潘世澤，汪巍，方一凡，郭小波，耿慶

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)

葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測對早期肺癌的診斷效能

潘世澤，汪巍，方一凡，郭小波，耿慶

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060)

目的探討葉酸受體(FR)陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測對肺癌的診斷效能。方法胸部CT檢查提示可疑肺癌的孤立性肺小結(jié)節(jié)患者38例，術(shù)后病理診斷為早期肺癌29例、肺良性病變9例。術(shù)前均留取靜脈血檢測FR陽性CTC。結(jié)果29例早期肺癌及9例肺良性病變患者的FR陽性CTC分別為(10.87±2.62)、(8.03±2.56)FU/3 mL，兩者相比，P<0.05。以術(shù)后病理檢查結(jié)果作為診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，kappa一致性檢驗(yàn)顯示FR陽性CTC診斷肺結(jié)節(jié)具有一定的準(zhǔn)確性(kappa=0.649，P<0.01)。以FR陽性CTC作為肺癌的診斷指標(biāo)，其ROC曲線下面積為0.837(95%CI為0.650～1.000)，最佳截?cái)嘀禐?.7 FU/3 mL，診斷靈敏度為89.7%、特異度為77.8%。結(jié)論FR陽性CTC檢測對早期肺癌具有較好的診斷效能。

葉酸受體；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；葉酸受體陽性循環(huán)腫瘤細(xì)胞；肺癌；肺腫瘤

大多數(shù)肺癌確診時(shí)已處于晚期，只能得到有限的治療，患者5年生存率僅為15%，如果肺癌在發(fā)生早期就能診斷并完全切除，患者5年生存率將會(huì)提升至67%[1,2]。孤立性肺結(jié)節(jié)公認(rèn)的定義為單一的、邊界清的、影像不透明的、直徑≤30 mm 的、周圍完全由含氣肺組織所包繞的病變，沒有肺不張、肺門增大或胸腔積液表現(xiàn)[3]。目前臨床上鑒別肺部結(jié)節(jié)的良惡性主要依靠影像學(xué)、腫瘤標(biāo)志物及組織病理檢查等。常用于肺癌診斷的腫瘤標(biāo)志物主要有癌胚抗原(CEA)、 腫瘤相關(guān)糖類抗原、細(xì)胞角蛋白(CYFRA)片段、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)等，但在早期肺癌或者某些癌前病變中上述標(biāo)志物表達(dá)量相對較低[4]，致使其診斷早期肺癌的靈敏度和特異度均不高。即使影像學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)肺部有小結(jié)節(jié)，做不做手術(shù)也成了一件難以抉擇的事情，若肺部結(jié)節(jié)癌癥傾向不明顯，多根據(jù)Fleischner學(xué)會(huì)的推薦[5, 6]進(jìn)行隨訪，但進(jìn)行隨訪有利有弊，一些肺癌患者因?yàn)殡S訪時(shí)間長錯(cuò)過了早期切除的機(jī)會(huì)。腫瘤細(xì)胞自發(fā)地從原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移灶釋放入血液循環(huán)中，或者由于侵入性操作導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)中，即為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)[7]。CTC逃避免疫系統(tǒng)識別和殺傷，聚集形成微腫瘤栓，在合適的條件下發(fā)展為轉(zhuǎn)移病灶[8]。雖然CTC的發(fā)現(xiàn)很早，但直到近幾年其臨床應(yīng)用潛力才得到認(rèn)可[9, 10]。上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)是表達(dá)于人類部分正常上皮細(xì)胞和大多數(shù)惡性上皮腫瘤細(xì)胞表面的糖蛋白，目前主要通過檢測EpCAM來確認(rèn)CTC，但非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者的CTC經(jīng)常不表達(dá)EpCAM，通過檢測EpCAM來確認(rèn)NSCLC患者的CTC敏感性低[11]。葉酸受體(FR)在許多上皮源性惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，尤其在肺癌和卵巢癌細(xì)胞中幾乎都有表達(dá)，可采用配體靶向酶聯(lián)聚合反應(yīng)檢測FR陽性的肺癌CTC[12～14]。本研究采用配體靶向PCR法對38例胸部CT檢查提示可疑肺癌的孤立性肺小結(jié)節(jié)患者的FR陽性CTC進(jìn)行了檢測，并探討分析了其對早期肺癌的診斷效能?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年6～12月武漢大學(xué)人民醫(yī)院收治的可疑肺癌的孤立性肺小結(jié)節(jié)患者38例，男16例，女22例；年齡41～74歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者無癥狀或表現(xiàn)為咳嗽、胸部脹痛、低熱等，胸部CT檢查提示為可疑肺癌的孤立性肺部結(jié)節(jié)(結(jié)節(jié)最大直徑<3 cm)，未伴有縱隔淋巴結(jié)腫大或其他轉(zhuǎn)移灶；患者納入本研究前未接受抗腫瘤藥物治療。所有患者接受手術(shù)治療，術(shù)后病理診斷早期肺癌29例(腺癌21例、鱗癌8例，均未發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶)及肺良性病變9例。排除標(biāo)準(zhǔn)：胸部CT檢查提示肺多發(fā)結(jié)節(jié)者，其他部位腫瘤繼發(fā)肺轉(zhuǎn)移、既往接受手術(shù)及放化療治療者；肺部腫瘤復(fù)發(fā)患者。

