胡 葉 楊 萌 周 琴 王毛毛 齊 慧 左明煥

·基礎研究·

結(jié)腸癌血性腹腔積液動物模型的建立

胡 葉 楊 萌 周 琴 王毛毛 齊 慧 左明煥

目的 建立結(jié)腸癌血性腹腔積液的動物模型，用于惡性腹腔積液防治的實驗研究。方法 以BALB/c雌性裸鼠為實驗對象，采用脾臟注射細胞數(shù)為5×106/ml的人結(jié)腸癌SW480細胞懸液100 μl，觀察裸鼠腹腔積液產(chǎn)生情況、腹腔瘤體制作病理標本檢測。結(jié)果 11只小鼠15天存活率為100%，30天存活率為72.72%(8/11)，出現(xiàn)腹腔積液率為100%，肉眼觀察腹腔積液呈暗紅色，質(zhì)渾濁。病理結(jié)果示腹膜轉(zhuǎn)移瘤細胞符合低分化腺癌的特征，檢測腹腔積液中紅細胞數(shù)進一步證明為血性腹腔積液。結(jié)論 經(jīng)脾臟接種人結(jié)腸癌SW480細胞可成功建立結(jié)腸癌血性腹腔積液的動物模型，具有操作簡單、可控性強、存活率高等特點，是研究結(jié)腸癌血性腹腔積液的理想動物模型。

血性腹水；結(jié)腸癌；動物模型

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:175～177)

結(jié)腸癌(colon cancer)是當前較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一。近年來其發(fā)病率呈明顯上升趨勢。結(jié)腸癌血性腹腔積液(colonic bloody ascites)患者多處于結(jié)腸癌晚期，臨床上不僅表現(xiàn)原發(fā)病的癥狀、體征及惡病質(zhì)，更為嚴峻的是因腹腔積液的迅速增長、腹腔壓力增高從而引起腹脹腹痛、食欲下降、惡心嘔吐，甚至導致呼吸困難等，嚴重降低了患者的生活質(zhì)量，同時更延誤了積極的治療機會，甚至會引起營養(yǎng)匱乏、病情惡化，使生存期明顯縮短[1]。由于結(jié)腸癌血性腹腔積液發(fā)病機理復雜，臨床療效欠佳，故需建立穩(wěn)定、可行的結(jié)腸癌血性腹腔積液動物模型以明確結(jié)腸癌血性腹腔積液的產(chǎn)生機理，提高結(jié)腸癌血性腹腔積液的臨床療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性BALB/c裸鼠11只，鼠齡6～8周，體重 20～25 g，潔凈度SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2009-0004]。分籠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)內(nèi)，室溫控制在(25 ℃±1 ℃)，相對濕度40%～50%。

1.2 腫瘤細胞

人結(jié)腸癌SW480細胞株購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清及含青霉素、硫酸鏈霉素的L-15培養(yǎng)液中。

1.3 腫瘤細胞懸液的制備

將SW480細胞培養(yǎng)于含體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMES營養(yǎng)液L-15培養(yǎng)液(含青霉素100×103U/L和鏈霉素100 mg/L)中，置于37 ℃、含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。該細胞呈貼壁生長，取指數(shù)生長期的細胞，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3～1∶5擴培，細胞長至對數(shù)生長期，機械吹打成細胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加適量生理鹽水調(diào)整細胞濃度至5×107/ml，以臺盼藍測定細胞活力在95%以上。

1.4 SW480細胞脾臟內(nèi)接種建立模型

用1%戊巴比妥鈉0.15～0.20 ml(50 mg/kg)對11只BALB/c雌性裸鼠腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后，固定小鼠呈仰臥位，于左腹中部、左側(cè)腋前線與腋中線間，取5 mm切口進腹，逐層剝離找到柳葉狀脾臟，小心顯露脾臟，使脾上極托于切口外，用0.3 ml注射器31G針頭從脾上極進針約6 mm，進針方向與脾臟長軸平行，將腫瘤細胞懸液注入至脾被膜下，緩慢注入細胞濃度為5×107/ml的SW480細胞懸液100 μl，可見注射部位的脾被膜發(fā)白、腫脹，待白色腫脹被膜消退后拔出針頭，壓迫止血約數(shù)秒，查無出血，把脾臟回納入腹腔內(nèi)。單層、間斷縫合腹壁切口，關(guān)腹。

