劉泉，柯技，王樹法

1.湖北警官學(xué)院，湖北武漢 430034；2.湖北三真司法鑒定中心，湖北武漢 430034

硅藻量化研究的法醫(yī)學(xué)探討

劉泉1,2，柯技1,2，王樹法1,2

1.湖北警官學(xué)院，湖北武漢 430034；2.湖北三真司法鑒定中心，湖北武漢 430034

硅藻量化研究有助于提高硅藻判斷生前溺死的準(zhǔn)確性。全文通過分析了幾種硅藻的常用檢驗(yàn)方法、消化方式、富集方式的優(yōu)缺點(diǎn)，探討了硅藻量化的最佳檢驗(yàn)方法和步驟；同時(shí)，還探討了影響硅藻數(shù)量的環(huán)境因素問題，并針對(duì)這些問題提出了相應(yīng)的解決對(duì)策，為硅藻量化研究檢驗(yàn)條件的優(yōu)化提出了自己的見解。

硅藻；量化；溺死；法醫(yī)學(xué)

硅藻是一種廣泛存在于各種水域中的單細(xì)胞生物，自1904年首次被人在溺死尸體肺組織內(nèi)檢出后，逐漸成為溺死死亡診斷的重要手段[1]。有人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，非溺死者的內(nèi)臟中也有硅藻，從而對(duì)硅藻診斷溺死提出異議[2]。但大量實(shí)驗(yàn)表明，非溺死者與溺死者內(nèi)臟硅藻數(shù)量存在顯著差異[3-4]，所以目前硅藻的檢驗(yàn)仍不失為一種鑒別生前溺死與其它死因的有效手段。在實(shí)際工作中，依靠硅藻診斷生前溺死需結(jié)合案情及尸體檢驗(yàn)情況，但水中尸體常常高度腐敗，這類案件又可能因種種原因無法得到有效的案情，這就導(dǎo)致需要單純依靠內(nèi)臟里的硅藻來判斷是否為生前溺死。那么內(nèi)臟中硅藻應(yīng)達(dá)到多少量，才能區(qū)別生前溺死與死后拋尸呢？硅藻的量化研究就是為了解決這一難題。目前有關(guān)這方面的研究已成為熱點(diǎn)，筆者所在課題組在這方面也有了初步的實(shí)踐。該文將對(duì)硅藻量化中涉及的硅藻檢驗(yàn)方法的選擇和硅藻量化影響因素等方面進(jìn)行初步的探討，以期為硅藻量化研究的法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)提出自己的建議。

1 硅藻的特點(diǎn)

硅藻無處不在，地球上凡是有水滯留的地方，幾乎都能見到硅藻的蹤跡。在顯微鏡下，硅藻是一種單細(xì)胞藻類，約有170個(gè)屬5 500個(gè)物種。根據(jù)硅藻的形態(tài)，可以分為中心目硅藻和羽紋目硅藻。中心目硅藻大多分布于海洋中，殼面紋飾主要呈輻射狀排列；羽紋目硅藻大多數(shù)分布于淡水中，殼面紋飾主要呈左右對(duì)稱排列。硅藻體積非常小，直徑約從1～200 μm，因此部分硅藻可隨溺液進(jìn)入體內(nèi)，分布到全身各個(gè)器官。硅藻的結(jié)構(gòu)具有特征性，除了少數(shù)的種類外，硅藻的細(xì)胞結(jié)構(gòu)有兩大特點(diǎn)，一個(gè)是細(xì)胞壁由兩個(gè)似培養(yǎng)皿的半壁套合而成；另一個(gè)是細(xì)胞壁的成分高度硅質(zhì)化，并形成有物種特征性的各種紋路[5]。硅藻細(xì)胞壁的主要成分是果膠質(zhì)和硅質(zhì)，果膠質(zhì)位于內(nèi)層，硅質(zhì)位于外層。它的細(xì)胞壁硅質(zhì)成分與法醫(yī)息息相關(guān)，由于其主要是SiO2，不易受到外界因素的影響而破壞，因此可以在尸體中長期保存。這些特征使得硅藻對(duì)于晚期尸體生前溺水的診斷具有重要意義。

