左陽花 仲紀(jì)祥 邱峰龍 馮播 薛惠英 張繼躍

單精子卵胞漿內(nèi)注射(introcytoplasmic sperm injection,ICSI)是把一條可用精子制動后直接注射到卵母細(xì)胞的胞漿內(nèi)使卵母細(xì)胞受精的技術(shù)，無精子癥是ICSI的絕對適應(yīng)癥。1994年Devroey等[1]首次報(bào)道睪丸手術(shù)取精成功用于ICSI，這項(xiàng)技術(shù)的成功使得梗阻性和部分非梗阻性的無精子癥患者有獲得自己生物學(xué)后代的可能。自從睪丸穿刺(TESE)的精子成功用于ICSI以來，學(xué)者們一直在探索影響ICSI臨床結(jié)局的可能因素。本文主要是評價(jià)男方年齡、發(fā)病原因(梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥)以及精子來源(新鮮或冷凍)等因素對ICSI臨床結(jié)局的影響。

對象與方法

1.對象：回顧分析2012年12月至2015年12月在本生殖中心107例行ICSI的無精子癥患者，入組條件為(1)女方年齡28～35歲；(2)男方無精子癥但TESE能找到可用精子。排除標(biāo)準(zhǔn)為女方因素不孕。如子宮畸形、中重度子宮內(nèi)膜異位癥、輸卵管積水等。共計(jì)納入107例患者，根據(jù)男方年齡分為A組(<30歲)、B組(30≤～≤40歲)和C組(>40歲)；根據(jù)病因分為梗阻性無精子癥(OA)組和非梗阻性(NOA)組；根據(jù)精子來源分為新鮮組和冷凍組；分別分析影響ICSI結(jié)局的相關(guān)因素。本研究經(jīng)過本院倫理委員會通過，且所有研究均知情同意。

2.促排卵治療：采用本中心常規(guī)促排方案進(jìn)行促排卵治療，B超監(jiān)測卵泡，當(dāng)1～2個(gè)卵泡直徑≥18 mm，或3個(gè)以上卵泡直徑≥17 mm或4個(gè)以上卵泡直徑≥16 mm，當(dāng)天晚上肌注hCG10 000 U(麗珠制藥)或者重組人絨促性素注射液(德國默克雪蘭諾，批準(zhǔn)文號：S201230091，規(guī)格型號：250 μg)1支，36 h后取卵。

3.精子處理：(1)新鮮穿刺的睪丸精子。將所取睪丸曲細(xì)精管置培養(yǎng)皿中用G-IVF(Vitrolife,瑞典)洗滌2次，用2個(gè)1 ml無菌注射器(需將其針頭折平)相互碾碎組織，靜置后于倒置顯微鏡下觀察并紀(jì)錄結(jié)果。將組織碎片和洗滌液一起300 g離心10 min。去上清，用1 ml G-IVF液體混勻沉淀，裝于5 ml小試管中，置于室溫下備用，用之前30 min于培養(yǎng)箱中復(fù)溫。(2)冷凍睪丸精子處理。將凍存管置于37℃水浴箱10 min，融解后用培養(yǎng)液稀釋，經(jīng)離心洗滌去除冷凍保護(hù)劑，然后將沉淀懸浮于小滴培養(yǎng)液中，即可用于ICSI。

4.ICSI操作：取卵后培養(yǎng)4 h，在體視鏡下先將卵子放入80 U/ml的Hyluronidase(SAGE，美國)消化酶中，不斷輕輕吹吸，作用30 s后，用不同口徑的用巴氏吸管吹吸，脫除顆粒細(xì)胞后將其轉(zhuǎn)移到G-1(Vitrolife，瑞典)中培養(yǎng)1 h，行ICSI。

