中CX3CL1水平顯著高于對照組(14例，包括短偏頭痛8例、緊張性頭痛3例、短暫腦缺血發(fā)作1例、中毒1例)，其中化膿性腦膜炎患者腦脊液中CX3CL1水平最高；而血清中CX3CL1水平只在多發(fā)性硬化患者有升高 。 本研究中感染組新生兒CX3CL1水平在腦脊液中高于外周血，差異有統(tǒng)計學意義，說明腦脊液中的CX3CL1水平對判斷感染可能具有臨床意義；而CX3CL1水平在非敗血癥亞組、敗血癥亞組和中樞感染亞組的腦脊液中梯次升高，差異有統(tǒng)計學意義，提示隨著感染程度的加重，腦脊液中CX3CL1水平有升高趨勢。誠然，也應當看到，本文非敗血癥亞組、敗血癥亞組和中樞感染亞組樣本量僅為6、10和8例，統(tǒng)計學意義的差異并不能真實反映臨床的真實差異，需要擴大樣本量進一步認識腦脊液中CX3CL1水平對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的價值。本文中敗血癥亞組較非敗血癥亞組腦脊液中CX3CL1水平高[(208.2±20.1)vs(168.7±20.6)]，但差異無統(tǒng)計學意義，可能與樣本量小有關。

綜上所述，健康新生兒臍帶血和感染新生兒外周血CX3CL1水平相對穩(wěn)定，不適合作為判斷是否存在感染的指標，腦脊液中CX3CL1作為輔助診斷中樞感染和判斷感染嚴重程度的分子標志物還需進一步擴大樣本量加以證實。

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(本文編輯：張崇凡，孫晉楓)

Study on the correlation between CX3CL1 and neonatal central nervous system infection

LIXiao-xiao1,4,YANGMin2,4,YUXiang3,ZHOUWen-hao1,WANGJi-mei2,HULi-yuan1

(1DepartmentofNeonatology，Children＇sHospitalofFudanUniversity，KeyLaboratoryoftheMinistryofHealthNeonatalDiseases，Shanghai201102，China; 2DepartmentodNeonatology,ObstetricsandGynecologyHospitalofFudanUniversity,Shanghai200090,China; 3ShanghaiInstitutesforBiologicalScience,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200031,China)

WANG Ji-mei,E-mail:m13817000825@163.com；HU Li-yuan,E-mail:nowadays921@126.com

Objective To study C-X3-C chemokine ligand 1 (CX3CL1) in plasma or cerebrospinal fluid whether could be used as an biomaker of central nervous system infection.MethodsThe plasma and CSF samples were collected from neonates who were suspected to have central nervous infection with lumbar puncture check admitted to Neonatal Ward of Children′s Hospital of Fudan University from December 2015 to May 2016,and they set for infection group,according to clinical manifestations,cerebrospinal fluid routine,biochemistry and culture results,they were divided into the central infection,sepsis and non-sepsis groups.At the same period healthy newborns cord blood samples were collected in the maternity ward of Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University as a normal control group,and on the basis of birth weight group was divided into < 2 000 g,-2 500 g,-3 000 g,-3 500 g,>3 500 g groups; and according to gestational age divided into < 33 w,-35 w,-37 w,-39 w,>39 w groups.Using Luminex technology to detect CX3CL1 protein levels(Milliplex reagent kit HCYTOMAG-60K-06),the differences between groups and subgroups were compared.ResultsIn 69 cases of control group,there were 24 cases with infection.There were 8 cases in central infection group (meningitis),10 cases in sepsis group and 6 cases in non-sepsis subgroup (1 case with urinary tract infection,2 cases with neonatal convulsion,1 case with hyperbilirubinemia and esophageal tracheal fistula ).In the control group,CX3CL1 in cord blood was (97.8+.13.3) pg·mL-1,there was no significant difference in cord blood CX3CL1 level among different body weight subgroups and different gestational weeks subgroups (P>0.05).In infection group plasma CX3CL1 level [(95.1±8.2)pg·mL-1] had no significant difference from control group(t=-1.045,P=0.299).There was significant difference in CX3CL1 level between plasma and cerebrospinal fluid,CX3CL1 level was significantly higher in cerebrospinal fluid(210.0±11.9)pg·mL-1(P< 0.001).Among central infection group,sepsis group and non-sepsis group cerebrospinal fluid CX3CL1 levels (243.1±13.3)pg·mL-1,(208.2±20.1)pg·mL-1and(168.7±20.6)pg·mL-1,there were significant differences (P=0.046); There were also significant differences in CX3CL1 levels in cerebrospinal fluid between central infection group and non-sepsis group (P=0.016)；There were no significant differences in CX3CL1 levels in cerebrospinal fluid between central infection group and sepsis group(P=0.180) or between sepsis group and non-sepsis group(P=0.169).ConclusionCX3CL1 level in plasma is relatively stable in the healthy newborns,CX3CL1 level in plasma can not be used to diagnose central nervous infection,CSF CX3CL1 levels may be an auxiliary biomarker for diagnosis of central nervous infection and its severity.

CX3CL1； Inflammation； Glial cells； Central nervous system infection

1復旦大學附屬兒科醫(yī)院新生兒科，衛(wèi)生部新生兒重點實驗室 上海，201102；2 復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院新生兒科 上海，200090；3 中國科學院神經(jīng)科學研究所 上海，200031；4 共同第一作者

汪吉梅，E-mail:m13817000825@163.com；胡黎園，E-mail:nowadays921@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2017.01.012

2017-01-07

2017-02-15)