余杰，毛建文，徐彬

1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006

ClC-3基因敲除小鼠的構(gòu)建及鑒定

余杰1，毛建文2，徐彬1

1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院，廣東廣州 510006

目的 構(gòu)建并鑒定ClC-3基因敲除小鼠，為研究ClC-3氯通道蛋白的生物學(xué)功能提供動物模型。 方法 將從2015年9月—2016年9月選取的6只賽業(yè)生物科技有限公司 (廣州)構(gòu)建的ClC-3flox/+小鼠與2只Jackson實驗室引進的Ubc-Cre小鼠進行雜交繁殖，得到基因型為ClC-3flox/flox-Cre+及ClC-3flox/+-Cre+的小鼠。取鼠尾DNA，通過PCR法鑒定子代小鼠的基因型。結(jié)果 子代小鼠基因組DNA結(jié)果顯示在357 bp與100 bp處均有條帶，符合預(yù)期結(jié)果。 結(jié)論 該研究基于Cre/Loxp系統(tǒng)，利用loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表達 Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，成功構(gòu)建并鑒定了ClC-3基因敲除小鼠。

ClC-3；基因敲除；Cre/Loxp系統(tǒng)

課題組自 2000年開始從事 ClC-3蛋白的生物學(xué)功能研究，致力于獲得 ClC-3氯通道蛋白參與某些疾病的實驗證據(jù)。有研究表明ClC-3氯離子通道參與了細胞的轉(zhuǎn)運[1]、增殖[2-3]、遷移[4-8]、凋亡[9]等過程，另外，一些疾病的發(fā)生發(fā)展也與ClC-3有著密不可分的聯(lián)系[10-17]，例如其在腫瘤組織中高表達[18-19]，且在不同病理分級之間存在明顯差異[20]。因此，成功構(gòu)建ClC-3基因敲除小鼠，為研究ClC-3基因與某些疾病的相關(guān)性提供動物模型具有重要的意義?，F(xiàn)已有實驗室成功構(gòu)建組織特異性ClC-3敲除小鼠模型用于疾病研究，例如，腸特異性敲除ClC-3會加重炎癥性腸病[20]，心臟特異性敲除 ClC-3基因會導(dǎo)致成年鼠心肌肥厚。但目前還沒有實驗室構(gòu)建條件性ClC-3敲除小鼠，該課題組從2015年9月—2016年9月，利用6只loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和2只在全身表達 Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，成功繁育出條件性ClC-3敲除小鼠21只，為進一步研究ClC-3與某些疾病的相關(guān)性提供實驗條件。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物 Ubc-Cre工具鼠由美國Jackson實驗室引進 (Stock Number:007179，StrainName:129S.Cg-Tg(UBC-cre/ERT2)1Ejb/J，品系背景為C57BL/6J，雄性2只，基因型為雜合子(+/-)。ClC-3基因敲除小鼠委托賽業(yè)生物科技有限公司(廣州)構(gòu)建，編號為001_mClcn3_1H12,品系背景為C57BL/6J，雌雄各3只，基因型為雜合子(+/-)。同時自中山大學(xué)實驗動物中心購進野生型C57BL/6J鼠雌性15只、雄性1只用于保種擴群。

1.2 實驗材料

鼠尾基因組DNA提取試劑盒 （目錄號：CW2094）購自康為世紀有限公司，Taq酶 (DRR037S)、DNA marker DL1000(D526A)、瓊脂糖（BIOWEST）購自大連寶生物工程有限公司，EB替代物溶液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。小鼠鑒定引物由上海Invitrogen公司合成，見表1。

1.3 敲除小鼠的繁殖、信息記錄

3月齡雜合flox小鼠、Cre工具小鼠及野生型小鼠于SPF環(huán)境下飼養(yǎng)[SYXK(粵)2012-0125]，紫外2 h/d，溫度22～28℃，濕度 40%～60%，明暗循環(huán)12 h/d，自由飲食和飲水。小鼠飼料及墊料均購自廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，籠盒、墊料、飲用水均經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，進入動物房1次/d補充飼料和飲用水，觀察小鼠生長情況，墊料更換3次/周。小鼠2個月后性能力發(fā)育成熟，將其雌雄3:1同籠合養(yǎng)，定期給予滅菌葵花籽以增強其繁殖能力。雌性小鼠的妊娠期和哺乳期為3周左右，記錄其分娩時間、仔鼠數(shù)量，并于哺乳期后將小鼠與母鼠分開，雌雄分開飼養(yǎng)，待小鼠成年用于鑒定。flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）自交所得F1代有flox純合小鼠（ClC-3flox/flox）、flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）及野生型小鼠（ClC-3+/+），據(jù)孟德爾定律，概率分別為1/4、1/2、1/4。同時由flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）與Cre工具小鼠（Cre+）交配獲得雜交系F1代有flo x雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+），Cre工具小鼠（Cre+），野生型小鼠（ClC-3+/+），概率分別為1/4。最后由所得的flox純合小鼠（ClC-3flox/flox）與 flox雜合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）雜交得到flox純合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox純合小鼠（ClC-3flox/flox），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+），概率分別為1/4。其中flox純合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）即實驗所需。

