陳琨,廖喆,任凌雁,聶瑛潔

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽(yáng)550003；2貴陽(yáng)市第四人民醫(yī)院)

·臨床研究·

貴州地區(qū)575例男性不育癥患者染色體核型分析及Y染色體AZF微缺失情況觀察

陳琨1,廖喆2,任凌雁1,聶瑛潔1

(1貴州省人民醫(yī)院，貴陽(yáng)550003；2貴陽(yáng)市第四人民醫(yī)院)

目的觀察貴州地區(qū)男性不育癥患者染色體核型異常、Y染色體精子生成基因(AZF)微缺失情況。方法貴州地區(qū)男性不育癥患者575例，采用染色體G顯帶操作技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析，PCR與瓊脂糖凝膠電泳、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Y染色體AZF的相關(guān)序列標(biāo)簽位點(diǎn)。結(jié)果575例不育癥患者中，染色體核型異常率為10.6%(61/575)，最常見(jiàn)類型為47,XXY、占80.33%(49/61)。Y染色體AZF微缺失發(fā)生率為7.13%(41/575)，最常見(jiàn)類型為僅AZFc缺失、占43.34%(19/41)。結(jié)論貴州地區(qū)男性不育癥患者染色體核型異常及Y染色體AZF微缺失發(fā)生率較高，染色體核型及Y染色體AZF微缺失聯(lián)合檢測(cè)有助于男性不育癥原因的發(fā)現(xiàn)，也有助于本病的診斷及治療。

不育癥；染色體核型；Y染色體；精子生成基因

造成男性不育的原因很多。由精索靜脈曲張、隱睪、生殖系統(tǒng)感染、內(nèi)分泌紊亂、免疫反應(yīng)異常等原因造成的男性不育可以通過(guò)手術(shù)治療或藥物治療的方式解決。但由遺傳缺陷引起的精子發(fā)生障礙，則藥物治療效果差。Klinefelter綜合征由Klinefelter等于1942年首次描述并記載，又稱先天性曲細(xì)精管發(fā)育不全，是一種性染色體異常疾病，男性發(fā)病率為0.1%～0.2%，在男性不育癥患者中占3.1%，是引起原發(fā)性睪丸功能減退最常見(jiàn)的先天性疾病，也是最常見(jiàn)的原發(fā)性性腺功能減退[1～3]。Y 染色體長(zhǎng)臂上存在與精子發(fā)生相關(guān)的基因，即Y染色體上的精子生成基因(AZF)。在無(wú)精子癥和嚴(yán)重少精子癥的患者中AZF微缺失率占8.2%[4～6]。本研究對(duì)貴州地區(qū)男性不育癥患者染色體核型異常、Y染色體AZF微缺失情況進(jìn)行了觀察。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年1月～2015年9月就診于貴州省人民醫(yī)院的男性原發(fā)性不育癥患者575例，年齡18～55歲，籍貫均為貴州。按照WHO精液分析標(biāo)準(zhǔn)：3次檢查精子密度，且精液離心后也未能發(fā)現(xiàn)精子為無(wú)精；精子密度≤ 15×106/mL為少精?；颊呔橥鈪⑴c本研究。

1.2 染色體核型分析 2.5 mL無(wú)菌注射器抽取患者全血2 mL，立刻加入0.5 mL配置好的肝素溶液備用(使用無(wú)菌生理鹽水調(diào)整肝素濃度為500 U/mL)。取肝素抗凝血0.8～1.2 mL，在淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)3 d。按照染色體G顯帶操作技術(shù)，制片后進(jìn)行染色體核型分析。染色體正常核型為(46，XX/46，XY)。

