張 靜，吳秀娟，普雄明*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

KSHV miRNA在卡波西肉瘤中的研究進(jìn)展

張 靜1，吳秀娟2，普雄明2*

(1新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科,烏魯木齊 830000;2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚科;*通訊作者,E-mail:puxiongming@126.com)

卡波西肉瘤； 卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV)； KSHV miRNA

miRNA是一類長約23個核苷酸非編碼的小分子RNA[1]。它廣泛存在于多細(xì)胞生物中[2]。miRNA通過基因轉(zhuǎn)錄后與靶mRNA3′UTR互補(bǔ)結(jié)合,使靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯[3]。它們參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、凋亡、侵襲或腫瘤血管形成[4，5],在腫瘤學(xué)、病毒學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、胚胎發(fā)育等領(lǐng)域有許多成熟研究[6]。研究表明，miRNA參與了腫瘤相關(guān)的許多重要基因的表達(dá)。一方面miRNA特異地與抑癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合,抑癌基因功能受到抑制,導(dǎo)致腫瘤發(fā)生,miRNA起到促癌基因作用;另一方面miRNA特異地與促癌基因轉(zhuǎn)錄的mRNA結(jié)合,促癌基因功能受到抑制,控制腫瘤發(fā)生,miRNA起到抑癌基因的作用。

卡波西肉瘤(KS)是血管瘤樣結(jié)構(gòu)、梭形細(xì)胞增生的惡性腫瘤[7],卡波西肉瘤相關(guān)病毒(KSHV,即人皰疹病毒8型)由Chang等[8]首先從AIDS相關(guān)型KS患者的肉瘤組織中發(fā)現(xiàn)。隨后,在各型的KS中均發(fā)現(xiàn)了KSHV的高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)KSHV是卡波西肉瘤發(fā)生的必需因素和主要因素,與KS的發(fā)生關(guān)系密切。KSHV和大多數(shù)DNA病毒同樣也編碼多條miRNA[9],KSHV miRNA可以通過沉默轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控宿主細(xì)胞的細(xì)胞周期、生存環(huán)境等不同途徑感染影響細(xì)胞的分化狀態(tài),最終導(dǎo)致KSHV誘導(dǎo)癌變的發(fā)生[10]。目前共發(fā)現(xiàn)25個KSHV編碼的miRNA,吳秀娟等[11，12]對卡波西肉瘤腫瘤及瘤旁組織行miRNA檢測后,發(fā)現(xiàn)13個KSHV編碼的miRNA顯著上調(diào),未見下調(diào)的KSHV編碼的miRNA,可見KSHV編碼的miRNA促進(jìn)了卡波西肉瘤的發(fā)生發(fā)展。KSHV miRNA很有可能成為卡波西肉瘤治療的分子靶標(biāo)。但它們的許多功能都未知,需要我們進(jìn)一步研究探索。

1 KSHV編碼的miRNA

miRNA做為一類特殊的調(diào)控分子已受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注。細(xì)胞的基因組能編碼細(xì)胞的miRNA,一些病毒也能編碼病毒的miRNA。迄今,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少有8種病毒能編碼miRNA,并在細(xì)胞內(nèi)加工成為成熟的miRNA。為了測定KSHV是否能編碼miRNA,3個研究小組的科學(xué)家用經(jīng)典的“RACE-like”克隆的方法:潛伏感染KSHV或者BC-1或者BCBL-1細(xì)胞株進(jìn)行原位cDNA克隆,建立小RNA文庫,發(fā)現(xiàn)代表11種獨(dú)特小RNA與KSHV完全配對。隨后,Grundhoff等[13]開發(fā)出新策略:計(jì)算機(jī)預(yù)測與微陣列分析相結(jié)合用來確認(rèn)病毒編碼候選miRNA,使用Northern blotting方法驗(yàn)證。用這種方法驗(yàn)證了11個之前已知的KSHV pre-miRNA,還發(fā)現(xiàn)一個在此之前沒有被檢測到的pre-miRNA,命名新的miRNA為KSHV-miR-K12-12。12條KSHV miRNA均來源于同一條稱作“passenger”的鏈,而且方向相同。因此KSHV編碼12個miRNA前體,通過經(jīng)典的miRNA生物合成途徑及不同剪接方式共產(chǎn)生25條成熟的miRNA[14],因?yàn)樗鼈冇?2個miRNA前體產(chǎn)生而成,因此命名為miRNA-K12-1到miRNA-K12-12(如kshv-miR-K12-4-3p、kshv-miR-K12-4-5p),簡稱為miRNA-K1到miRNA-K12。Hansen等[11]也在對Kaposics肉瘤功能性改變的研究中發(fā)現(xiàn)存在KSHV編碼miRNA。