1.4 小鼠的基因型鑒定

1.4.1 小鼠組織DNA的提取 將小鼠尾部組織小段 （長0.5～1.0 cm）置入1.5 mL Eppendolf管，按照TailGen DNA Kit鼠尾基因組DNA提取試劑盒 （CW2094）說明進行操作，提取DNA。

1.4.2 PCR反應(yīng) 利用ClC-3基因敲除鼠和Ubc-Cre工具鼠特異性引物(如表1)進行PCR擴增。ClC-3基因敲除鼠PCR體系總體積25 μL，分別加入Premix Taq酶12.5 μL，PCR引物各0.8 μL，模板DNA1.5 μL，ddH2O 9.4 μL。注：引物濃度為10 μM。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火60℃ 35 s，延伸72℃35 s，循環(huán)32次，72℃延伸5min，4℃保存。Ubc-Cre工具鼠PCR體系總體積12 μL，分別加入Premix Taq酶4.81 μL,目的基因及內(nèi)參引物各1.2 μL，模板DNA2 μL，ddH2O 2.79 μL。注：引物濃度為10 μM。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，退火51.7℃1 min，延伸72℃1 min，循環(huán)35次，72℃延伸2 min，4℃保存。

表1 基因型鑒定的引物信息表

1.4.3 瓊脂糖電泳及成像分析 取10 μLPCR產(chǎn)物進行3%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 小鼠繁殖情況

成年ClC-3 flox母鼠與表達Cre重組酶的母鼠成功繁殖出子代幼鼠。每只母鼠孕期為19～21 d，哺乳期18～23 d，產(chǎn)后3周離乳。每胎平均產(chǎn)6～10只幼鼠，成活率＞95%，新生小鼠呈肉色，無毛，閉眼，尾短，四肢柔弱，平均斷乳期21 d。成年小鼠成熟期：雄性10周，雌性8周，體重、活力相對C57BL/6J沒有較大差別，但繁殖能力相對弱，容易出現(xiàn)食仔、脫毛等現(xiàn)象。12個月共繁育小鼠2代/次，得到F2代小鼠39只，經(jīng)基因型鑒定，獲得flox純合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）9只，flox雜合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+）12只，flox純合小鼠 （ClC-3flox/flox）8只，flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）10只，純合小鼠比例為23%，基本符合孟德爾遺傳定律。

2.2 ClC-3基因敲除鼠鑒定結(jié)果

F2代基因敲除小鼠有 flox純合伴 Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴 Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/+-Cre+），flox純合小鼠 （ClC-3flox/flox），flox雜合小鼠（ClC-3flox/+）4種基因型。Loxp位點驗證，如圖 1所示，1、2、3、4、6號小鼠電泳條帶位于357 bp和287 bp處為雜合子；5、8號小鼠電泳條帶位于357 bp處為純合子；7號小鼠電泳條帶位于287 bp處為野生型。Cre位點驗證，如圖2所示，3、4、5、6、7號小鼠電泳條帶位于100 bp是為有Cre位點。綜上，實驗所需flox純合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/flox-Cre+）為5號，flox雜合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）為3、4、6號。

圖1 ClC-3 flox小鼠基因型鑒定結(jié)果

圖2 表達UBC-Cre重組酶的小鼠基因型的鑒定結(jié)果

2.3 小鼠生長發(fā)育情況

flox純合伴Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+），flox雜合伴Cre陽性小鼠（ClC-3flox/+-Cre+）毛色、體重、活力相對野生型C57BL/6 J整體沒有較大差別，見圖3。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，部分組織如腦、腎臟、脾臟的形態(tài)結(jié)構(gòu)，flox純合伴 Cre陽性小鼠 （ClC-3flox/flox-Cre+）相對C57BL/6J未見明顯異常，見圖4。

圖3 不同基因型小鼠形態(tài)對比

圖4 不同基因型小鼠的部分組織比較（HE，×100）

3 討論

隨著基因組學(xué)研究的深入，基因敲除技術(shù)日漸成熟，Zhen等[21]通過 RNA干擾技術(shù)成功抑制豬顆粒細胞中CEBPβ基因表達。2012年，余華等[22]利用雙臂同源重組法成功對銅綠假單胞菌內(nèi)彈性蛋白基因進行了敲除。Liu等[23]采用 TALENs技術(shù)對對果蠅染色體上的基因進行了修飾。該文所述的條件性基因敲除是利用Cre／Loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)基因打靶的方法。Cre重組酶由Cre基因編碼，可識別特異DNA序列，如Loxp位點，切掉Loxp位點之間的靶基因和一個Loxp位點，從而達到靶基因敲除的目的。通過顯微注射法把兩個同向排列的LoxP位點插入到胚胎干細胞基因組靶位點的一個或幾個重要外顯子的兩端以制備出floxed小鼠，即文中所提ClC-3flox/+鼠，基因組DNA結(jié)果顯示在357 bp處有條帶，該floxed小鼠在與表達Cre重組酶小鼠雜交之前，該目的基因表達完全正常，若floxed小鼠與組織特異性表達Cre酶的小鼠進行雜交，可以在特定的組織或細胞中敲除該基因，而該基因在其它組織或細胞表達正常，該實驗所雜交對象為全身表達Cre重組酶的Ubc-Cre工具小鼠，DNA結(jié)果顯示在100bp處有條帶，可對ClC-3進行全身敲除。

