劉翔宇，余曉莉

1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000) 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)(湖北 武漢 440000)

不同介質(zhì)中丹參酮ⅡA的納米囊體外釋放度研究

劉翔宇1，余曉莉2*

1.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院(湖北 恩施 445000) 2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)(湖北 武漢 440000)

目的 制備丹參酮ⅡA納米囊，比較其與原料藥在溶出度試驗(yàn)條件下的4種溶出介質(zhì)中的體外釋放規(guī)律。方法 應(yīng)用透析膜，小杯法，四種溶質(zhì)中不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定丹參酮ⅡA的累積濃度， DDSolver軟件進(jìn)行相關(guān)擬合分析。結(jié)果 在四種溶質(zhì)中丹參酮ⅡA納米囊釋放度與原料藥相比存在顯著性差異，釋放時(shí)間延長(zhǎng)，擬合分析顯示丹參酮ⅡA溶出曲線更符合威布爾分布模型， 60 h內(nèi)丹參酮ⅡA納米囊釋藥量≥84.6%。結(jié)論 丹參酮ⅡA納米囊比原料藥明顯釋放緩慢，有利于藥物吸收。

丹參酮ⅡA納米囊；體外釋放度；DDSolver軟件

丹參酮ⅡA作為一種小分子脂溶性藥物，半衰期短，約為1～2 h，胃腸道停留時(shí)間短，導(dǎo)致口服吸收率低，限制了藥物的生物利用度。納米囊制劑可延長(zhǎng)釋放時(shí)間，提高生物利用度。測(cè)定體外釋放度的方法有轉(zhuǎn)籃法、槳法、往復(fù)筒法、流通池法等[1]。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用小杯法[2]比較丹參酮ⅡA納米囊[3]和原料藥，在溶出度試驗(yàn)條件的4種溶出介質(zhì)[4][1%十二烷基硫酸鈉助溶[5](SDS)]中的釋放度差異，觀察納米囊體外釋放規(guī)律。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 分析天平(梅特勒)高效液相色譜儀(島津 I sersie)；色譜工作站(第三軍醫(yī)大學(xué))；透析袋，分子量3 500(Spectrum美國(guó)光譜)；RCZ-6B3智能溶出儀(上海圣科儀器有限公司)。

1.2 試劑 純水(怡寶水)，色譜甲醇(sigma),冰乙酸(杭州邦易化工有限公司)，SDS(sigma),丹參酮ⅡA(shanghai sunny biotech Co.Ltd),殼聚糖(西安瑞盈生物科技有限公司)，無(wú)水乙醇(MERCK)。

2 方法與結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 高效液相色譜(HPLC)柱為Thermo Fisher C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15)(V/V)；波長(zhǎng)270 nm；柱溫室溫；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL，理論塔板數(shù)≥4 000，丹參酮ⅡA保留16.5 min，見(jiàn)圖1。

A：丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)品圖；B：空白納米囊圖；C：丹參酮ⅡA納米囊

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 丹參酮ⅡA定量準(zhǔn)確稱取2.5 mg，溶于5 mL甲醇，終濃度500 μg/mL。準(zhǔn)確量取500 μg/mL丹參酮ⅡA溶液5，15，25，50，500 μL，甲醇定容至5 mL，制成終濃度分別為0.5，1.5，2.5，5，50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣，制作濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=45 525 734.6X+5 540.597 24(r=0.999 8)，線性范圍0.5～50 μg/mL。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取納米囊后溶于5 mL甲醇，探頭超聲，甲醇定容至10 mL，濾膜過(guò)濾備用(孔徑0.22 μm)。

2.1.4 精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn) 取50 μg/mL丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)液按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定5次峰面積，求濃度，RSD為0.81%；取50 μg/mL丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)液分別在0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣，以鋒面積求濃度，RSD為1.01%。

2.1.5 回收率試驗(yàn) 取同一批丹參酮ⅡA納米囊供試品溶液3份，分別加入100、300、500 μL體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液混勻，微孔濾膜過(guò)濾，按上述色譜條件連續(xù)測(cè)定3次，濃度回收率均在 98%～102%之間。

2.1.6 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別量取丹參酮ⅡA對(duì)照品甲醇溶液、丹參酮 ⅡA納米囊供試品溶液、空白納米囊甲醇溶液上述色譜條件測(cè)定，考察方法的專屬性。由色譜圖可見(jiàn)，丹參酮ⅡA納米囊樣品主峰與對(duì)照品具有一致的保留時(shí)間，即輔料不干擾測(cè)定。