5.胚胎觀察和胚胎移植：ICSI后卵子置于覆蓋油的G-1(Vitrolife,瑞典)微滴中培養(yǎng)，16～18 h后觀察受精情況，44 h和68 h看胚胎分裂情況，并選擇可用胚胎進(jìn)行移植。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中，胚胎種植率=種植胚胎總數(shù)/移植胚胎總數(shù)×100%；臨床妊娠率=妊娠總?cè)藬?shù)/移植總?cè)藬?shù)×100%；活產(chǎn)率=分娩活嬰(雙、多胎按1個(gè)計(jì)算)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=(早期流產(chǎn)數(shù)+晚期流產(chǎn)數(shù))/臨床妊娠數(shù)×100%。

結(jié)果

1.不同年齡組患者ICSI臨床結(jié)局比較：男方年齡<30歲組的女方年齡為(29.8±1.8)歲，基礎(chǔ)FSH(7.4±1.8)U/L，BMI指數(shù)(22.7±3.5)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.4±1.7)mm，成熟卵數(shù)(9.9±2.4)個(gè)；30≤男方年齡≤40歲組女方年齡為(30.4±2.5)歲，基礎(chǔ)FSH(7.3±1.9) U/L，BMI指數(shù)(22.3±3.2)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.2±1.8)mm，成熟卵數(shù)(9.2±2.1)個(gè)；男方年齡>40歲組女方年齡為(32.4±2.8)歲，基礎(chǔ)FSH (7.0±1.7)U/L，BMI指數(shù)(23.2±3.3)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.0±2.6)mm，成熟卵數(shù)(8.4±2.2)個(gè)，三組的女方年齡、基礎(chǔ)FSH、BMI指數(shù)、內(nèi)膜厚度以及成熟卵數(shù)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡組患者正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率比較差異也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 男方年齡與臨床ICSI結(jié)局的關(guān)系

臨床妊娠妊娠總?cè)藬?shù)移植總?cè)藬?shù)臨床妊娠率(%)活產(chǎn)分娩活嬰數(shù)移植周期數(shù)活產(chǎn)率(%)流產(chǎn)流產(chǎn)數(shù)臨床妊娠數(shù)流產(chǎn)率(%)193063 3173056 621910 5213560 0183551 42219 5264261 9224252 332611 5

2.不同病因組ICSI臨床結(jié)局比較：NOA組患者女方年齡(30.8±2.1)歲，基礎(chǔ)FSH (7.2±1.9)U/L，BMI指數(shù)(22.5±3.2)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.1±1.9)mm，成熟卵數(shù)(9.2±2.3)個(gè)；OA組患者女方年齡(31.2±2.3)歲，基礎(chǔ)FSH (7.3±2.1)U/L，BMI指數(shù)(22.7±3.4)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.3±1.9)mm，成熟卵數(shù)(9.3±2.4)個(gè)。兩組患者女方年齡、基礎(chǔ)FSH、BMI指數(shù)、內(nèi)膜厚度以及成熟卵數(shù)數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。NOA組和OA組患者正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 不同病因組臨床結(jié)局比較

臨床妊娠妊娠總?cè)藬?shù)移植總?cè)藬?shù)臨床妊娠率(%)活產(chǎn)分娩活嬰數(shù)移植周期數(shù)活產(chǎn)率(%)流產(chǎn)流產(chǎn)數(shù)臨床妊娠數(shù)流產(chǎn)率(%)345561 8295552 743411 8325261 5285253 83329 4

3.不同精子來源組ICSI臨床結(jié)局比較：新鮮精子組患者女方年齡(30.9±2.6)歲，基礎(chǔ)FSH(7.1±2.2 )U/L，BMI指數(shù)(22.4±3.1)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.0±1.8)mm，成熟卵數(shù)(9.0±2.2)個(gè)；冷凍精子組患者女方年齡(31.1±2.2)歲，基礎(chǔ)FSH(7.4±2.2)U/L，BMI指數(shù)(22.8±3.6)kg/m2，內(nèi)膜厚度(11.4±2.2)mm，成熟卵數(shù)(9.4±2.3)個(gè)。兩組患者女方年齡、基礎(chǔ)FSH、BMI指數(shù)、內(nèi)膜厚度以及成熟卵數(shù)數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。新鮮精子組和冷凍精子組患者正常受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率、流產(chǎn)率數(shù)據(jù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 不同精子來源組ICSI妊娠結(jié)局比較

