王建民，袁祥文，劉杰慧，李建平

(1萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪271100；2山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院)

miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中的表達(dá)及對人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響

王建民1，袁祥文1，劉杰慧2，李建平2

(1萊蕪市人民醫(yī)院，山東萊蕪271100；2山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院)

目的觀察miR-125b在年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)患者晶狀體前囊膜中的表達(dá)變化，及miR-125b對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響。方法收集ARC患者術(shù)中獲取的晶狀體前囊膜標(biāo)本40例份為ARC組，以正常人眼晶狀體前囊膜標(biāo)本20例份為對照組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測兩組的miR-125b。體外培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)-SRA01/04，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組、凋亡模型組和正常組，實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組采用紫外線照射法制備晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測凋亡模型組和正常組細(xì)胞中的miR-125b。分別將hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞中的miR-125b，用流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率，以ELISA法檢測細(xì)胞中Caspase3/7活性。結(jié)果ARC組與對照組晶狀體前囊膜中miR-125b相對表達(dá)量分別為0.37±0.08、1.02±0.04，兩組相比，P<0.01。凋亡模型組與正常組細(xì)胞中miR-125b的相對表達(dá)量分別為0.45±0.09、1.04±0.03，兩組相比，P<0.01。轉(zhuǎn)染后48 h實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組細(xì)胞凋亡率分別為18.7%±1.89%、52.27%±3.14%，兩組相比，P<0.01。轉(zhuǎn)染后48 h實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組Caspase-3/7活性分別為168.21±27.36、359.89±36.45，兩組相比，P<0.01。結(jié)論ARC患者晶狀體前囊膜中miR-125b呈低表達(dá)。過表達(dá)的miR-125b能夠抑制晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，降低凋亡相關(guān)酶的活性。

微小RNA125b；白內(nèi)障；年齡相關(guān)性白內(nèi)障；晶狀體上皮細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

年齡相關(guān)性白內(nèi)障(ARC)是致盲性眼病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。ARC的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，老齡、紫外線、糖尿病、藥物、輻射等因素參與了ARC的發(fā)生發(fā)展。ARC尚無有效的藥物防治手段[2]，因此探討ARC發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，可能為白內(nèi)障的預(yù)防及治療提供新的思路。晶狀體上皮細(xì)胞位于晶狀體前囊膜及赤道部囊膜下，為單層立方上皮。研究[3]表明，晶狀體上皮細(xì)胞凋亡是除先天性白內(nèi)障以外其他所有類型白內(nèi)障形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。微小RNA(miRNA)是一類存在于生物體中能夠調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可通過降解靶基因mRNA或阻止其蛋白翻譯從而對下游靶基因起到調(diào)節(jié)作用，廣泛參與機(jī)體細(xì)胞增殖、代謝、分化、凋亡等過程[4]。近年研究[5]發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)在眼部呈細(xì)胞和組織特異性，在白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用[6]。miR-125b是miRNAs家族成員之一，在多種組織中起調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用[7,8]。目前有關(guān)miR-125b與ARC發(fā)病關(guān)系的研究甚少，為此，本研究觀察了miR-125b在ARC患者晶狀體前囊膜中的表達(dá)變化，及miR-125b對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 收集2016年4～7月在山東大學(xué)附屬濟(jì)南市中心醫(yī)院眼科住院治療的ARC患者超聲乳化白內(nèi)障吸除術(shù)中獲取的晶狀體前囊膜標(biāo)本40例份(40眼)作為ARC組，患者中男15例(15眼)、女25例(25眼)，年齡(59.8±12.7)歲。收集角膜移植術(shù)后正常供體眼球晶狀體前囊膜標(biāo)本20例份(20眼)作為對照組，患者中男7例(7眼)、女13例(13眼)，年齡(54.0±10.4)歲。兩組標(biāo)本來源患者性別、年齡等基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。人晶狀體上皮細(xì)胞(HLEC)-SRA01/04購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，細(xì)胞復(fù)蘇后接種至含10%新生胎牛血清、1%青鏈霉素的a-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC均購自廣州銳博生物科技公司；TRIzol試劑和LipofectamineTM2000試劑均購自Invitrogen公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生生物工程公司；miR-125b和U6引物由上海吉凱生物制藥公司設(shè)計(jì)合成；Anexin-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物公司；po-ONE Homogeneous Caspase3/7檢測試劑盒購自Promega公司。

1.2 ARC患者晶狀體前囊膜中miR-125b表達(dá)觀察 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。用TRIzol試劑提取晶狀體前囊膜組織總RNA，測RNA濃度，以1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以U6作為內(nèi)參，miR-125b的相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。