2 KSHV miRNA的表達(dá)及功能

2.1 KSHV miRNA在潛伏期和裂解期的表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)KSHV編碼的有些miRNA會在病毒潛伏期持續(xù)表達(dá),如我們發(fā)現(xiàn)miR-K12-11在轉(zhuǎn)錄后下調(diào)天然免疫通路中IKKε的表達(dá),阻斷IKKε介導(dǎo)的IRF3/7磷酸化,部分抑制Ⅰ型干擾素通路的激活用來逃避宿主細(xì)胞抗病毒的天然免疫作用,穩(wěn)定KSHV的潛伏感染,因此miR-K12-11在KSHV潛伏感染期可能發(fā)揮重要作用。

進(jìn)一步的研究證明:KSHV編碼的miRNA都簇集于KSHV基因組的主要潛伏相關(guān)區(qū)域,此區(qū)域編碼潛伏相關(guān)性核抗原為LANA、v-cyclin、v-FLIP和Kaposi基因(K12)。兩條miRNA(miR-K12-10,miR-K12-12)位于K12開放讀碼框架內(nèi),余10條簇集于v-FLIP與K12之間的非編碼區(qū)域。KSHV基因組編碼80多種蛋白質(zhì),只有少數(shù)在潛伏感染的細(xì)胞中表達(dá),如上面所提到的LANA,v-Cyclin,v-Flip和K12。它們具有調(diào)節(jié)KS細(xì)胞宿主內(nèi)環(huán)境作用,并與KSHV miRNA協(xié)同表達(dá)。

同時(shí)在對KSHV裂解復(fù)制開關(guān)分子RTA的3′UTR報(bào)告基因活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):miR-K12-7-5P能特異地下調(diào)RTA的活性,抑制它的表達(dá)。同時(shí)顯著抑制RTA下游病毒裂解期基因的轉(zhuǎn)錄和病毒粒子的釋放,之后在病毒裂解感染期檢測到某些特定miRNA的表達(dá)增高,而且其表達(dá)水平比潛伏期更高[15]。說明潛伏期和裂解期相關(guān)miRNA的表達(dá)均在KSHV致病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。呈現(xiàn)出潛伏性和裂解性兩種階段[16],它們之間的轉(zhuǎn)換則是卡波西肉瘤發(fā)生的關(guān)鍵步驟[17]。

2.2 KSHV miRNA的功能

目前12種KSHV miRNA的功能大部分未知,Marshall等[18]研究了12種KSHV miRNA的進(jìn)化保守性:miR-K12-2、-4、-5、-6、-7、-9具有相對明顯的多態(tài)性;miR-K12-12完全保守;miR-K12-1、-3、-8、-10、-11高度保守。其中miR-K12-5的多態(tài)性影響成熟miRNA的表達(dá)水平和生物活性。miRNA-K12-9表現(xiàn)為更大的變異性,這說明miR-K12-9并非是組織培養(yǎng)中生長所必需的。

Marshall等[18]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明:KSHV miRNA基因在體內(nèi)嚴(yán)格選擇,可能參與KSHV相關(guān)性惡性腫瘤的生物活性及發(fā)病機(jī)制,KS肉瘤中,被KSHV感染的腫瘤細(xì)胞都為低分化的內(nèi)皮細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞根據(jù)組織起源分為LECs和血管內(nèi)皮細(xì)胞。Hansen等[19]證明了這些miRNA通過促進(jìn)病毒介導(dǎo)的細(xì)胞重組,在LECs中沉默轉(zhuǎn)錄因子表達(dá),從而維持分化狀態(tài)的LECs,導(dǎo)致KSHV誘導(dǎo)KS的發(fā)生。同時(shí)Pun等[20]通過對KSHV編碼的病毒FLICE9的研究發(fā)現(xiàn):KHSV的感染以及K13的異位表達(dá)抑制了CXCR4的表達(dá),而這種抑制作用與miR-146a的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。研究人員[21]對2種位于miR-146a啟動子上的NF-JB位點(diǎn)進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn):K13可能對這2個位點(diǎn)的激活是必需的。因此通過上調(diào)miR-146a,K13誘導(dǎo)的NF-JB活化抑制CXCR4的表達(dá)可能通過促進(jìn)KSHV感染的內(nèi)皮前體細(xì)胞過早釋放到血液循環(huán)參與了KS的發(fā)展。