1.5 觀測指標

術(shù)后裸鼠常規(guī)喂養(yǎng)，每日觀察裸鼠的攝食、進水、活動等情況。每天早晨9點測量并記錄小鼠體重、腹圍(腹圍測量標準為仰臥位兩側(cè)髂骨上緣連線繞腹部一周)。所有死亡小鼠均經(jīng)剖腹收集腹腔積液，檢測腹腔積液中紅細胞計數(shù)，觀察腹腔內(nèi)腫瘤生長情況，剝離腹膜組織，用于腹膜轉(zhuǎn)移瘤組織病理學觀察。

2 結(jié)果

2.1 大體觀察

小鼠接種初期活躍如常，體形無改變。7天后小鼠左側(cè)腹部隱約可見膨大。15天小鼠腹部漸膨隆，行動漸遲緩，精神較前差，攝食量減少；麻醉2只小鼠后用剪刀延腹正中線剖開腹部皮膚約1 cm，不傷及皮膚下層筋膜，觀察腹腔可見少量液體生成。接種后第25天可見小鼠腹部膨隆，剪開2只小鼠腹腔皮膚，不傷及皮膚下層筋膜，可見腹腔內(nèi)血性液體，第28天2只小鼠死亡，第29天1只死亡，第30天處死其余小鼠，30天存活率為72.72%(8/11)，11只小鼠平均生存期為29.55天。

2.2 解剖發(fā)現(xiàn)

腹腔積液：1只于第29日夜間死亡無法采集腹腔積液，肉眼可見腹腔內(nèi)有血性液體凝集塊。其余10只均有腹腔積液產(chǎn)生，肉眼觀察呈暗紅色，質(zhì)渾濁，量不等。平均腹腔積液量為(177.27±210.19)μl。腹腔積液中紅細胞計數(shù)平均值為(1.67±1.56)×109/L。

瘤灶：解剖后可見脾臟上較大瘤灶，直徑為0.3～0.5 cm，肝臟表面可見灰白色轉(zhuǎn)移灶彌散分布，腹膜及腸系膜轉(zhuǎn)移瘤散在分布，轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)融合成塊，數(shù)目有個體差異。

2.3 病理觀察

對腹腔轉(zhuǎn)移瘤HE染色，鏡下觀察見癌細胞聚積成團，癌細胞分化差，異型性明顯，細胞呈梭形，胞質(zhì)少，核大、深染且不規(guī)則，核仁明顯，核分裂像易見。瘤組織內(nèi)血管豐富，多處部位可見腫瘤明顯侵襲小血管和淋巴管，形成眾多癌栓，呈明顯浸潤性生長，腫瘤侵襲直至黏膜下層。11只裸鼠均見壁層腹膜轉(zhuǎn)移。

3 討論

3.1 實驗動物與細胞株的選擇

移植性腫瘤動物模型是目前腫瘤藥物研究中應用最為廣泛的動物模型,是將源于人或動物的腫瘤細胞或組織移植到動物體內(nèi)而形成腫瘤動物模型的方法。按動物種類可分為裸鼠、大鼠、小鼠等；按照細胞來源可分為人癌細胞和動物癌細胞。動物結(jié)腸癌細胞研究結(jié)果不一定能對臨床進行有效預測，且目前可知的鼠結(jié)腸癌癌細胞系較少，故該細胞較少選用。移植性腫瘤動物模型主要包括同種移植(動物之間)和異種移植(人與動物之間)兩種[2]。異種移植結(jié)腸癌動物模型是將人源結(jié)腸癌細胞株或結(jié)腸癌組織塊直接移植到免疫缺陷型小鼠而建立的模型。該模型建模方法簡單，易觀察，成瘤率高，建模周期短，模型穩(wěn)定，并能較好地反應腫瘤的侵襲性、生長情況、藥物敏感性等，因而成為常用的結(jié)腸癌動物模型[3-4]?；谝陨侠碚摚覀冞x用人結(jié)腸癌SW480細胞和裸鼠進行模型設計。