2 硅藻量化檢驗(yàn)方法類別的選擇

目前，用于硅藻檢驗(yàn)的方法很多，這些檢驗(yàn)方法綜合起來大致分為3類：通過形態(tài)特征來識(shí)別硅藻的檢驗(yàn)方法；通過特征性DNA片段來識(shí)別硅藻的檢驗(yàn)方法；通過化學(xué)成分來識(shí)別硅藻的檢驗(yàn)方法。這些方法都可以對(duì)硅藻進(jìn)行定性檢測，準(zhǔn)確性已被大家公認(rèn)。但要做硅藻的量化的檢驗(yàn)，不僅要識(shí)別硅藻，還要能計(jì)數(shù)，即需要對(duì)檢出的硅藻進(jìn)行適度的定量，那么以上的方法就不全適用了。計(jì)數(shù)方式可以有相對(duì)計(jì)數(shù)或絕對(duì)計(jì)數(shù)。相對(duì)計(jì)數(shù)是指通過實(shí)際檢測結(jié)果與理論值按百分比做的結(jié)果。在硅藻檢驗(yàn)中，相對(duì)計(jì)數(shù)是實(shí)驗(yàn)人員通過將檢測到硅藻的某個(gè)值與一個(gè)基本值作百分比而得出的結(jié)果。觀察形態(tài)來計(jì)個(gè)數(shù)、測DNA的含量和測化學(xué)成分的含量等檢驗(yàn)方法在理論上均可采用相對(duì)計(jì)數(shù)法。但實(shí)際操作中實(shí)施起來卻有很多問題。首先，各種方法的基本值（即死后拋尸的人體內(nèi)硅藻含量）是很難確定的。有些也許有少量生前吸入的硅藻，但更多的是沒有硅藻。當(dāng)基本值為0時(shí)，無法百分比化。其次，測DNA含量或化學(xué)成分的含量受很多實(shí)驗(yàn)操作方面的影響，比如PCR的內(nèi)環(huán)境，循環(huán)次數(shù)等，這樣就會(huì)造成同一樣品多次檢測結(jié)果之間存在差異的情況，穩(wěn)定性較差。絕對(duì)計(jì)數(shù)是指按照實(shí)際看到的結(jié)果來計(jì)數(shù)。在硅藻檢驗(yàn)中，絕對(duì)計(jì)數(shù)是指實(shí)驗(yàn)人員看到了多少個(gè)硅藻就是多少個(gè)，這種方式簡單易行，但只適用于通過硅藻形態(tài)特征來識(shí)別的檢驗(yàn)方法。通過DNA片段或化學(xué)成分來識(shí)別的檢驗(yàn)方法，是間接識(shí)別，不能看到硅藻的形態(tài)，只能通過設(shè)備上的數(shù)字來分析讀取，因此無法使用絕對(duì)計(jì)數(shù)法。另外，直接識(shí)別硅藻形態(tài)進(jìn)行計(jì)數(shù)還可以方便的對(duì)不同類型的硅藻進(jìn)行分類，有助于落水地點(diǎn)的判斷。因此，通過硅藻形態(tài)特征來識(shí)別的檢驗(yàn)方法更適合用于硅藻量化研究的檢驗(yàn)，它能對(duì)看到的硅藻直接計(jì)數(shù)，有助于硅藻量化研究的開展。