3 KSHV miRNA與靶基因

為了驗(yàn)證KSHV miRNA的靶基因的存在,Samols等[22]在293細(xì)胞中擴(kuò)增表達(dá)KSHV miRNA,結(jié)果顯示:在miRNA的存在作用下81個基因發(fā)生表達(dá)變化:表現(xiàn)上調(diào)的有8個基因;表達(dá)下調(diào)的有65個基因。其中明顯下調(diào)的有8個基因,變化大于4倍。其中4個基因THBS1、SPP1、PRG1、S100A2分別具有免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞程序性死亡和血管生成的作用。通過實(shí)驗(yàn)分析,證實(shí)3個基因(SPP1、PRG1、THBS1)的變化依賴miRNA調(diào)節(jié),其中THBS1下調(diào)水平>10倍。值得一提的是,THBS1擁有34個與KSHV miRNA結(jié)合的預(yù)測位點(diǎn),理論上12 KSHV miRNA都可以與THBS1結(jié)合,這意味著THBS1的抑制對KSHV生物活性非常重要。THBS1被確認(rèn)是一個抑癌基因,其蛋白質(zhì)具有抗血管生成作用,是血管發(fā)生、遷移、細(xì)胞粘連的重要調(diào)節(jié)因子。THBS1蛋白部分作用可激活TGF-β信號通路途徑,THBS1蛋白水平的降低導(dǎo)致TGF-β活性的降低。KSHV miRNA對THBS1的下調(diào),直接參與KS的發(fā)病機(jī)制。

KSHV和其他致癌病毒相同,通過阻止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)病毒逃逸、篡改信號傳導(dǎo)通路、干擾宿主正常細(xì)胞周期等多環(huán)節(jié)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。如miR-K1靶向調(diào)節(jié)生長抑制信號通路(CDK1)P21的表達(dá),抑制P21介導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯[23]。最近有報(bào)道某些miRNA能夠直接結(jié)合到P21和另一種CDK1(P21)的3′UTR,但在KSHV整個感染過程這些miRNA持續(xù)表達(dá)所呈現(xiàn)的功能并未闡明[24]。miR-K1在氧應(yīng)激條件下可下調(diào)靶基因BACH1促進(jìn)細(xì)胞生存[25],miR-K1、miR-K3和miR-K4-3p可直接作用于靶基因Caspase3[26],研究還發(fā)現(xiàn)miR-K12-11能特異下調(diào)靶基因SMAD5的表達(dá)[27],抑制TGF-β信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)及其對細(xì)胞增殖的抑制作用,從而參與KSHV的促細(xì)胞增殖作用。

4 展望

許多動物病毒家族的基因表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì)、smallRNA)被證實(shí)可以抑制RNA通路和miRNA增殖,可以設(shè)想miRNA、蛋白、基因之間存在三角調(diào)節(jié)關(guān)系,組成復(fù)雜的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)。KSHV是KS必不可少的發(fā)病因素,尋找KS的發(fā)病機(jī)制更多應(yīng)從KSHV入手,鑒于KSHV miRNA和其他病毒miRNA的研究結(jié)果可以看出:KSHV miRNA一方面可以調(diào)控本身基因,另一方面也可以調(diào)控宿主基因。同理,宿主的miRNA也可以調(diào)控病毒的基因。所以KS的發(fā)病機(jī)制有幾種可能路徑:①KSHV miRNA調(diào)控的本身抑癌基因,在KS病人中裂解的KSHV表達(dá)更多的miRNA促使抑癌基因表達(dá)降低,病毒促癌基因表達(dá)上調(diào);②不是所有病毒基因都受自身編碼的miRNA控制,那些不受控制的病毒基因可能和宿主的mRNA競爭結(jié)合宿主的miRNA,引起宿主mRNA上調(diào)表達(dá)產(chǎn)物,導(dǎo)致生物效應(yīng)發(fā)生;③宿主的抑癌基因被KSHV miRNA所調(diào)控,同以上兩種方式比較,這種調(diào)控更有意義、更直接。研究表明:miRNA在細(xì)胞程序性凋亡、腫瘤發(fā)生中確實(shí)起到重要作用,因此KSHV miRNA有可能參與病毒致病形成。我們對大部分的miRNA的功能了解甚少,說明我們探索領(lǐng)域十分廣闊,基于KSHV miRNA在介導(dǎo)病毒-宿主相互作用中的重要作用以及多種miRNA功能研究的不斷清晰,相信在KSHV相關(guān)的KS的攻克治療中miRNA很有希望成為新興的治療靶點(diǎn)之一。

[1] 高媛,譚曉華,楊磊.卡波濟(jì)肉瘤相關(guān)皰疹病毒編碼的microRNAs最新研究進(jìn)展[J].中國病毒病雜志,2013,3(1):71-74.

[2] 吳秀娟,丁媛,趙宗峰,等.微小RNA-126對卡波西肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2017,31(1):26-28.

[3] 趙洋,張魁,董然.miR-17對靶基因轉(zhuǎn)化生長因子受體β_2 的負(fù)性調(diào)控表達(dá)[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2015,29(2):129-131.

[4] 張和細(xì).miRNA與動脈粥樣硬化研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用診斷與治療雜志,2015,28(1):1-3.

