王傳海，徐程，李湘秦，吳勇，杜舟

（深圳市公安局刑事警察支隊(duì)刑事技術(shù)處，廣東深圳 518040）

直接擴(kuò)增法用于重大災(zāi)難事故中軟骨的個(gè)體識別

王傳海，徐程，李湘秦，吳勇，杜舟

（深圳市公安局刑事警察支隊(duì)刑事技術(shù)處，廣東深圳 518040）

目的探討直接擴(kuò)增法對軟骨STR檢驗(yàn)的有效性，以提高災(zāi)難受害者身源鑒定工作效率。方法采用PowerPlex?21試劑盒對88份軟骨進(jìn)行直接擴(kuò)增法檢驗(yàn)，同步進(jìn)行磁珠法比較分型結(jié)果。結(jié)果88份軟骨檢材中，直接擴(kuò)增法與磁珠法均成功檢出84份檢材的STR基因型，兩者分型結(jié)果完全一致。結(jié)論P(yáng)owerPlex?21試劑盒直接擴(kuò)增法可以應(yīng)用于軟骨STR分型檢驗(yàn)，且操作簡便、快速，在重大災(zāi)難事故身源鑒定中具有很好的應(yīng)用前景。

法醫(yī)遺傳學(xué)；軟骨；基因分型技術(shù)；直接擴(kuò)增法；個(gè)體識別

在重大災(zāi)難事故中，遇難者身份識別工作非常重要，不僅可以有效地指導(dǎo)救援及善后處理工作，而且關(guān)系到社會(huì)的穩(wěn)定，如何快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行身份識別就顯得尤為重要。DNA技術(shù)是身份識別工作中最核心的環(huán)節(jié)。軟骨與血液、軟組織等相比不易腐敗，同時(shí)比骨骼、牙齒更易于處理，因此成為腐敗尸體STR檢驗(yàn)的首選檢材。國內(nèi)很早就有關(guān)于軟骨DNA STR檢驗(yàn)的研究[1]和通過檢測肋軟骨DNA含量推斷死亡時(shí)間（PMI）的研究[2]。直接擴(kuò)增法因其操作簡便、快速，目前已廣泛應(yīng)用于血痕[3，4]、口腔拭子等檢材的案件檢驗(yàn)[5]以及DNA數(shù)據(jù)庫建設(shè)[6]中，將其應(yīng)用于軟骨樣本的相關(guān)報(bào)道較為少見。為加快災(zāi)難受害者身源鑒定，本研究對“2015.12.20深圳山體滑坡事故”中的88份軟骨采用直接擴(kuò)增法，并同步與磁珠法檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較研究，以驗(yàn)證軟骨直接擴(kuò)增法在災(zāi)難受害者身源鑒定中的可行性。

1 材料與方法

1.1 樣本

樣本來自“2015.12.20深圳山體滑坡事故”中遇難者遺骸，死亡時(shí)間在4～30d，其中肋軟骨61份，關(guān)節(jié)面軟骨27份，共計(jì)88份，所取軟骨呈不同程度的腐敗。

1.2 主要儀器和試劑

9700型PCR擴(kuò)增儀、3500XL型遺傳分析儀（美國AB公司），KingFisher Due Prime微量生物物證DNA自動(dòng)化提取純化系統(tǒng)（美國Thermo Scientific公司）。

PowerPlex?21試劑盒（美國Promega公司），ML-超微量磁珠法DNA提取試劑盒（長春博坤生物科技有限公司）。

1.3 取樣及DNA提取

直接擴(kuò)增法：88份軟骨檢材去除肌肉等軟組織后，用刀片在軟骨中部內(nèi)側(cè)切取2mm×2mm大小、約0.5mm厚的軟骨薄片，置于0.2mL的擴(kuò)增管底部。

磁珠法：88份軟骨檢材去除肌肉等軟組織后，用刀片在軟骨中部內(nèi)側(cè)切取10mm×5mm大小、約0.5mm厚的軟骨薄片，置于1.5mL的離心管中。加入消化液ML 360μL，10mg/mL的PK 30μL，DTT 10μL，56℃振蕩孵育1h。孵育后渦旋振蕩混勻，以離心半徑8cm，12 000 r/min，離心3 min。將離心后的消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到ML-超微量磁珠法DNA提取試劑反應(yīng)板中，在KingFisher Due Prime平臺上提取DNA，用40 μL高純水洗脫回收純化后的DNA。

1.4 擴(kuò)增及電泳

直接擴(kuò)增法：選用PowerPlex?21試劑盒，擴(kuò)增體系為Master Mix 2 μL、Primer Mix 2 μL、H2O 6 μL。直接加入擴(kuò)增管中，使軟骨完全浸泡在試劑中。