3 通過形態(tài)特征識(shí)別硅藻的檢驗(yàn)方法有關(guān)步驟的選擇

3.1 幾種消化方式的比較

通過形態(tài)特征來識(shí)別硅藻的第一步是將硅藻從內(nèi)臟中提取出來。通常采取的方法是將可能存有硅藻的器官組織破壞，富集其中的硅藻。目前常用的方法有以下幾種：強(qiáng)酸消化法、酶消化法、物理消化法和多方法聯(lián)用。強(qiáng)酸消化法是指使用濃酸破除有機(jī)質(zhì)，從而保留硅藻形態(tài)的消化方法。該方法有成本低、消化時(shí)間短、消化完全、便于開展等優(yōu)點(diǎn)，目前為基層普遍采取的一種方式。盡管傳統(tǒng)認(rèn)為由于硅藻細(xì)胞壁有硅質(zhì)，能抵御強(qiáng)酸的腐蝕，但在實(shí)踐中有人發(fā)現(xiàn)通過強(qiáng)酸消化最后檢測到的多是一些耐酸性的無機(jī)硅藻，而其他類型硅藻則被破壞[6]。為了提高檢出率，有些法醫(yī)工作者對(duì)基于強(qiáng)酸消化的方法進(jìn)行了改良，主要通過減少強(qiáng)酸的用量和消化時(shí)間，增加其它類型的消化方式，以此來保留對(duì)酸較敏感的硅藻類型。但其依然有使用局限性：①使用酸，依然會(huì)破壞部分硅藻；②強(qiáng)酸在消化中可能會(huì)噴出，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生污染氣體，對(duì)人和環(huán)境造成損害；③操作繁瑣，容易污染，產(chǎn)生假陽性。酶消化法是指使用蛋白酶對(duì)組織進(jìn)行消化。目前常用的蛋白酶有蛋白酶K和胰蛋白酶等。有實(shí)驗(yàn)顯示蛋白酶K消化后能顯示出絕大多數(shù)的硅藻，且硅藻結(jié)構(gòu)幾乎都被保持。梁新華等[7]發(fā)現(xiàn)通過胰蛋白酶消化后，硅藻檢出率大于強(qiáng)酸消化法。從現(xiàn)有報(bào)道可以看出，蛋白酶消化法對(duì)硅藻的檢出率優(yōu)于強(qiáng)酸消化法，且操作簡便，更加安全。但蛋白酶消化法也有缺點(diǎn)，如成本相對(duì)較高、消化組織時(shí)間相對(duì)較長。物理消化法主要有高溫灰化法和浸漬法。高溫灰化法是將組織用特殊的東西加熱直至呈灰，然后再用強(qiáng)酸消解后過濾鏡檢。它的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、干擾少。但該方法過程繁瑣，灰化過程需要特殊設(shè)備，灰化溫度和時(shí)間較難控制，如操作不當(dāng)易造成大量硅藻被破壞，檢出率低。浸漬法是將組織用蒸餾水浸漬過夜，或用硝酸鈉處理后在37℃溫箱中浸漬24 h左右，然后取浸漬液離心鏡檢。此法基本是所有檢測方法里最簡單易行的，但檢出率卻不高。每一種消化方式都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，如果結(jié)合各自的特點(diǎn)，將不同類型的消化方式聯(lián)合起來使用，就可以提高硅藻的檢出率。如使用濃硝酸消解檢材組織時(shí)，同時(shí)還在密閉的空間內(nèi)用微波對(duì)組織加熱加壓，檢驗(yàn)效果較好。整個(gè)過程有用酸量少，時(shí)間短，硅藻種類、數(shù)量和完整性均保存較好的特點(diǎn)。強(qiáng)酸消化法除了可以與物理消化法聯(lián)用，還可以與酶消化法聯(lián)用。Kakizaki等[8]應(yīng)用蛋白酶K和鹽酸共同消解組織，發(fā)現(xiàn)這種方法組織需要量較傳統(tǒng)方法少，時(shí)間較單純蛋白酶消化法短，硅藻破壞較少，對(duì)環(huán)境污染更小。硅藻量化研究需要的消化方式能盡量完整的保存硅藻，這樣計(jì)算出來的硅藻數(shù)量才能更接近實(shí)際情況。從現(xiàn)有消化方式來看，酸消化法和物理消化法會(huì)對(duì)硅藻的破壞或損耗較大，而其他方式相對(duì)來說更利于硅藻數(shù)量和結(jié)構(gòu)的保存，更適用于硅藻量化的研究。

3.2 幾種富集方式的比較

通過各種方式將可能含有硅藻的組織消化后，通常會(huì)使用普通離心機(jī)離心消化液的方式來使硅藻富集于沉淀中，便于鋪片鏡檢。王會(huì)品等[9]研究發(fā)現(xiàn)4 000 r/min離心15 min一次硅藻損失在29.94%～49.60%之間，大量的硅藻存在于被棄去的上清液中，而很多消化法為了清洗消化液離心次數(shù)往往不止一次，造成硅藻檢出率進(jìn)一步下降。廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所通過研究發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)離心方法被棄去的上清中硅藻的最長徑＜40 um的硅藻占被棄硅藻的90.00%以上，而進(jìn)入體循環(huán)的硅藻多是小體積硅藻，如進(jìn)入腦和骨髓中的硅藻大多直徑在10 μm以下，因此離心富集硅藻對(duì)體內(nèi)硅藻檢驗(yàn)極其不利。王玉仲等人[10]用濾膜孔徑為0.45 μm的濾膜對(duì)微波消解消化過的硅藻進(jìn)行富集，然后檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)硅藻檢出率顯著優(yōu)于傳統(tǒng)強(qiáng)酸檢測方法。從王玉仲等人使用濾膜的指標(biāo)來看，我們可以推測這種濾膜富集法可以富集大多數(shù)長徑在40 μm以下的硅藻，富集率應(yīng)該優(yōu)于傳統(tǒng)離心方法。

4 影響硅藻量化的因素

影響硅藻量化的因素除了消化、富集的方法以外，主要還有取材及環(huán)境因素。目前，硅藻檢驗(yàn)取材有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)參考，因此在這里，主要討論環(huán)境因素對(duì)硅藻量化檢驗(yàn)的影響，它會(huì)直接影響到硅藻量化的結(jié)果與結(jié)果的判定。

