時海榮，楊揚,2

(1桂林醫(yī)學(xué)院, 廣西桂林 541004;2廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室)

·基礎(chǔ)研究·

草果揮發(fā)油聯(lián)合環(huán)磷酰胺對肝癌細(xì)胞增殖的影響

時海榮1，楊揚1,2

(1桂林醫(yī)學(xué)院, 廣西桂林 541004;2廣西肝臟損傷與修復(fù)分子醫(yī)學(xué)重點實驗室)

目的探討草果揮發(fā)油聯(lián)合環(huán)磷酰胺對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響。方法取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，隨機分為草果揮發(fā)油組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組及對照組，草果揮發(fā)油組加入不同濃度的草果揮發(fā)油(終濃度為10、20、30、40 μg/mL)，環(huán)磷酰胺組加入不同濃度的環(huán)磷酰胺(終濃度為10 、20 、40、60 、80 μg/mL)處理；聯(lián)合組加入不同濃度的草果揮發(fā)油(終濃度為10、20、30 、40 μg/mL)和環(huán)磷酰胺(終濃度為10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)處理；對照組加入相應(yīng)量的DMSO處理，采用MTT法測算各組細(xì)胞生長抑制率和協(xié)同指數(shù)(Q)。結(jié)果草果揮發(fā)油組、環(huán)磷酰胺組HepG2細(xì)胞增殖受到抑制，隨著作用濃度的升高，細(xì)胞生長抑制率增高，呈濃度依賴性；聯(lián)合組Q值≥0.85。結(jié)論草果揮發(fā)油在體外可發(fā)揮協(xié)同增強環(huán)磷酰胺抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用。

肝癌；草果揮發(fā)油；環(huán)磷酰胺；細(xì)胞增殖

草果又名草果子、草果仁，為姜科豆蔻屬多年生草本植物草果的干燥果實，是一種藥食同源植物，主要分布于我國廣西、四川、云南和貴州等地，其味辛，性溫，具有消食化積，祛痰截瘧，燥濕除寒等功效[1]。近年來多集中于對其揮發(fā)油提取方法、化學(xué)成分和生物活性的研究。研究者在分析草果揮發(fā)油成分組成的同時發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗腫瘤作用，尤其是在體內(nèi)外均能抑制肝癌細(xì)胞增殖[2～4]。環(huán)磷酰胺是常用的抗肝癌化療藥物，但由于耐藥性和不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限。2016年6～12月，我們探討草果揮發(fā)油與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用，旨在探討草果揮發(fā)油對常用抗肝癌藥物的增敏效果，為草果揮發(fā)油進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 草果揮發(fā)油由本實驗室提取純化；環(huán)磷酰胺(百靈威)；96孔板(JET-BIOFIL)；DMEM(Gibco)；胎牛血清(Hyclone)；青霉素(華北制藥股份有限公司)；鏈霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞株(由桂林醫(yī)學(xué)院藥理實驗室提供)；MTT粉末(Amresco)；二甲基亞砜(Amresco)；胰酶(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-Tek公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-15AC日本三洋)；恒溫水浴鍋(金壇恒豐儀器廠)；潔凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥(重慶銀河試驗儀器有限公司)；微量振蕩器(江蘇泰縣醫(yī)療器械廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含 10%胎牛血清，青霉素100 μg/mL 和鏈霉素100 μg/mL的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至 80%～90%時常規(guī)消化傳代，每2～3 d傳代 1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗[5]。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞生長抑制率測算 采用MTT法。取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液(濃度為5×104/mL)，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。將HepG2細(xì)胞隨機分為草果揮發(fā)油組、環(huán)磷酰胺組、聯(lián)合組及對照組，草果揮發(fā)油組加入不同濃度的草果揮發(fā)油(終濃度為10、20、30、40 μg/mL)，環(huán)磷酰胺組加入不同濃度的環(huán)磷酰胺(終濃度為10 、20 、40、60 、80 μg/mL)處理；聯(lián)合組加入不同濃度的草果揮發(fā)油(終濃度為10、20、30 、40 μg/mL)和環(huán)磷酰胺(終濃度為10 、20 、40 、60 、80 μg/mL)處理；對照組加入相應(yīng)量的DMSO處理[6]。培養(yǎng)24 h后鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)后加入MTT(每孔20 μL)，4 h后，棄去原培養(yǎng)液，加入100 μL DMSO，置于微量振蕩器上振蕩10 min；于波長490 nm處測其吸光度(A)值，計算抑制率。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù) 3 遍。細(xì)胞生長抑制率=[1- (實驗組平均A值-空白對照組A值)/(對照組平均A值-空白對照組A值) ]×100%[7]。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)采用金正均法[8]計算兩藥協(xié)同作用的指數(shù)Q值，公式為：Q=EAB/(EA+EB-EA×EB)，判斷兩藥相互作用的性質(zhì)[9]。EA、EB為單獨用藥所得到的抑制率，EAB為聯(lián)合用藥所得到的抑制率。當(dāng)0.85≤Q≤1.15時，兩藥聯(lián)用表現(xiàn)為簡單的相加作用；當(dāng)Qgt;1.15時，聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用；當(dāng)Qlt;0.85時，聯(lián)合用藥表現(xiàn)為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài) 細(xì)胞在未經(jīng)藥物處理之前，呈長梭形貼壁生長。24 h后草果揮發(fā)油組、環(huán)磷酰胺組的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，數(shù)目減少，部分細(xì)胞呈球形，大小不等；24 h后聯(lián)合組的細(xì)胞數(shù)目劇減，細(xì)胞脫壁成懸浮狀，可見較多碎片及死亡細(xì)胞。