[5] 陶濤,王祖義,汪國文.肺癌相關(guān)microRNA研究進(jìn)展[J].中華全科醫(yī)學(xué),2012,10(2):282-283.

[6] MacFarlane LA, Murphy RP. MicroRNA: biogenesis, function and role in cancer[J]. Curr Genomics,2010,11(7):537-561.

[7] 阮光靖.艾滋病相關(guān)卡波西肉瘤的臨床表現(xiàn)和治療以及療效分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2016,22(27):49-50.

[8] Chang Y,Cesarman E, Pessin MS,etal.Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma[J].Science,1994,266(5192):18.

[9] Grundhoff A, Sullivan CS. Virus-encoded microRNAs[J]. Virology,2011,411(2):325-343.

[10] Hansen A, Henderson S, Lagos D,etal. KSHV-encoded miRNAs target MAF to induce endothelial cell reprogramming[J]. Genes Dev,2010,24(2):195-205.

[11] 吳秀娟,普雄明.MicroRNAs在卡波西肉瘤發(fā)病機(jī)制中的研究進(jìn)展[J].國際病毒學(xué)雜志,2013,20(6):281-284.

[12] Wu XJ, Pu XM, Zhao ZF,etal. The expression profiles of microRNAs in Kaposi’s sarcoma[J]. Tumor Biol,2015,36(1):437-446.

[13] Grundhoff A, Sullivan CS, Ganem D. A combined computational and microarray-based approach identifies novel microRNAs encoded by human gamma-herpesviruses[J]. RNA,2006,12(5):733-750.

[14] Umbach JL, Strelow LI, Wong SW,etal. Analysis of rhesus rhadinovirus microRNAs expressed in virus-induced tumors from infected rhesus macaques[J]. J Virol,2010,405(2):592-599.

[15] Lin YT, Kincaid RP, Arasappan D,etal. Small RNA profiling reveals antisense transcription throughout the KSHV genome and novel small RNAs[J]. RNA,2010,16(8):1540-1558.

[16] Ye F, Lei X, Gao SJ. Mechanisms of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latency and reactivation[J]. Adv Virol,2011,2011:193860.

[17] Gantt S, Casper C. Human herpesvirus 8-associated neoplasms: the roles of viral replication and antiviral treatment[J]. Curr Opin Infect Dis,2011,24(4):295-301.

[18] Marshall V, Parks T, Bagni R,etal. Conservation of virally encoded microRNAs in Kaposi sarcoma-associated herpesvirus in primary effusion lymphoma cell lines and in patients with Kaposi sarcoma or multicentric Castleman disease[J]. J Infect Dis, 2007,195(5):645-659.

[19] Hansen A, Henderson S, Lagos D,etal. KSHV-encoded miRNAs target MAF to induce endothelial cell reprogramming[J]. Genes Dev,2010,24(2):195-205.

[20] Pun J,Matta H, Schamus S,etal. Kaposics sarcoma-associated herpesvirus encoded viral FLICE inhibitory protein(vFILP)K13 suppresses CXCR4 expression by unregulating miR-146a [J]. Oncogene, 2010,29(12):1835-1844.

[21] 王子杰,盧春.miRNAs在KSHV致病機(jī)制中作用的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2011,2(17):201-204.

[22] Samols MA,Skalsky RL,Maldonado AM,etal.Identification of cellular genes targeted by KSHV-encoded microRNAS[J].PLoS One,2007,3(65):611-618.

[23] Gottwein E, Cullen BR. A human herpesvirus microRNA inhibits p21 expression and attenuates p21-mediated cell cycle arrest[J]. J Virol,2010,84(10):5229-5237.

[24] Gottwein E, Corcoran DL, Mukherjee N,etal. Viral microRNA targetome of KSHV-infected primary effusion lymphoma cell lines[J]. Cell Host Microbe,2011,10(5):515-526.

[25] Qin Z, Freitas E, Sullivan R,etal. Upregulation of xCT by KSHV-encoded microRNAs facilitates KSHV dissemination and persistence in an environment of oxidative stress[J]. PLoS Pathog,2010,6(1):e1000742.

[26] Suffert G, Malterer G, Hausser J,etal. Kaposi's sarcoma herpesvirus microRNAs target caspase 3 and regulate apoptosis[J]. PLoS Pathog,2011,7(12):e1002405.

[27] Liu Y, Sun R, Lin X,etal. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-encoded microRNA miR-K12-11 attenuates transforming growth factor beta signaling through suppression of SMAD5[J]. J Virol,2012,86(3):1372-1381.

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81660454)

張靜,女,1979-12生,在讀博士,主治醫(yī)師,E-mail:565992809@qq.com

2017-03-27

R730.269

A

1007-6611(2017)07-0743-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.07.024