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敲低RACK1基因抑制C2C12細胞中MyoG和MHC基因表達

2017-03-29 03:02王勝軍汪文俊劉玉蘭
中國畜牧雜志 2017年3期
關鍵詞:骨骼肌分化培養(yǎng)基

張 晶,王勝軍,劉 妍,汪文俊,劉玉蘭

(1.武漢輕工大學,動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室,湖北武漢 430023;2.中南民族大學,生命科學學院,湖北武漢 430074)

敲低RACK1基因抑制C2C12細胞中MyoG和MHC基因表達

張 晶1*,王勝軍1,2,劉 妍1,2,汪文俊2,劉玉蘭

(1.武漢輕工大學,動物營養(yǎng)與飼料科學湖北省重點實驗室,湖北武漢 430023;2.中南民族大學,生命科學學院,湖北武漢 430074)

本實驗旨在研究RNA干擾(RNAi)RACK1基因對C2C12成肌細胞中肌分化標志基因MHC和MyoG表達的影響。將人工合成的靶向RAKC1基因的3條siRNA(1,2,3)轉染C2C12細胞,用RT-qPCR方法檢測并篩選干擾效率最高的1條siRNA。將篩選出的siRNA轉染C2C12成肌細胞并誘導細胞分化,通過RT-qPCR、Western blot和免疫熒光方法在mRNA及蛋白水平檢測RACK1基因沉默后對MHC和MyoG表達的影響。此外,Western blot方法檢測RACK1基因沉默后對PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活的影響。結果表明:RACK1-siRNA-2干擾效率最高,轉染48 h后抑制率可達70%。隨后,C2C12細胞轉染siRNA-2,誘導分化48h后RT-qPCR表明,MHC和MyoG的mRNA表達均顯著性下調(P<0.05);誘導分化72 h后,Western blot和免疫熒光結果表明MHC和MyoG的蛋白表達明顯低于對照組,但AKT和Erk磷酸化水平未見明顯變化。上述結果表明,干擾RACK1能顯著抑制MHC和MyoG的表達,提示RACK1正向調控C2C12成肌細胞的分化。

成肌細胞;激活性蛋白激酶C受體l;肌細胞生成素;肌球蛋白重鏈;RNA干擾

RACK1(激活性蛋白激酶C受體l)是含7個色氨酸-天冬氨酸(WD40)重復序列結構的蛋白。它由GNB2Ll基因編碼,與G蛋白β亞基顯著同源,并在所有真核細胞生物中高度保守[1]。RACK1是一種多功能支架蛋白,介導多條胞內(nèi)信號轉導,調控細胞增殖、凋亡、遷移、轉錄和蛋白合成等過程[1-3]。RACK1基因敲除小鼠的原腸胚無法正常形成,揭示其在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。Tang等[5]研究發(fā)現(xiàn),RACK1在通城豬和長白豬胚胎期65 d骨骼肌中顯著差異表達,提示其在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮作用,但具體功能和調控機制仍然未知。

骨骼肌分化是一個復雜的過程,包括成肌細胞增殖、退出細胞周期、遷移、融合以及最后多核肌管的形成[6]。在肌分化的過程中,一系列骨骼肌特異性基因開始表達,肌細胞生成素(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重鏈(Myosin heavy chain,MHC)是其中比較關鍵的基因。MyoG是骨骼肌分化的決定因子,調控成肌細胞融合和肌纖維形成[7-9]MyoG敲除小鼠因無肌肉形成,在出生前后致死[10]MHC是構成骨骼肌纖維內(nèi)粗肌絲的主要成分。肌纖維類型主要由肌纖維內(nèi)表達的MHC類型來決定[11]。

本研究將C2C12成肌細胞作為研究模型,將細胞內(nèi)源性RACK1用RNAi進行敲低表達,研究RACK1對C2C12細胞分化基因MHC和MyoG表達的影響,從而揭示RACK1基因表達變化對胚胎骨骼肌生長發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 C2C12細胞(小鼠成肌細胞)由華中農(nóng)業(yè)大學趙書紅教授惠贈;胎牛血清、馬血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶、TRIzol試劑、liPofecta mine 2 000 Transfection Reagent均購自Invitrogen公司;3條RACK1siRNA由Invitrogen公司設計合成;PrimeScript RT reagent Kit WithgDNA Eraser反轉錄試盒和SYBR Premix Ex TaqTMRT-PCR試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司;全蛋白提取試劑盒KGP2100購自南京凱基生物發(fā)展有限公司;MyoG抗體、Akt抗體、P-Akt抗體、Erk1/2抗體、P-Erk1/2抗體、β-action抗體、HRP-goat Anti-Mouse IgG均購自Cellsignaling公司;MF-20(MHC抗體)購自DHSB公司。