1.3 miR-125b對晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的影響觀察

1.3.1 細(xì)胞分組及晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型制作 將HLEC-SRA01/04分為實(shí)驗(yàn)組、凋亡模型組、正常組。實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組參考文獻(xiàn)[9]方法制作晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型。取對數(shù)期的HLEC-SRA01/04，將培養(yǎng)液吸凈，PBS沖洗2次后置于紫外燈下照射25 min，強(qiáng)度360 μW/cm2，光譜280～320 nm，峰值312 nm。將各組細(xì)胞以不含EDTA的胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，每組取細(xì)胞懸液5 mL置于流式管中，依次加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光反應(yīng)15 min后加入300 μL的結(jié)合緩沖液后立即送流式細(xì)胞儀測算細(xì)胞凋亡率。凋亡模型組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組，表明晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型制作成功。

1.3.2 細(xì)胞凋亡模型中miR-125b檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測凋亡模型組與正常組細(xì)胞中的miR-125b。方法同“1.2”。

1.3.3 hsa-miR-125b mimics轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組細(xì)胞接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞密度為30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書，分別將hsa-miR-125b mimics及陰性對照mimics-NC轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組細(xì)胞。經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測實(shí)驗(yàn)組和凋亡模型組細(xì)胞中miR-125b相對表達(dá)量分別為5.78±0.31、1.02±0.04，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中miR-125b相對表達(dá)量高于凋亡模型組(P<0.01)，證明轉(zhuǎn)染成功。

1.3.4 各組細(xì)胞凋亡率測算 取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。方法同“1.3.1”。

1.3.5 Caspase-3/7活性檢測 取轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，將底物與緩沖液按試劑盒說明書混合后，每孔加入100 μL的Caspase試劑混合液，搖床輕搖混勻30 s，室溫避光孵育2 h，采用ELISA平板計(jì)數(shù)器測定490 nm波長處的細(xì)胞熒光強(qiáng)度，代表Caspase-3/7活性。

2 結(jié)果

2.1 ARC組與對照組晶狀體組織中miR-125b表達(dá)比較 ARC組與對照組晶狀體前囊膜中miR-125b相對表達(dá)量分別為0.37±0.08、1.02±0.04，兩組相比，P<0.01。

2.2 凋亡模型組與正常組細(xì)胞中miR-125b表達(dá)比較 凋亡模型組與正常組細(xì)胞中miR-125b的相對表達(dá)量分別為0.45±0.09、1.04±0.03，兩組相比，P<0.01。

2.3 實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組細(xì)胞凋亡率比較 轉(zhuǎn)染后48 h實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組細(xì)胞凋亡率分別為18.7%±1.89%、52.27%±3.14%，兩組相比，P<0.01。

2.4 實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組Caspase-3/7活性比較 轉(zhuǎn)染后48 h實(shí)驗(yàn)組與凋亡模型組Caspase-3/7活性分別為168.21±27.36、359.89±36.45，兩組相比，P<0.01。

3 討論

白內(nèi)障是晶狀體衰老的一種表現(xiàn)，是多種因素作用共同作用的結(jié)果，如氧化損傷、長期紫外線照射、輻射等。晶狀體上皮細(xì)胞的活性狀態(tài)與晶狀體的透明性密切相關(guān)，晶狀體上皮細(xì)胞衰老凋亡使得其抗氧化能力下降，清除晶狀體內(nèi)自由基的能力下降，進(jìn)而使得晶狀體產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致晶狀體渾濁[10]。晶狀體上皮細(xì)胞凋亡在除先天性白內(nèi)障之外的眾多類型白內(nèi)障發(fā)生過程中占有重要地位[3]，但具體機(jī)制尚不完全明確。

近期研究[11]表明，miRNAs在眼部生長、發(fā)育、功能調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。Kubo等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白內(nèi)障大鼠晶狀體中有100種miRNA表達(dá)水平異于正?！，F(xiàn)已證實(shí)多種miRNA在ARC的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。miRNA在晶狀體細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中的調(diào)控作用對白內(nèi)障發(fā)生發(fā)展的影響受到研究者的關(guān)注。Cvekl等[13]發(fā)現(xiàn)miR-204在促進(jìn)黃斑區(qū)發(fā)育和維持晶狀體透明中發(fā)揮重要作用。Wu等[14]報(bào)道高表達(dá)的miR-184與維持人類晶狀體的透明性密切相關(guān)。Nishino等[15]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的let-7b可導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡，從而可能引發(fā)白內(nèi)障。黎清蘭等[16]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34a能夠促進(jìn)HLEC衰老，可能與ARC的形成有關(guān)。miR-125b有調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[7，8]，但其與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，ARC患者晶狀體前囊膜標(biāo)本中miR-125b表達(dá)水平低于正常，提示miR-125b在ARC的發(fā)生發(fā)展中可能起到一定作用。我們通過紫外線照射制備晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型，發(fā)現(xiàn)miR-125b在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡模型中的表達(dá)水平較正常晶狀體上皮細(xì)胞明顯降低，提示miR-125b表達(dá)異常可能與晶狀體上皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。