2.2 各組細(xì)胞生長抑制率比較 草果揮發(fā)油和環(huán)磷酰胺能在一定程度上抑制細(xì)胞增殖，且呈濃度依賴性。草果揮發(fā)油組10、20、30 、40 μg/mL草果揮發(fā)油處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長抑制率分別為6.3%±1.1%、22.8%±1.8%、35.0%±2.1%、41.0%±3.4%，與對照組比較,P均lt;0.05。環(huán)磷酰胺組10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長抑制率分別為5.5%±0.9%、7.0%±1.2%、7.6%±0.8%、8.2%±1.0%、12.1%±1.6%，不同濃度間細(xì)胞生長抑制率與對照組比較,P均lt;0.05。聯(lián)合組10 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理后細(xì)胞生長抑制率分別為14.7%±0.7%、19.5%±1.2%、27.1%±1.5%、30.7%±2.1%、42.6%±2.4%，與草果揮發(fā)油組10 μg/mL草果揮發(fā)油作用后的細(xì)胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯(lián)合組20 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長抑制率分別為25.2%±1.4%、27.2%±1.0%、33.6%±2.1%、39.4%±1.8%、54.2%±2.6%，40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺聯(lián)合作用后與草果揮發(fā)油組20 μg/mL草果揮發(fā)油作用后的細(xì)胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯(lián)合組30 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長抑制率分別為34.2%±2.2%、36.7%±1.8%、43.5%±1.9%、50.2%±2.2%、54.9%±2.8%，60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺聯(lián)合作用后與草果揮發(fā)油組30 μg/mL草果揮發(fā)油作用后的細(xì)胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。聯(lián)合組40 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后細(xì)胞生長抑制率分別為46.3%±1.6%、48.9%±1.9%、51.2%±2.2%、51.7%±1.9%、55.7%±3.0%，與草果揮發(fā)油組40 μg/mL草果揮發(fā)油作用后的細(xì)胞生長抑制率比較，P均gt;0.05。聯(lián)合組與不同劑量環(huán)磷酰胺組細(xì)胞生長抑制率比較，P均lt;0.05。

2.3 不同濃度的草果揮發(fā)油與不同濃度的環(huán)磷酰胺作用于HepG2細(xì)胞的Q值 聯(lián)合組10 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后Q值分別為1.29、1.52、2.02、2.20、2.41，聯(lián)合組20 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后Q值分別為0.93、0.97、1.17、1.36、1.69，聯(lián)合組30 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后Q值分別為0.85、0.88、1.02、1.16、1.17，合組40 μg/mL草果揮發(fā)油與10 、20 、40、60 、80 μg/mL環(huán)磷酰胺處理HepG2細(xì)胞后Q值分別為1.05、1.08、1.13、1.13、1.16。

3 討論

肝癌是一種臨床常見的耐藥惡性腫瘤[10]，在我國發(fā)病率居惡性腫瘤第3位，病死率居第2位[11]。目前化療是肝癌的主要治療手段，近年來醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展使其治療效果不斷提高，但肝癌的病死率仍居高不下；而環(huán)磷酰胺是目前常用的肝癌化療藥物，但因其不良反應(yīng)及耐藥性，臨床上用量和療效受限，因此尋求高效低毒的藥物及聯(lián)用藥物對降低不良反應(yīng)和耐藥性，提高臨床療效有重要意義。

草果揮發(fā)油是從姜科豆蔻屬多年生藥食同源植物草果的干燥果實中提取出的有效組分，主要由1,8-桉葉素、α-蒎烯、β-蒎烯、乙酸香葉酯等單萜、倍半萜及其氧化物組成，在抗氧化、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗菌、抗腫瘤及改變藥物通透性等方面發(fā)揮作用[1]。

本課題組前期研究已證實草果揮發(fā)油在體內(nèi)外具有良好的抗肝癌活性，且毒性極低[3，4]。本實驗結(jié)果顯示草果揮發(fā)油和環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥比單用環(huán)磷酰胺對HepG2細(xì)胞生長的抑制作用更加明顯，兩者合用表現(xiàn)出化療協(xié)同或相加作用，無拮抗，且兩者在低濃度下便可達(dá)到理想的抗腫瘤效果，提示草果揮發(fā)油可以提高HepG2細(xì)胞對環(huán)磷酰胺的敏感性。此為草果揮發(fā)油抗腫瘤應(yīng)用開發(fā)提供了更多的實驗依據(jù)和途徑，亦為腫瘤的臨床聯(lián)合治療拓展了思路。但本研究僅局限于體外試驗，其聯(lián)合抑制HepG2細(xì)胞增殖的機制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.41.009

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國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項目(81560574)；廣西自然科學(xué)基金青年基金項目(2011GXNSFB018087, 2014GXNSFAA118235)；廣西教育廳項目(201010LX341)。

楊揚(E-mail:35112908@qq.com)

2017-04-20)