1.2 主要儀器設備 RT-PCR儀(7500 Real-time PCRsystem,ABI公司);NanodroP2 000超微量分光光度計(Thermo);電泳儀、電泳槽及轉膜儀(Bio-Rad);熒光顯微鏡(Nikon)。

1.3 C2C12成肌細胞培養(yǎng)及誘導分化 C2C12 成肌細胞株常規(guī)復蘇后,用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清,1%谷氨酰胺,1%雙抗),在體積分數(shù)5% CO2,37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞增殖融合至 70% ~ 80% 時,更換為含2%馬血清的DMEM分化培養(yǎng)基進行誘導分化。

1.4 RACK1siRNA轉染C12C12細胞 3條RACK 1siRNA序列見表1。用liPofectamine 2 000轉染試劑將RACK1siRNA及陰性對照siRNA轉染細胞。轉染前24 h,將細胞接種到培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中,當細胞達到大概80%左右時進行轉染。根據(jù)lipofecta mine 2 000的操作說明進行轉染,轉染5 h后更換新鮮培養(yǎng)基。其中siRNA用量為50 nmoL/L。

1.5 基因mRNA表達測定 細胞總RNA提取、cDNA 合成、Real-time PCR均參照劉妍等[12]的方法。Real-time PCR引物見表2?;騧RNA相對表達量計算采用Livak等[13]的2-ΔΔCt法,以β-actin為內(nèi)參基因。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗,以P<0.05表示差異顯著性標準,P<0.01表示差異極顯著性標準。

1.6 Western blot 本實驗參照劉妍等[12]的方法。用凱基全蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白,測定濃度后,進行SDS-PAGE電泳。電泳后,采用BIORAD轉膜儀將樣品轉移至PVDF膜,將膜置于封閉液(5%脫脂乳的PBST)室溫封閉3 h,加一抗4℃冰箱過夜。洗膜后將膜孵育在含二抗的PBST溶液中,室溫下孵育3 h,用ECl試劑進行熒光顯色,于AlPha Innotech成像系統(tǒng)中檢測及分析條帶強度。

1.7 免疫熒光 4%多聚甲醛固定細胞爬片20 min,DPBS洗3次,每次10 min;用0.2% Triton×-100透化10 min,DPBS洗3次;5% BSA室溫封閉30 min,DPBS洗3次;加一抗(用1%BSA按1∶40稀釋)放在濕盒里,4℃孵育過夜;棄去一抗,DPBS洗3次,加入FITC標記二抗(用1%BSA按1∶100稀釋),濕盒內(nèi)37℃避光孵育2 h,DPBS洗3次;DAPI避光孵育10 min,熒光顯微鏡下觀察結果。

2 結 果

2.1 RACK1siRNA干擾效率檢測及篩選 為了研究RACK1對C2C12細胞分化的影響,設計靶向RACK1基因的3條siRNA序列并轉染細胞,實現(xiàn)細胞內(nèi)源性RACK1的低表達。用脂質體分別將3條RACK1siRNA和Cy3標記的陰性對照轉染C2C12細胞,轉染5 h后,通過觀察陰性對照的紅色熒光強度,以確定siRNA的轉染效率。轉染48 h后,通過RT-qPCR檢測RACK1mRNA的表達,篩選出干擾效率最高的1條siRNA。由圖1A結果顯示,轉染5 h后C2C12細胞中出現(xiàn)的紅色熒光較強,且轉染效率達80%以上。RT-qPCR結果顯示,3條siRNA均能顯著地抑制細胞內(nèi)RACK1基因的表達(P<0.05,圖1B),其中siRNA-2的干擾效率最高(抑制率約70%),因此選擇RACK1siRNA-2進行后續(xù)的干擾實驗。

表1 3條RACK1siRNAs序列

表2 Real-time PCR引物序列

圖2 干擾RACK1對MyoG、MHC基因mRNA表達的影響

2.2 干擾RACK1對MyoG和MHC基因mRNA表達的影響 分別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉染C2C12細胞,轉染12 h后,將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導分化48 h后,采用RT-qPCR檢測RACK1、MHC、MyoG的基因轉錄情況。結果顯示,與對照組相比,RACK1siRNA-2組細胞內(nèi)源性RACK1mRNA的表達顯著受到抑制(P<0.01,圖2),其抑制率約為70%。此外,在對RACK1基因進行干擾后,分化標志基因MHC和MyoG的mRNA表達均顯著性下調(P<0.05,圖2)。