1.3 Y染色體AZF微缺失檢測(cè) 使用EDTA抗凝管抽取患者全血2 mL。 ①PCR與瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)Y染色體控制精子生成基因(AZF)的15個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)：隨機(jī)挑選300例受檢對(duì)象，使用DNA提取試劑盒提取全血細(xì)胞的DNA。按照亞能生物技術(shù)公司AZF微缺失檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。PCR(聚合酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增AZF的15個(gè)STS：AZFa為SY82、SY84、SY86 ；AZFb 為SY124、SY127、SY128、SY133、SY134、SY143 ；AZFc 為SY152、SY239、SY242、SY254、SY255 ；AZFb+c為SY145。陽(yáng)性對(duì)照為已經(jīng)確定Y染色體AZF各區(qū)段無(wú)缺失的正常男性，陰性對(duì)照為正常女性，一對(duì)擴(kuò)增SRY(位于Y染色體短臂上的性別決定基因)的引物作為內(nèi)控。PCR 產(chǎn)物10 μL經(jīng)4.0%瓊脂糖凝膠電泳100 V/40 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行DNA 電泳條帶的觀察。②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AZF的6個(gè)STS：275例受檢對(duì)象，使用DNA提取試劑盒提取全血細(xì)胞的DNA。按照上海透景生命科技有限公司AZF檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。用多重 PCR技術(shù)快速檢測(cè)Y染色體AZF基因家族AZFa、AZFb、AZFc三個(gè)區(qū)域中的6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)：AZFa為SY84、SY86 ；AZFb 為SY127、SY134；AZFc 為SY254、SY255。每個(gè)樣品需做A組和B組兩個(gè)多重PCR反應(yīng)，A組包括sY254、sY127、sY86三個(gè)位點(diǎn)，B組包括sY134、sY84、sY255三個(gè)位點(diǎn)。另外，每組設(shè)置一對(duì)擴(kuò)增SRY基因的引物作為內(nèi)對(duì)照。通過(guò)擴(kuò)增曲線直接觀察結(jié)果。根據(jù)2003歐洲男科學(xué)協(xié)會(huì)Y 染色體AZF微缺失分子診斷指南,推薦AZF檢測(cè)應(yīng)至少包含以下STS引物：AZFa: sY84,sY86; AZFb: sY127,sY134; AZFc: sY254,sY255。STS能夠擴(kuò)增出來(lái)說(shuō)明該區(qū)域序列未發(fā)生缺失。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型異常情況 575例男性不育癥患者中，染色體核型異常61例，染色體核型分析異常率為10.61%(61/575)；其中最常見(jiàn)的異常類型為47，XXY，共49例，占80.33%(49/61)；其他異常核型包括1例48，XXXY、1例46，XXY,rob(13;14)(q10;q10)、性反轉(zhuǎn)3例46，XX、Y染色體部分缺失4例46,XY,del(Y)(q11.23)、Y染色體倒位3例46，XY，inv(Y)。

2.2 Y染色體AZF微缺失情況 575例患者中，Y染色體AZF缺失41例，缺失率為7.13%(41/575)；其中僅AZFa缺失3例，僅AZFb缺失2例，僅AZFc缺失19例，AZFa及AZFb復(fù)合缺失1例，AZFb及AZFc復(fù)合缺失11例，全部缺失5例。

3 討論

有關(guān)Y染色體微缺失遺傳型與表型的關(guān)系已進(jìn)行了大量研究，對(duì)臨床有非常好的指導(dǎo)作用。AZFa、AZFb和AZFc三個(gè)區(qū)域全部缺失的患者，100%表現(xiàn)為無(wú)精子癥，通過(guò)任何手段都不可能從睪丸中獲得精子。AZFa區(qū)域整段缺失通常導(dǎo)致唯支持細(xì)胞綜合征(SCO綜合征)，臨床表現(xiàn)為無(wú)精子癥[7]。如果診斷為整段AZFa區(qū)域缺失，若想從睪丸中獲得精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI )已不大可能。AZFb和AZFb+c整段缺失的典型睪丸組織學(xué)特征是SCO綜合征或生精阻滯。與AZFa區(qū)域整段缺失的情況類似，此類患者在睪丸穿刺時(shí)也找不到精子，因此不推薦給這類患者施行ICSI。AZFc缺失的臨床和睪丸組織學(xué)表型多種多樣，通常AZFc缺失患者尚殘存精子生成能力，AZFc缺失見(jiàn)于無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥患者，罕見(jiàn)情況下，也可以在自然狀態(tài)下遺傳給其男性后代(由于該基因位于Y染色體上，通常情況下患者不能生育，但也有罕見(jiàn)情況，即患者發(fā)生自然生育，這樣患者會(huì)將該基因缺失遺傳給其男性后代，其男性后代也會(huì)發(fā)生無(wú)精癥或者嚴(yán)重少精癥)。在無(wú)精子癥患者中，AZFc缺失者通過(guò)睪丸取精術(shù)獲得精子的機(jī)會(huì)要大得多，也可以進(jìn)行ICSI助孕。但這些患者的男性子代將是AZFc缺失的攜帶者。另外，有研究[8～12]發(fā)現(xiàn)，AZFc區(qū)域缺失的少精子癥患者，其精子數(shù)目有進(jìn)行性下降的趨勢(shì)，最后發(fā)展為無(wú)精子癥。因此，對(duì)AZFc區(qū)域缺失的少精子癥患者，應(yīng)及早進(jìn)行治療或?qū)⑵渚哼M(jìn)行冷凍保存。Klinefelter綜合征臨床表現(xiàn)為睪丸小而硬、不育或生精障礙、男性乳房發(fā)育、身材過(guò)高和骨骼比例失常(類睪丸消失綜合癥)、高促性腺激素血癥及多X染色體核型。但由于該綜合征臨床表現(xiàn)的變化較大，臨床醫(yī)生缺乏足夠和非常專業(yè)的知識(shí)，許多患者未被診斷，或者診斷的很晚。而早期診斷和雄激素補(bǔ)充治療，能改善患者生活質(zhì)量、預(yù)防嚴(yán)重后果。通過(guò)輔助生殖技術(shù)(ART)，結(jié)合睪丸活檢，可以使部分患者生育健康后代，但為了防止染色體異常疾病下傳給患者后代，必須加強(qiáng)輔助生殖植入前和出生前的遺傳學(xué)診斷。及時(shí)進(jìn)行Y染色體AZF微缺失檢測(cè)及染色體核型分析對(duì)不育癥的診斷及治療具有非常重要的意義，及早的診斷可以避免不必要的手術(shù)及藥物治療；同時(shí)對(duì)有可能生育的患者選擇確實(shí)可行的方法治療或ART，完成患者生殖愿望。