磁珠法：擴(kuò)增體系為10μL，取提取的DNA 1 μL作為模版，加入Master Mix 2 μL、Primer Mix 2 μL、H2O 5μL在同一擴(kuò)增管中。

擴(kuò)增參數(shù)：96℃熱啟動(dòng)1 min；94℃10 s，59℃1min，72℃30s，29個(gè)循環(huán)；60℃20min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

同時(shí)選取PowerPlex?21試劑盒中2800為陽性對照，純水作為陰性對照進(jìn)行擴(kuò)增。

電泳：取擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，加入10 μL甲酰胺和內(nèi)標(biāo)的混合物（1 000∶70），在3500XL型遺傳分析儀上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測分型。相對熒光信號單位值（relative fluorescence units，RFU）≥150為檢出成功。

2 結(jié)果

直接擴(kuò)增法檢驗(yàn)的88份軟骨樣本中，4份未檢出STR分型，其余84份均得到完整的分型圖譜，檢出的成功率為95.45%，各基因座之間峰高均衡性好，同一基因座等位基因峰高差小于30%，峰寬小于1.5bp。

磁珠法檢驗(yàn)的結(jié)果和直接擴(kuò)增法完全一致，同一檢材采用兩種方法得到的STR分型結(jié)果一致，未見等位基因丟失、多帶等現(xiàn)象。直接擴(kuò)增法檢驗(yàn)未得到STR分型的4份檢材，采用磁珠法提取DNA后擴(kuò)增檢驗(yàn)仍無法得到STR分型。

3 討論

重大災(zāi)難事故的現(xiàn)場通常環(huán)境特殊，遇難者人數(shù)多，且遺骸受到嚴(yán)重的損毀，大部分不具備直接辨認(rèn)條件。對于尸源的認(rèn)定，依靠隨身物品、尸檢記錄或者醫(yī)療記錄等方式具有很大的局限性，結(jié)果往往不可靠。DNA具有個(gè)體組織同一性，同一個(gè)體不同組織的STR分型完全相同[7]，因此，只要提取到足夠的DNA用于STR檢驗(yàn)，可以不受組織來源、形態(tài)特征的限制，有效地將遇難者各部分殘缺遺骸相互關(guān)聯(lián)起來，實(shí)現(xiàn)同一認(rèn)定。目前，利用DNA技術(shù)進(jìn)行災(zāi)難受害者身源鑒定已成為重大災(zāi)難事故處置中最為科學(xué)、準(zhǔn)確、高效的首選方法。為了及時(shí)將遇難者遺骸歸還家屬、穩(wěn)定社會(huì)以及妥善安排善后工作，DNA檢驗(yàn)應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行身份識別，確定死亡人員及死亡人數(shù)。

重大災(zāi)難事故現(xiàn)場處置時(shí)間一般較長，加上環(huán)境特殊，因此，易于腐敗的血液、軟組織等往往難以適用于后續(xù)的檢驗(yàn)，而軟骨、骨、牙齒具有較強(qiáng)的抗腐蝕能力，多為災(zāi)難受害者身源鑒定中DNA提取的主要檢材。但骨和牙齒的提取實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，需要近2d的時(shí)間[8]，操作過程復(fù)雜。軟骨是特異化的致密結(jié)締組織，細(xì)胞間質(zhì)堅(jiān)固而有彈性，DNA提取相對更為快速、便捷。成年人軟骨主要存在于骨的關(guān)節(jié)面、肋軟骨、氣管、耳廓、椎間盤等處。目前軟骨DNA的提取多采用Chelex-100法、有機(jī)法、磁珠法、硅珠法等[9，10]，這些方法都需要對軟骨組織進(jìn)行前期處理、DNA裂解、提取以及純化等，直接擴(kuò)增法省略了這些步驟，有效地節(jié)約了檢驗(yàn)所需的時(shí)間，同時(shí)減少了潛在污染的發(fā)生。

本研究用PowerPlex?21試劑盒直接擴(kuò)增軟骨檢材的DNA，獲取STR分型結(jié)果。技術(shù)上影響分型結(jié)果的因素主要有以下幾點(diǎn)：（1）檢材剪取時(shí)軟骨切片的大小和厚度決定了DNA分子的釋放；（2）軟骨中DNA的含量受個(gè)體因素和腐敗程度的影響，不同個(gè)體軟骨中DNA含量有所不同；（3）檢材中擴(kuò)增抑制劑的含量影響擴(kuò)增的效果，抑制劑的來源包括機(jī)體腐敗產(chǎn)生的抑制劑和泥土中含有的腐殖質(zhì)等。為了提高檢驗(yàn)成功率，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意：（1）為增加DNA的釋放量，軟骨切片大小適中，切片厚度應(yīng)小于0.5mm；（2）根據(jù)檢材情況，對嚴(yán)重腐敗的檢材適當(dāng)增加取材量；（3）為減少抑制劑的影響，取材時(shí)盡量選取中間部位，此外還可選擇25μL擴(kuò)增體系降低抑制劑的濃度。