2.2 體外釋放

2.2.1 溶出介質(zhì)及不同溶出介質(zhì)飽和溶解度、透析袋處理 溶出介質(zhì)①水+1% SDS；②pH6.8磷酸鹽緩沖液+1% SDS；③pH4.0醋酸鹽緩沖液+1% SDS；④pH1.2稀鹽酸+1% SDS，不同溶出介質(zhì)的飽和溶解度見(jiàn)表1。透析袋預(yù)處理：將透析袋剪成8 cm左右，在2 L透析袋處理液中將透析袋煮沸10 min(透析袋處理液：1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(pH8.0)、2%碳酸氫鈉)。蒸餾水將透析袋洗干凈，然后將透析袋放在1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(pH8.0)的溶液中煮沸10 min，待自然冷卻，再將透析袋浸泡在4℃的EDTA 溶液中備用，透析袋需使用時(shí)應(yīng)提前用去離子水徹底洗凈[6]。

表1 丹參酮ⅡA原料藥在不同溶劑中飽和溶液中的濃度

2.2.2 溶出度測(cè)定 采用小杯法測(cè)定，精密稱取丹參酮ⅡA和丹參酮ⅡA納米囊(以丹參酮 ⅡA計(jì))，加經(jīng)脫氣預(yù)熱的適量溶出介質(zhì)體積溶解，倒入透析袋中，扎緊透析袋，固定到槳上，置于脫氣的溶出介質(zhì)200 mL的溶出瓶中，轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度 (37±0.5)℃。原料藥組在5，15，30，45 min，1，2，3，5 h取樣4 mL，濾膜過(guò)濾孔徑0.45 μm，每次取樣后補(bǔ)足同體積同溫度的脫氣溶出介質(zhì)，HPLC測(cè)定峰面積，計(jì)算不同溶劑中原料藥的累積溶出百分率。丹參酮ⅡA納米囊組在5，15，30，45 min，1，2，3，5，7，9，11，24，36，48，60 h取樣4 mL，濾膜過(guò)濾(孔徑0.45 μm)，每次取樣后補(bǔ)同體積同脫氣溫度的溶出介質(zhì)，高校液相色譜測(cè)定峰面積，計(jì)算丹參酮ⅡA累積溶出的百分?jǐn)?shù)，見(jiàn)表2。

表2 丹參酮ⅡA原料藥、丹參酮ⅡA納米囊的累積釋藥百分?jǐn)?shù)/%

續(xù)表2：

T丹參酮ⅡA原料藥水+1%SDSpH6．8磷酸鹽緩沖液+1%SDSpH4醋酸鹽緩沖液+1%SDSpH1．2稀鹽酸+1%SDS丹參酮ⅡA納米囊水+1%SDSpH6．8磷酸鹽緩沖液+1%SDSpH4醋酸鹽緩沖液+1%SDSpH1．2稀鹽酸+1%SDS5min0．06030．05830．09530．14830．02090．00850．00830．007315min0．10830．14760．24330．26290．04730．01750．00960．008630min0．25370．24480．38490．34570．07420．04560．05530．038245min0．32610．29730．45330．45710．13230．08180．09160．08131h0．42280．34410．53570．51690．17520．14270．13310．14232h0．63770．53730．68840．65060．23660．20570．18620．20543h0．76610．55320．82450．74940．27670．25650．26590．25615h0．87310．83670．93160．83310．33290．32820．32360．32777h0．95540．93880．98530．91280．38290．38800．38360．38769h0．99200．96450．99160．96210．43610．44140．43680．440911h0．47910．49460．49530．494224h0．69050．68770．72660．687336h0．84010．80590．80640．805548h0．87180．85550．83630．835460h0．89010．87640．85680．8460

2.2.3 溶出曲線數(shù)學(xué)方程擬合和溶出參數(shù)計(jì)算 采用DDSolver[7]擬合，見(jiàn)表3。

表3 丹參酮ⅡA原料藥、丹參酮ⅡA納米囊體外釋放藥物累積釋藥分?jǐn)?shù)的擬合結(jié)果

從擬合結(jié)果看出，丹參酮ⅡA溶出曲線更符合威布爾分布模型，因此選擇威布爾分布模型進(jìn)行丹參酮ⅡA溶出參數(shù)Td(溶出63.2%所需時(shí)間)的計(jì)算，見(jiàn)表4。

表4 丹參酮ⅡA溶出參數(shù)Td(h)