為進(jìn)一步研究miR-125b在晶狀體上皮細(xì)胞凋亡中的作用，我們將miR-125b mimics轉(zhuǎn)染HLEC凋亡模型，提高細(xì)胞中miR-125b的表達(dá)水平，流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率明顯下降，且細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)酶活性下降，進(jìn)一步證實(shí)miR-125b與HLEC的凋亡有關(guān)，miR-125b表達(dá)異常在白內(nèi)障的發(fā)病過程中可能起重要作用。miR-125b有望成為ARC治療的新靶點(diǎn)。miR-125b調(diào)控晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的具體分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。Le等[7]在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤和肺成纖維細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠通過下調(diào)p53表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡。Shi等[8]對雄激素受體陽性的前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可通過下調(diào)促凋亡基因BAK1表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。miR-125b在不同的組織細(xì)胞中有著不同的上游和下游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，miR-125b對晶狀體上皮細(xì)胞的促凋亡作用具體機(jī)制有待我們在以后實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索。

[1] Resnikoff S, Keys TU. Future trends in global blindness[J]. Indian J Ophthalmol, 2012,60(5):387-395.

[2] Resnikoff S, Pascolini D, EtyaaleD, et al. Global data on visual impairment in the year 2002[J]. Bull World Health Organ, 2004,82(11):844-851.

[3] Bianchi E, Scarinci F, Grande C, et al. I mmunohistochemical profile of VEGF, TGF-β and PGE in human pterygium and normal conjunctiva: experimental study and review of the literature [J]. Int J Immunopathol Pharmacol, 2012,25(3):607-615.

[4] Bartel DP. MicroRNAs: genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell, 2004,116(2):281-297.

[5] Xu S, Witmer PD, Lumayag S, et al. MicroRNA (miRNA) transcriptome of mouse retina and identification of a sensory organ-specific miRNA cluster[J]. J Biol Chem, 2007,282(34):25053-25066.

[6] Li Y, Liu S, Zhang F, et al. Expression of the microRNAs hsa-miR-15a and hsa-miR-16-1 in lens epithelial cells of patients with age-related cataract[J]. Int J Clin Exp Med, 2015,8(2):2405-2410.

[7] Le MT, Teh C, Shyh-Chang N, et al. MicroRNA-125b is a novel negative regulator of p53[J]. Genes Dev, 2009,23(7):862-876.

[8] Shi XB, Xue L, Yang J, et al. An androgen-regulated miRNA suppresses Bak1 expression and induces androgen-independent growth of prostate cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2007,104(50):19983-19888.

[9] 譚鋼,吳安花,邵毅,等.miR-210靶向沉默Bcl-2誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡[J].眼科新進(jìn)展,2016,36(8):701-708.

[10] Qi B, Ji Q, Wen Y, et al. Lyciumbarbarumpolysaccharides protect human lens epithelial cells against oxidative stress-induced apoptosis and senescence[J]. PLoS One, 2014,9(10):e110275．

[11] Zhao JJ, Yang J, Lin J, et al. Identification of miRNAs associated with tumorigenesis of retinoblastoma by miRNA microarray analysis[J]. Childs Nerv Syst, 2009,25(1): 13-20.

[12] Kubo E, Hasanova N, Sasaki H, et al. Dynamic and differential regulation in the microRNA expression in the developing and maturecataractous rat lens[J]. J Cell Mol Med, 2013,17(9):1146-1159．

[13] Cvekl A, Mitton KP. Epigenetic regulatory mechanisms in vertebrate eye development and disease[J]. Heredity (Edinb), 2010,105(1):135-151．

[14] Wu C, Lin H, Wang Q, et al. Discrepant expression of microRNAs in transparent and cataractous human lenses[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2012,53(7):3906-3912．

[15] Nishino J, Kim I, Chada K, et al. Hmga2 promotes neural stem cell self-renewal in young but not old mice by reducing p16Ink4a andp19Arf Expression[J]. Cell, 2008,135(2):227-239．

[16] 黎清蘭,郭?？?張洪祥.MicroRNA-34a對人晶狀體上皮細(xì)胞衰老的影響[J].眼科新進(jìn)展,2016,36(4):323-326.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.39.009

R776.1

A

1002-266X(2017)39-0033-03

2017-05-03)