“2015.12.20深圳滑坡事故”發(fā)生于工業(yè)園區(qū)，遇難者多為外來務(wù)工人員，長期離家打工暫居于工廠宿舍中，個(gè)人生前物品在災(zāi)難發(fā)生后被毀，個(gè)體身源認(rèn)定主要依靠與家屬之間的親緣比對。三聯(lián)體親權(quán)鑒定至少要檢測15個(gè)STR基因座；單親親權(quán)鑒定如果檢測至18個(gè)STR基因座且沒有矛盾基因座出現(xiàn)，可以得出“不排除親生關(guān)系”的結(jié)論[11]。有研究采用Identifiler Direct PCR[12]、PowerPlex?16 HS[13]試劑盒對肋軟骨進(jìn)行直接擴(kuò)增法檢驗(yàn)，兩種試劑盒檢驗(yàn)的STR基因座均為15個(gè)，擴(kuò)增得到的STR等位基因較少，因本次事故遇難者身源鑒定中，涉及45個(gè)三聯(lián)體親緣鑒定和13個(gè)二聯(lián)體親緣鑒定，故上述兩個(gè)試劑盒在本次事故中難以得出可靠的結(jié)論。采用的PowerPlex?21體系含有20個(gè)常染色體STR和性別基因座，相比之下增加了5個(gè)基因座，其中包含D2S1338、Penta E和在中國人群中有很好多態(tài)性的D6S1043[14]，三者個(gè)體識別率分別為0.959、0.984和0.942[15]，大大提高了親權(quán)指數(shù)及親緣認(rèn)定的可信度。

同時(shí)，Identifiler Direct PCR[12]、PowerPlex?16 HS[13]試劑盒直接擴(kuò)增時(shí)間需要2.5 h以上，PowerPlex?21試劑盒所需的擴(kuò)增時(shí)間為1.5h左右，大大縮短了DNA檢驗(yàn)所需的時(shí)間。

死后變化的影響因素不僅包括自然環(huán)境（溫度、濕度、空氣等），還與尸體本身的因素（年齡、性別、體型等）相關(guān)。本研究中，共有2份肋軟骨和2份關(guān)節(jié)面軟骨采用兩種方法均未檢出死者的STR分型，后期通過骨骼檢驗(yàn)，確認(rèn)其中3份為兒童樣本。兒童、嬰幼兒由于其體內(nèi)水分比例較成年人高，故死后變化發(fā)展較快[16]，軟骨腐敗程度較成年人高，難以檢出。另外1例未檢出樣本為此次事故中最晚發(fā)現(xiàn)的遇難者，取材距離事故發(fā)生已有30d，軟骨組織腐敗嚴(yán)重，關(guān)節(jié)面軟骨腐敗致切片渾濁且無韌性。有研究[17]表明，大鼠死后28d，肋軟骨細(xì)胞核完全崩解，對肋軟骨進(jìn)行STR分型檢驗(yàn)具有很大的難度，此后對死者身源的鑒定，軟骨組織已經(jīng)不再適用，骨骼和牙齒的檢驗(yàn)結(jié)果更為可靠。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了PowerPlex?21體系直接擴(kuò)增法對軟骨擴(kuò)增的有效性，該方法操作簡便、快速，在重大災(zāi)難事故身源鑒定中具有很好的應(yīng)用前景。

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Individual Identification of Cartilage by Direct Amplification in Mass Disasters

WANG Chuan-hai,XU Cheng,LI Xiang-qin,WU Yong,DU Zhou
（Criminal Technology Division,Criminal Police Detachment,Shenzhen Public Security Bureau,Shenzhen 518040,China）

ObjectiveTo explore the effectiveness of direct amplification for the STR analysis of cartilage,and to accelerate the effectiveness of disaster victim identification.MethodsEighty-eight cartilage samples were directly amplified by PowerPlex?21 kit,and the results of genotyping were compared with that obtained by the magnetic beads method.ResultsIn 88 cartilage samples,the STR genotypes were successfully detected from 84 samples by direct amplification and magnetic beads method,and both the results of genotyping by two method were consistent.ConclusionDirect amplification with Power-Plex?21 kit can be used for STR genotyping of cartilages.This method is operated easily and promptly, which has a potential application in the individual identification of mass disasters.

forensic genetics;cartilage;genotyping techniques;direct amplification;individual identification

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.014

1004-5619（2017）03-0281-03

2016-02-23）

（本文編輯：柳燕）

王傳海（1973—），男，碩士，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)和鑒定；E-mail：boatseawang＠126.com

徐程，女，碩士，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)和鑒定；E-mail：xucheng19891020＠aliyun.com