從表4中發(fā)現(xiàn)，4種溶出介質(zhì)中丹參酮ⅡA納米囊的平均滯留時(shí)間均長(zhǎng)于原料藥(P<0.05)，丹參酮ⅡA納米囊的體外釋放度與原料藥相比存在著顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。丹參酮ⅡA納米囊制劑可以延緩藥物釋放。參照藥物累積釋藥百分?jǐn)?shù)，在60 h內(nèi)丹參酮ⅡA納米囊釋藥量≥84.6%。

3 討論

藥物在體內(nèi)的吸收受許多因素的影響，對(duì)脂溶性成分而言，膽汁、食物、磷脂、蛋白等腸內(nèi)容物以及腸道血液循環(huán)都可明顯影響其溶解與吸收。對(duì)于水難溶性藥物，以水為介質(zhì)的體外溶出度試驗(yàn)不能完全代表體內(nèi)的具體情況，一般主張?zhí)砑颖匾闹艹鑫?，如膽鹽、磷脂、表面活性劑等，以更接近于體內(nèi)環(huán)境，其中SDS為眾所推薦[8]。根據(jù)相關(guān)研究[9]對(duì)SDS用量一般不超過(guò)1%的建議，本實(shí)驗(yàn)加入1%SDS溶液來(lái)檢測(cè)體外溶出。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中配制的1%SDS、pH6.8磷酸鹽緩沖液+1% SDS 、pH4.0醋酸鹽緩沖液+1% SDS、pH1.2溶液+1% SDS室溫放置容易析出SDS，使用前應(yīng)該提前1 h 37℃水浴預(yù)熱使之澄清透明。為了防止氣泡對(duì)溶出過(guò)程產(chǎn)生影響，預(yù)熱后及時(shí)超聲去氣備用。

[1] 劉艷,張志鵬,索緒斌,等.緩控釋制劑體外釋放度的研究進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2011,22(3):701-703.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[S].二部.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:附錄85.

[3] 吳俊洪,羅惠都,何麗冰,等.丹參酮ⅡA納米囊的制備及其性能評(píng)價(jià)[J].中藥新藥與臨床藥理,2013,24(1):101-103.

[4] 謝沐風(fēng).溶出度研究列評(píng)《日本藥品品質(zhì)再評(píng)價(jià)工程》[J].中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn),2006，1(7):43-44.

[5] 李曉光,李東曉,李興平,等.丹參酮IIA的體外溶出與體內(nèi)吸收的關(guān)系研究[J].中藥新藥與臨床,2010,26(4):18-21.

[6] 莊曉峰,張宏福,陳亮.不同透析袋對(duì)仿生消化法評(píng)定豬飼料原料干物質(zhì)和磷體外消化率的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2012,24(8):1 527-1 533.

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[8] 李新中.齊墩果酸聚氰基丙烯酸正丁酯納米囊的制備及其肝靶向性研究[D].長(zhǎng)沙:中南大學(xué),2007.

[9] 趙麗麗,蔡露茜,葉競(jìng)雄,等.表面活性劑SDS輔助微波提取金佛手總黃酮工藝及抗氧化活性評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué),2014,35(18):47-51.

責(zé)任編輯：艾 茜

The Study of Tanshinone ⅡA Nanocapsule Release Rate With Different Solutes in Vitro

Liu Xiangyu1，Yu Xiaoli2*

(1.TheMedicalCollegeofHubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China； 2.TheWuhanChildren′sHospital(WuhanMaternalandChildHeathcareHospital),TongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan440000,China)

Objective To compare the release regularity of Tanshinone ⅡA nanocapsule with the drug substance in vitro.Methods The cumulative concentration of Tanshinone ⅡA was determined at different times in four solutes with dialysis membrane cup method.The DDSolver software was used to analyze the correlation.Results The difference of release between Tanshinone ⅡA nanocapsule and the drug substance in four different solutes was statistically significant.If the release time was prolonged,the fitting analysis showed that the dissolution curve of Tanshinone ⅡA fit into the Weibull distribution model.The release quantity of Tanshinone ⅡA nanocapsule was greater than or equal to 84.6% within 60 hours.Conclusion The release of Tanshinone ⅡA nanocapsule was slower than that of the drug substance. So it is favorable for drug absorption.

Tanshinone ⅡA nanocapsule;Release rate in vitro;DDSolver software

劉翔宇，男，碩士在讀，研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論;*

余曉莉，女，主要從事腦缺血神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制方面的研究。

R943

A

1008-8164(2017)01-0053-03

2016-11-12