3.2 腹腔積液性質(zhì)的確定

小鼠的腹壁均可見腹膜轉(zhuǎn)移瘤，病理結(jié)果提示腹膜轉(zhuǎn)移瘤細胞符合低分化腺癌的特征，說明腹腔積液的形成與腹壁轉(zhuǎn)移瘤密切相關(guān)。在預實驗中，我們曾將腹腔中抽取到的血性腹腔積液直接接種在正常小鼠腹腔內(nèi)，14天后該小鼠同樣產(chǎn)生血性腹腔積液，顏色、性狀等同所接種腹腔積液一致，可見腹腔積液中存在腫瘤細胞。綜上所述，可以確定實驗小鼠腹腔內(nèi)的血性腹腔積液為惡性腹腔積液。同時，實驗裸鼠的腹腔積液中紅細胞計數(shù)平均值為(1.67±1.56)×109/L，明顯低于正常6周SPF級BALB/c雌性小鼠靜脈血中紅細胞數(shù)量(5.11±0.93)×109/L[5]。可見小鼠腹腔中液體并非腹腔內(nèi)血管破裂，血液直接流入腹腔所致；而是由于腹腔內(nèi)血管滲透壓改變，血管內(nèi)物質(zhì)外滲入腹腔所致，符合腹腔積液的產(chǎn)生機制，故該液體性質(zhì)為血性腹腔積液。

3.3 脾臟注射方法建立穩(wěn)定的有應用價值的血性腹腔積液模型

惡性腹腔積液常發(fā)生在惡性腫瘤晚期，其治療方法主要為引流胸腹腔積液、全身或局部化療、糾正低蛋白血癥等。對惡性腹腔積液的認識和治療研究相對較少，國內(nèi)外文獻中均罕見惡性腹腔積液動物模型的報道，而在惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移模型的文獻中發(fā)現(xiàn)關(guān)于惡性腹腔積液產(chǎn)生的記錄[6-10]，其中Nano[7]、許勤等[10]在通過脾臟接種法分別制作大鼠和小鼠結(jié)腸癌細胞肝轉(zhuǎn)移模型的實驗中均提及實驗動物腹腔內(nèi)可見體積不均等的血性腹腔積液。脾臟為免疫器官，對腫瘤的轉(zhuǎn)移起到了篩選作用，而直接脾臟注射的腫瘤細胞更容易逃逸大量活化的、能分泌腫瘤壞死因子(TNF)的吞噬細胞及自然殺傷細胞的攻擊，提高自身血行轉(zhuǎn)移能力[11-12]；與此同時，脾臟內(nèi)的腫瘤細胞隨血液進入肝臟，隨肝臟血流進入腹腔，形成腹膜轉(zhuǎn)移瘤，促進惡性腹腔積液生成。脾臟接種法能較好的模擬人結(jié)腸癌血性腹腔積液產(chǎn)生的病理過程，是1種簡單、有效、重復性好的建立模型方法。

我們曾嘗試采用多種結(jié)腸癌腫瘤細胞腹腔內(nèi)注射建立本模型，雖然人SW480細胞和鼠CT26細胞通過腹腔內(nèi)直接接種在小鼠腹腔內(nèi)成瘤性良好，但在建模30天內(nèi)均未見腹腔積液生成。采用人LOVO細胞腹腔注射時，30天內(nèi)能夠產(chǎn)生少量白色半透明腹腔積液，但未見血性腹腔積液生成。多次實驗發(fā)現(xiàn)，在SW480細胞脾臟接種建立的結(jié)腸癌血性腹腔積液模型中，血性腹腔積液生成率可達100%，并且荷瘤小鼠平均生存期大于29.55天，明顯長于許勤等[10]報道的18.2±1.8天。這一特點使得SW480結(jié)腸癌血性腹腔積液模型能為包括藥物治療，生物治療在內(nèi)的各種臨床前實驗提供較長的治療窗口期。雖然，本次實驗樣本量較小，腹腔積液生成量的不均一等問題也有待于進一步研究并加以解決，但這一穩(wěn)定的結(jié)腸癌血性腹腔積液動物模型仍不失為研究結(jié)腸癌血性腹腔積液的病理機制和藥物干預效果的重要工具。

[1] 袁 莉,孫 韜,周 琴,等.華蟾素注射液腹腔灌注治療惡性腹水腹水102 例的臨床觀察〔J〕.中國醫(yī)藥導報,2014,11(22):54-59.