不同地區(qū)或?qū)嶒?yàn)室報(bào)道的不育癥患者染色體核型異常類型及Y染色體AZF微缺失率差別較大。本研究發(fā)現(xiàn)貴州地區(qū)男性不育癥患者染色體核型異常率為10.6%，最常見(jiàn)的異常類型為47，XXY(占80.33%)；Y染色體AZF微缺失率為7.13%，最常見(jiàn)類型為僅AZFc缺失(占43.34%)。這一結(jié)果提示染色體核型異常及Y染色體AZF微缺失在貴州地區(qū)男性不育癥患者中的發(fā)生率均較高，對(duì)染色體核型及Y染色體AZF微缺失進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)將有助于男性不育癥原因的發(fā)現(xiàn)，也有助于本病的診斷及治療。

[1] Thomas NS, Collins AR, Hassold TJ, et al. A reinvestigation of non-disjunction resulting in 47, XXY males of paternal origin[J]. Eur J Hum Genet, 2000,8(10):805-808.

[2] 黃錦，廉穎，劉平．Klinefelter綜合征患者胚胎著床前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)用[J]．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18(3)：52．

[3] Vernaeve V, Staessen C, Verheyen G, et al． Can biological or clinical parameters predict testicular sperm recovery in 47, XXY klinefelter′s syndrome patients [J] . Ham Reprod, 2004,19(5)：135-1139.

[4] 丁顯平，鐘影，魏霞．等.成都地區(qū)男性原發(fā)性無(wú)精癥患者Y染色體AZF區(qū)域微缺失基因診斷的研究[J]．國(guó)外醫(yī)學(xué)·臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，26(8)：498-502．

[5] 李鵬麗，李嬌，馬云霞，等．150例無(wú)精子和少精子癥患者Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測(cè)及染色體核型分析[J]．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(7)：30-32．

[6] 萬(wàn)凌，丁顯平．165例男性不育染色體核型及AZF基因缺失分析[J]．中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志，2014，22(9)：55-56．

[7] 邵法明，朱曉斌，李錚．男性不育癥ICSI治療的遺傳風(fēng)險(xiǎn)分析[J]．中華男科學(xué)雜志，2008，14(1)：71-74．

[8] 吳青，王會(huì)，劉玉林，等．中國(guó)漢族人群AZFc微缺失區(qū)域序列標(biāo)簽位點(diǎn)的探討[J]．中華男科學(xué)雜志，2011，17(5)：391-395．

[9] Han XY, Jin L, Fan GS, et al. Fetal anomalies in second trimester in recent ten years: clinical analysis of 116 cases[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 2009,89(15):1053-1056.

[10] Anderson CL, Brown CE. Fetal chromosomal abnormalities: antenatal screening and diagnosis[J]. Am Fam Physician, 2009,79(2):117-123.

[11] Ambulkar PS, Sigh R, Reddy M, et al. Genetic risk of azoospermia factor (AZF) microdeletions in idiopathic cases of azoospermia and oligozoospermia in central Indian population[J]. J Clin Diagn Res, 2014,8(3):88-91.

[12] Vijesh VV, Nambiar V, Mohammed SI, et al. Screening for AZFc partial deletions in Dravidian men with nonobstructive azoospermia and oligozoospermia[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2015,19(3):150-155.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.47.012

R698.2

B

1002-266X(2017)47-0042-03

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(2015-7168，2015-4015，2015-7169)。

聶瑛潔(E-mail： 744565742@qq.com)

2017-08-09)