1.2 FR陽性CTC的檢測 納入的38例患者在即將手術(shù)時(shí)抽取肘前靜脈血3 mL，EDTA抗凝，4 ℃儲(chǔ)存，24 h內(nèi)完成血液處理并進(jìn)行FR陽性CTC的檢測測。首先通過免疫磁珠負(fù)向富集法從3 mL外周血中捕獲CTC，然后通過配體靶向PCR法定量檢測FR陽性CTC，F(xiàn)R陽性CTC檢測試劑盒由格諾思博生物科技(上海)有限公司提供。根據(jù)試劑盒說明書，將3 mL全血樣本中加入紅細(xì)胞裂解液(體積∶體積=1∶4)，4 ℃裂解15 min，去除紅細(xì)胞；然后加入150 μL的抗CD45磁珠和50 μL的抗CD14磁珠，4 ℃孵育30 min，分別去除白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；將富集的CTC加入10 μL的含有腫瘤特異性葉酸配體-寡核苷酸偶合物的探針標(biāo)記液，室溫孵育40 min；接著將這些樣品加入1 mL的洗滌緩沖液，4 ℃、500 g離心10 min，重復(fù)3次，去除未結(jié)合的探針；最后加入120 μL的洗脫緩沖液，4 ℃孵育2 min，洗脫下已結(jié)合的探針；離心收集已結(jié)合的探針，加入24 μL的中和緩沖液，用于熒光定量PCR擴(kuò)增，PCR信號與數(shù)據(jù)的收集通過ABI7300(Life Technologies, Carlsbad, CA)儀器完成(ABI7300儀器反應(yīng)條件：95 ℃變性2 min，40 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，8 ℃冷卻5 min；40個(gè)循環(huán)，95 ℃變性10 s，35 ℃退火30 s，72 ℃延伸10s[14,15]。3 mL血液中檢測到1個(gè)FR陽性CTC，就定義為1 Folate Unit(FU，這是一個(gè)自我定義的測量單位)[11]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件。兩組間計(jì)量資料的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本之間的比較用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；診斷一致性分析采用kappa一致性檢驗(yàn)；靈敏度=真陽性/(真陽性+假陰性)×100%，特異度=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%；以靈敏度為縱坐標(biāo)、(1-特異度)為橫坐標(biāo)繪制ROC曲線，利用ROC曲線計(jì)算Youden指數(shù)，將Youden指數(shù)最大的切點(diǎn)確定為FR陽性CTC診斷肺癌的最佳臨界點(diǎn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