臨床妊娠妊娠總?cè)藬?shù)移植總?cè)藬?shù)臨床妊娠率(%)活產(chǎn)分娩活嬰數(shù)移植周期數(shù)活產(chǎn)率(%)流產(chǎn)流產(chǎn)數(shù)臨床妊娠數(shù)流產(chǎn)率(%)355761 4315754 43358 6315062 0265052 043112 9

討論

無精子癥一般是指患者的精液中沒有精子，最新版世界衛(wèi)生組織在男性不育的診斷檢查及處理手冊指明無精子癥是指精液即使經(jīng)過離心后檢查亦不能發(fā)現(xiàn)精子。但是精液中未發(fā)現(xiàn)精子也不代表無精子癥患者完全無法生育后代，部分無精子癥患者，如輸精管缺如、逆行射精或排精障礙的患者可通過睪丸或附睪穿刺獲得精子，并通過ICSI技術(shù)來生育后代。經(jīng)過近20年的發(fā)展，目前睪丸或附睪穿刺取精聯(lián)合ICSI治療梗阻性或者非梗阻性無精子癥已經(jīng)在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用[2]，并取得良好的治療效果。

本研究的目的是探索男方年齡、發(fā)病原因(梗阻性無精子癥或非梗阻性無精子癥)以及精子來源(新鮮或冷凍)等因素對ICSI臨床結(jié)局的影響。近年來，女方年齡一直被認(rèn)為是不孕和輔助生殖治療失敗的重要原因，因?yàn)榕噪S著年齡的增長，卵巢里的儲備卵泡逐漸消失[2]，卵子的質(zhì)量也在下降。然而本研究結(jié)果提示男方年齡對ICSI的結(jié)局沒有影響，無精子癥的病因也不影響受精率、卵裂率、臨床妊娠率、活產(chǎn)率及流產(chǎn)率，這與相關(guān)學(xué)者[3]研究結(jié)論一致，也有其他學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)OA患者的受精率和臨床妊娠率顯著高于NOA患者，認(rèn)為其主要原因是由NOA患者精子染色體的異常發(fā)生率增高所致[4]。有一些研究表明NOA患者采用新鮮精子和冷凍精子在ICSI結(jié)局方面無顯著差異[5-6]，NOA患者并不能保證每次TESE都能找到精子，因此利用診斷穿刺時(shí)的冷凍精子行ICSI可以避免反復(fù)外科穿刺手術(shù)；這樣不但能夠減少反復(fù)穿刺對患者睪丸功能的影響，還能夠減輕患者的焦慮情緒和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[7]。也有研究認(rèn)為新鮮精子來源的ICSI結(jié)局較好，冷凍精子會導(dǎo)致較低的受精率和臨床妊娠率[8]，認(rèn)為可能與睪丸來源的精子比自然排出的精子對低溫更敏感有關(guān)[9]，冷凍過程中精子細(xì)胞內(nèi)冰晶形成會導(dǎo)致頂體和細(xì)胞膜腫脹、破裂，同時(shí)在精子冷凍和解凍過程中氧自由基增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，進(jìn)而影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局。

在臨床上，OA患者幾乎100%能獲得可用精子，而NOA患者只有50%的機(jī)會獲得可用精子[10]。因此，對于NOA患者只要TESE獲得可用精子，建議患者進(jìn)行冷凍保存，以降低取卵周期發(fā)生無精子使用的風(fēng)險(xiǎn)。而對于OA患者，建議于取卵日行TESE，可以減少精子冷凍保存費(fèi)用。

總之，本研究結(jié)果表明，無精子癥患者一旦獲得可用精子，ICSI臨床結(jié)局不受男方年齡、病因及精子來源的影響。由于本研究標(biāo)本量較少，有關(guān)男方因素對無精子癥患者ICSI臨床結(jié)局的影響有待大樣本研究的進(jìn)一步完善。

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