4.1 環(huán)境因素對(duì)硅藻數(shù)量與種類的影響

4.1.1 光照 硅藻同一般藻類一樣，需要依靠光能進(jìn)行光合作用產(chǎn)生自身所需的有機(jī)物。光線的強(qiáng)度和光周期的變化會(huì)直接影響硅藻的生存和生長。一般來說，在其它條件適宜的情況下，適宜的光照強(qiáng)度會(huì)使得適合該光照強(qiáng)度的硅藻生長最快。例如尖刺擬菱形藻在光照度在7 000 lx時(shí)生長速率達(dá)到最大，而東方彎桿藻和月形藻適宜的光照度在500～1 500 lx的范圍。有的硅藻適宜的光照強(qiáng)度不是一定的，它會(huì)隨著溫度的變化而變化，如中肋骨條藻，在溫度較低時(shí)低光照強(qiáng)度繁殖最快，而溫度較高時(shí)，高光照強(qiáng)度比低光照強(qiáng)度繁殖的速度更快。光周期是指光照與非光照相互相互變化的規(guī)律。它會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物的合成和代謝及細(xì)胞分裂模式。

4.1.2 溫度 硅藻生長需要一個(gè)適宜的溫度，在適宜溫度范圍內(nèi)硅藻生長速度最快，超過或低于這個(gè)溫度，硅藻都無法正常生長。絕大多數(shù)硅藻適宜溫度范圍在15～30℃，硅藻水華暴發(fā)時(shí)水體表面大都在20～30℃間[11]。在適宜溫度范圍內(nèi)，溫度越高，硅藻生長速率越快。超過一定溫度后，硅藻的蛋白質(zhì)和核酸會(huì)受到不可逆的影響，從而生長速率急劇下降。當(dāng)?shù)陀谝欢囟葧r(shí)，硅藻的新陳代謝會(huì)受到抑制，生長速度變慢，但不一定死亡，可能存在“冬眠”狀況，等待溫度合適繼續(xù)生長。

4.1.3 水體的流動(dòng)或攪動(dòng) 空氣中的CO2會(huì)隨著水體的流動(dòng)或攪動(dòng)進(jìn)入到水體中，為硅藻提供光合作用必需的物質(zhì)——CO2。一般來講，水體的流動(dòng)或攪動(dòng)越大，二氧化碳含量越多，越有利于硅藻的生長。同時(shí)，水體的運(yùn)動(dòng)也可帶走硅藻的代謝產(chǎn)物，使得硅藻周圍的水體維持在一個(gè)適宜的水平。另外，水體的流動(dòng)或攪動(dòng)可能會(huì)把位于水體下層的硅藻移動(dòng)到中上層中，從而使硅藻多樣性指數(shù)上升。在泥沙較多的水域，水體的流動(dòng)或攪動(dòng)會(huì)使泥沙含量升高，水體透明度降低，降低光進(jìn)入水中的強(qiáng)度，從而影響硅藻的生長。

4.1.4 其他 水中pH值、鹽度和污染情況[12]也都會(huì)不同程度的影響到不同種類硅藻的生長與繁殖。

4.2 環(huán)境因素對(duì)硅藻量化影響的對(duì)策

由于以上環(huán)境變化因素的存在，法醫(yī)檢案提取檢材時(shí)，如果只提取發(fā)現(xiàn)可疑溺水者水域局部范圍的水，可能會(huì)造成檢測出水樣中硅藻的種類和數(shù)量與溺死者臟器中不一致的情況。建議提取水樣前，應(yīng)綜合分析溺死者水域的情況，合理布局，有針對(duì)性的提取和分析，這樣才能保證判斷的準(zhǔn)確性。同時(shí)，鑒定人員還應(yīng)該結(jié)合尸檢的情況，將死后經(jīng)過時(shí)間考慮在內(nèi)。如果存在季節(jié)交替或溫度驟變的情況，可能會(huì)導(dǎo)致溺死者溺水當(dāng)時(shí)水域與檢查時(shí)水域中硅藻的種類和數(shù)目的差異。

因此要充分考慮以上情況，綜合判斷，才能在實(shí)際檢案中得出更加準(zhǔn)確的判斷，同時(shí)才有利于減少硅藻量化過程中的偏差。

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Study on Forensic Medicine of Quantitative Study of Diatom

LIU Quan1,2,KE Ji1,2,WANG Shu-fa1,2
1.Hubei University of Police,Wuhan,Hubei Province,430034 China；2.Hubei Sanzhen judicial expertise center,Wuhan,Hubei Province,430034 China

The quantitative study of diatom contributes to improving the judgment accuracy of drowning before one’s death,and the paper discusses the best test method and procedure of diatom quantitative study by analyzing the common test method,digestive method and advantages and disadvantages of concentration method of some diatoms,at the same time,the paper studies the environment factor issues of influencing the number of diatoms,and puts forwards the corresponding solutions according to these issues and puts forwards their own opinions of optimization of quantitative research test conditions of diatoms.

Diatom;Quantitative;Drowning;Forensic medicine

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.30

2017-01-03；

2017-01-22

湖北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目指導(dǎo)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：B2014013）。

劉泉（1982.9-），女，湖北天門人，博士，講師，研究方向：法醫(yī)學(xué)。