29例早期肺癌及9例肺良性病變患者的FR陽性CTC分別為(10.87±2.62)、(8.03±2.56)FU/3 mL，兩者相比，P<0.05。

以術(shù)后病理檢查結(jié)果作為診斷肺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，kappa一致性檢驗(yàn)顯示FR陽性CTC診斷肺結(jié)節(jié)具有一定的準(zhǔn)確性(kappa=0.649，P<0.01)。以FR陽性CTC作為肺癌的診斷指標(biāo)，其ROC曲線下面積(AUC)為0.837(95%CI為0.650～1.000)，截?cái)嘀禐?.7 FU/3 mL，診斷靈敏度為89.7%、特異度為77.8%，說明FR陽性CTC檢測對肺癌具有較好的診斷效能。

3 討論

隨著環(huán)境變化，肺癌的發(fā)生率越來越高，死亡率也排在腫瘤病死率的首位，人們逐漸開始注重體檢，肺部小結(jié)節(jié)檢出率較前大大提升。但肺部結(jié)節(jié)是不是肺癌的問題，是否需要立刻行手術(shù)活檢還是隨訪，都是干擾醫(yī)師和患者的問題。目前沒有一種腫瘤標(biāo)志物可以準(zhǔn)確預(yù)測或診斷肺部腫瘤，特別是早期肺癌，即使多種肺癌腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(CEA+SCC+CYFRA21-1)，其對于早期肺癌的診斷陽性率也僅為19.4%[16]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)R陽性CTC檢測對肺癌具有較好的診斷效能，其診斷早期肺癌的敏感度為89.7%，明顯高于一般的肺癌腫瘤標(biāo)志物。

目前已經(jīng)有一些可靠且可重現(xiàn)的技術(shù)用于分離和檢測外周血中的腫瘤細(xì)胞，然而這些方法均有不同的局限性，在臨床實(shí)踐中尚沒有一種標(biāo)準(zhǔn)的方法來檢測CTC[17]。CellSearch系統(tǒng)是較早用于檢測CTC的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)，已經(jīng)獲得了美國食品藥品管理局批準(zhǔn)作為某些腫瘤如前列腺癌、乳腺癌患者CTC的檢測，該技術(shù)是依賴上皮細(xì)胞標(biāo)記物(如EpCAM)來識別CTC，然而由于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的存在，其對晚期肺癌患者的陽性檢出率只有32%[18]。同理也很難通過EpCAM微流體CTC芯片檢測到NSCLC患者的CTC。另外，可以通過腫瘤細(xì)胞的大小分離檢測CTC，該技術(shù)基于細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，而不利用細(xì)胞表面免疫標(biāo)記物，其優(yōu)點(diǎn)在于不依賴CTC的表面抗原，保持了CTC形態(tài)和活性，但獲得的CTC 純度很低，而且很容易丟失直徑比較小的CTC。

FR具有很強(qiáng)的組織和腫瘤特異性，在肺癌特別是在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表面高度表達(dá)，每個(gè)細(xì)胞表面的FR高達(dá)幾十萬個(gè)，而FR在健康人血液細(xì)胞中幾乎未見有表達(dá)[19]，所以FR是理想的CTC檢測靶點(diǎn)。本研究采用的配體靶向PCR技術(shù)是用葉酸連接的寡核苷酸進(jìn)行標(biāo)記并用定量PCR進(jìn)行定量分析，通過這種方法，將1個(gè)CTC放大成至少50萬個(gè)表面受體分子，然后通過熒光定量PCR 將這50萬個(gè)分子再高保真地進(jìn)行放大擴(kuò)增檢測，通過這兩級放大，可以檢測到3 mL血液樣本中極少量的CTC，這即是人CTC檢測試劑盒的工作原理，這種檢測方法大大增加了檢測CTC的敏感性。本研究用此方法檢測可疑肺癌患者的CTC，也增加了本研究的可信度。