ClC-3，基因符號為CLCN3，作為ClC電壓門控性氯離子通道家族中的重要一員，對于保持膜腔內(nèi)電中性調(diào)節(jié)細胞體積有重要作用。有研究表明，心臟特異性敲除ClC-3基因，可以導(dǎo)致心肌肥大甚至心衰[24]，此外，ClC-3在胃腸道黏膜保護、血管重塑[25]、成骨細胞的礦化和骨形成過程中也起到重要作用[26-27]，也有研究表明某些基因的完全性敲除小鼠致死率極高[28]，難以進行該基因功能的相關(guān)性研究。因此，構(gòu)建全身敲除ClC-3基因的小鼠并于成年后誘導(dǎo)敲除對于進一步深入研究ClC-3的功能極為重要，該實驗構(gòu)建的敲除小鼠未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)時生長發(fā)育良好，且病理檢查未見異常，能夠用于后續(xù)實驗。根據(jù)Cre／Loxp條件性基因敲除技術(shù)原理，只有基因型為ClC-3 flox/flox-Cre+的純合小鼠于成年后經(jīng)他莫西芬誘導(dǎo)ClC-3基因完全敲除，而其他類型的小鼠體內(nèi)ClC-3基因則正常存在。例如基因型為ClC-3flox/+-Cre+的雜合子敲除小鼠仍有可能對某些細胞的功能產(chǎn)生影響。本實驗成功構(gòu)建ClC-3基因敲除純合子、雜合子小鼠用于深入研究ClC-3的結(jié)構(gòu)、功能及與某些疾病的相關(guān)性。

綜上所述，基于Cre/Loxp系統(tǒng)，利用loxp轉(zhuǎn)基因的ClC-3flox/+小鼠和在全身表達 Cre重組酶的Ubc-Cre小鼠，本實驗室成功構(gòu)建ClC-3基因全身敲除小鼠,并通過PCR技術(shù)從基因表達水平上完成了鑒定。ClC-3全身敲除小鼠在生長速度、繁殖能力等方面與野生型小鼠無明顯差異。到目前為止培育雜交子代小鼠共20多只，下一步待小鼠發(fā)育成熟后通過他莫西芬誘導(dǎo)其ClC-3全身敲除，并利用該敲除鼠，探討局部給藥誘導(dǎo)實現(xiàn)組織特異性敲除，觀察ClC-3敲除對高表達ClC-3的組織功能是否有影響。

綜述所述，條件性ClC-3基因全身敲小鼠的成功構(gòu)建，為ClC-3在組織器官生理病理的功能研究提供了良好的實驗材料基礎(chǔ)。

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Construction and Identification of ClC-3 Knockout Mouse

YU Jie1,MAO Jian-wen2,XU Bin1
1.College of Life Science and Pharmaceutical Engineering,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China；2.Academic College,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou,Guangdong Province,510006 China

Objective To construct and identify the ClC-3 knockout mouse and provide the animal model for researching the biology function of ClC-3 chloride channel protein.Methods 6 ClC-3flox/+mice constructed by the Saiye biotechnology Co.Ltd (Guangzhou)and 2 Ubc-Cre mice introduced by Jackson laboratory were selected from September 2015 to September 2016 were selected for interbreeding thus obtaining the lC-3flox/flox-Cre+and ClC-3flox/+-Cre+mice,Results The generation mice gene was identified by PCR method.The DNA results in the general mice gene group showed that there were stripes at 357 bp and 100 bp,meeting the expected results.Conclusion The paper successfully constructs and identifies the ClC-3 knockout mouse by using the loxp transgenosis ClC-3flox/+mice and Ubc-Cre mice with cre recombinase in expression of the whole body based on the Cre/Loxp system.

ClC-3;Knockout;Cre/Loxp system

R4

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2017.03.01.04

2016-12-15；

2017-01-07

國家自然科學(xué)基金：ClC-3氯通道蛋白非離子通道途徑調(diào)控膜皺褶和有絲分裂的研究（31371144）；廣東省自然科學(xué)基金：氯通道阻斷劑NPPB抑制術(shù)后腹膜粘連的研究（2016A030313741）。This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（31371144）and the?Natural Science Foundation of Guangdong Province（2016A030313741）.

余杰（1992.7-），女，湖北宜昌人，碩士，研究方向：離子通道蛋白功能及其靶向藥物篩選。

徐彬（1975.11-），女，四川眉山人，博士，教授，研究方向：離子通道蛋白功能及其靶向藥物篩選，腫瘤分子生物學(xué)與基因治療。E-mail：xubin2003@163.com。