[2] 秦 川.實驗動物學〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社,2010:191-192.

[3] Jin K,Teng L,Shen Y,et al.Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice:a systematic review〔J〕.Clin Transl Oncol,2010,12(7):473-480.

[4] Rubio-Viqueira B,Hidalgo M.Direct in vivo xenograft tum- or model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients〔J〕.Clin Pharmacol Ther,2009,85(2):217-221.

[5] 陸春麗,黃小瓊,鄺少松,等.SPF級BALB/C小鼠血常規(guī)值的測定及性別和年齡對其影響的研究〔A〕.見:第六屆中南地區(qū)實驗動物科技交流會論文匯編〔C〕.北京:中國實驗動物學會,2006:225-229.

[6] Ishizu K,Sunose N,Yamazaki K,et al.Development and c- haracterization of a model of liver metastasis using human colon cancer HCT-116 cells〔J〕.Biol Pharm Bull,2007,30(9):1779-1783.

[7] Nano R,Barni S,Chiari P,et al.Efficacy of boron neutron capture therapy on liver metastases of colon adenocarcinoma:optical and ultrastructural study in the rat.〔J〕.Oncol Rep,2004,11(1):149-153.

[8] Rajput A,Martin I DS,Rose R,et al.Characterization of HCT116 human colon cancer cells in an orthotopic model〔J〕.J Surg Res,2008,147(2):276-281.

[9] Thalheimer A,Otto C,Bueter M,et al.The intraportal injection model:a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer〔J〕.BMC Cancer,2009,9(29):1-7.

[10] 許 勤,吳文溪,馬利民,等.小鼠結(jié)腸腺癌肝轉(zhuǎn)移模型的建立〔J〕.實用癌癥雜志,2000,15(5):456-457.

[11] 楊劍鋒,張 森,高 楓,等.結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的建立〔J〕.結(jié)直腸肛門外科,2009,15(3):139-143.

[12] Bouvet M,Tsuji K,Yang M,et al.In vivo color-coded imaging of the interaction of colon cancer cells and splenocytes in the formation of liver metastases〔J〕.Cancer Res,2007,66(23):11293-11297.

(編輯：吳小紅)

Establishment of a New Animal Model for Colon Cancer with Bloody Ascites

HUYe,YANGMeng,ZHOUQin,etal.

DongfangHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing,100078

Objective To establish a mice model of colonic bloody ascites for the experimental studies of prevention and treatment of malignant ascites.Methods BALB/c female mice were injected with 5×106human SW480 cells into the spleen.The quality and quantity of ascites in nude mice were observed as well as abdominal tumor pathological samples were tested.Results 11 mice 15-day survival rate was 100%,while 30-day was 72.72%(8/11).The ascites turned 100% in generation rate,with visually dark red,muddy quality.Pathology results indicated that tumor cells conformed to the characteristics of low differentiated adenocarcinoma and erythrocyte count of the ascites manifested the malignant and bloody property of ascites.Conclusion The model of human carcinomatosis bloody ascites in nude mice by spleen inoculation of SW480 is a simple,reliable,effective and strongly operational method of modeling.

Bloody ascites;Colon cancer;Animal model

國家自然科學基金項目(編號81373832)

100078 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院腫瘤科(胡 葉，周 琴，王毛毛，左明煥)；102200 安泰康生物技術(shù)(北京)有限公司(楊 萌，齊 慧)

左明煥

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.001

R735.3+5

A

1001-5930(2017)02-0175-03

2016-04-01

2016-10-13)