本研究共入組了29例早期肺癌患者、19例肺部良性疾病患者，研究結(jié)果顯示兩組受檢者的FR陽性CTC差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ROC曲線分析確定了8.70 FU/3 mL的FR陽性CTC為診斷早期肺癌的最佳截?cái)嘀?，這也與之前的大樣本分析研究結(jié)論相符[12,14]。在此截?cái)嘀档幕A(chǔ)上，F(xiàn)R陽性CTC診斷早期肺癌的靈敏度為89.7%、特異度為77.8%，與Lian等[11]的研究結(jié)果相符(以8.70 FU/3 mL為最佳截?cái)嘀担潇`敏度為82.5%，特異度為72.2%，其中對Ⅰ期肺癌的診斷靈敏度高達(dá)86.6%)。然而，卻與 Wang等[15]的研究結(jié)果有所差別，在他們的研究中得出CTC靈敏度僅為77.7%，而特異度達(dá)89.5%，這可能是因?yàn)楸狙芯咳虢M患者胸部CT表現(xiàn)癌癥傾向明顯(將胸部CT表現(xiàn)為磨玻璃影、半實(shí)性結(jié)節(jié)或?qū)嵭越Y(jié)節(jié)伴有周圍不光滑的患者入組)，CTC可能釋放入外周血的量較多，這也間接提示CTC檢查聯(lián)合胸部CT檢查可能會(huì)提高肺癌診斷陽性率；此外，本研究納入的病例較少，可能也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究還發(fā)現(xiàn)，以FR陽性CTC作為肺癌的診斷指標(biāo)，其 AUC值較高(0.837)，高于CEA、 NSE、 CYFRA21的AUC值(分別為0.617、 0.613、0.527。這說明FR陽性CTC更容易辨別肺結(jié)節(jié)的良惡性，較一般腫瘤標(biāo)志物具有較好的診斷效能，與Lian等[11]的研究結(jié)果相符(FR陽性CTC對肺癌及Ⅰ期肺癌具有較高的診斷準(zhǔn)確性，AUC值分別為0.859和0.912。此外，本研究kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示FR陽性CTC診斷肺結(jié)節(jié)具有一定的準(zhǔn)確性(kappa=0.649，P<0.01)。

CTC檢測不僅在肺癌診斷中起重要作用，其在肺癌治療評價(jià)和預(yù)后判斷當(dāng)中也扮演著重要角色。研究[9]發(fā)現(xiàn)，CTC 計(jì)數(shù)與肺癌患者無進(jìn)展生存期 (PFS) 和總生存期 (OS)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，多因素分析顯示CTC計(jì)數(shù)可預(yù)測患者的 PFS 和 OS ；另外，Krebs等[18]在對101例晚期NSCLC的研究中，應(yīng)用CellSearch 系統(tǒng)檢測CTC，CTC計(jì)數(shù)變化可作為晚于ⅢA期的NSCLC的預(yù)后判斷因子，其也是預(yù)測OS的最有價(jià)值指標(biāo)之一。CTC與化療或放射治療NSCLC的療效也有關(guān)聯(lián)，有學(xué)者[20]在對43例接受化療的NSCLC患者的研究中發(fā)現(xiàn)，患者CTC計(jì)數(shù)越高，其OS和 PFS越低，提示CTC可作為評估放NSCLC化療療效的指標(biāo)之一。本研究入組的肺癌患者也在持續(xù)隨訪中，將進(jìn)一步觀察其FR陽性CTC計(jì)數(shù)是否能夠預(yù)測早期肺癌的PFS和OS。

綜上所述，F(xiàn)R陽性CTC檢測可作為篩查孤立性肺結(jié)節(jié)、診斷早期肺癌的有效生物標(biāo)志物。鑒于此次納入的病例較少，進(jìn)一步進(jìn)行大樣本前瞻性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證我們的結(jié)論是非常必要的。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.021

R734.2

B

1002-266X(2017)47-0069-04

耿慶(E-mail: szgqing@126.com)

2017-08-18)