2.3 干擾RACK1對MyoG和MHC基因蛋白表達的影響 別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉染C2C12細胞,轉染12 h后,將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導分化72 h后,采用western blot和免疫熒光檢測MHC和MyoG的蛋白表達情況。Western blot結果顯示,與對照組相比,RACK1siRNA-2組的MHC和MyoG的蛋白明顯下調(圖 3A)。免疫熒光結果顯示,與對照組相比,RACK1siRNA-2組的MHC陽性細胞明顯減少,而MyoG陽性細胞的數(shù)目雖無明顯增多,但部分細胞的綠色熒光強度明顯減弱。這些結果表明,干擾RACK1能有效抑制C2C12分化過程中MHC和MyoG的表達。

2.4 干擾RACK1對Akt和Erk磷酸化水平的影響分別將RACK1siRNA-2和陰性對照轉染C2C12細胞,轉染12 h后,將細胞的生長培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基。在誘導分化72 h后,采用western blot檢測Akt和Erk磷酸化水平。Western blot結果顯示,與對照組相比,RACK1siRNA-2組的Akt和Erk磷酸化水平均無明顯差異(圖4)。

圖 3 干擾RACK1對MHC和MyoG蛋白表達的影響

圖 4 干擾RACK1對Akt和Erk磷酸化水平的影響

3 討 論

哺乳動物骨骼肌生長發(fā)育是一個復雜的過程,主要包括骨骼肌成肌細胞增殖、分化和多核肌管的形成。而這一過程是在生肌調節(jié)因子(MRFs)的精密調節(jié)下有序地進行。MRFs包括Myf5、MyoD、myogenin、Myf6,且這4個成員都具有一個相似的結構特征,即堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (basic helixloop-helix, bHLH) 結構域。其中MyoG在分化早期被激活,其表達象征成肌細胞的開始。成肌細胞分化后相互融合為多核肌管,最后形成肌纖維。成熟肌纖維主要有肌球蛋白重鏈(MHC)組成,并且MHC決定肌纖維的類型。在骨骼肌生長發(fā)育的過程中,多種肌生成相關基因都發(fā)揮著各自的功能,構成一個復雜而精確的正負調控網(wǎng)絡。目前已發(fā)現(xiàn)大量重要基因參與成肌分化過程,但成肌分化的調控機理尚未完成闡明。

RACK1在組織中廣泛表達,但在不同組織和細胞中,由于結合不同信號蛋白,則發(fā)揮不同的生物功能。主要參與調控胚胎發(fā)育、細胞生長、細胞分化、增殖、凋亡、遷移等多種生物活動等[14-16]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)RACK1所結合的重要信號蛋白與結構蛋白已達到數(shù)10種,如PKC、Src、integrinβ、PDE4D5、FAK、STATs、P85、IGF-I等[1-3]。Tang等[5]研究發(fā)現(xiàn),通城豬和長白豬骨骼肌發(fā)育的重要時間點為胚胎期65 d,而在此關鍵時間點RACK1在通城豬中的表達量急劇下調。這暗示RACK1在骨骼肌發(fā)育中發(fā)揮作用,但具體功能和調控機制仍然未知。

本文研究結果顯示,3條siRNA均能顯著地抑制細胞內(nèi)RACK1基因的表達,其中siRNA-2的干擾效率最高。通過基因干擾敲低C2C12細胞中RACK1表達后,成肌標志基因MyoG和MHC的表達在mRNA和蛋白水平均明顯受到抑制,表明下調RACK1表達阻止C2C12成肌細胞分化,提示RACK1可能參與正向調控骨骼肌分化過程。

癌癥相關研究發(fā)現(xiàn)RACK1能結合IGF-1R,影響IGFs下游PI3K/Akt、Erk/MAPK通路的激活調控細胞增殖和凋亡[17-18]。PI3K/Akt途徑調控肌肉特異性基因的表達,誘導和維持肌細胞分化[19-20]。Erk1/2 MAPK信號通路促進肌細胞的增殖并抑制分化[21-22]。本研究表明,RACK1干擾組與對照組相比,成肌細胞分化后Akt和Erk1/2的磷酸化水平未見明顯差異,推測RACK1可能不是通過影響PI3K/Akt和Erk/MAPK通路激活調控C2C12細胞分化。

4 結 論

綜上所述,本研究通過基因干擾敲低C2C12成肌細胞內(nèi)源性RACK1的表達,從而探究其對C2C12細胞分化的影響。研究結果表明,下調RACK1的表達能顯著抑制成肌標志基因MyoG和MHC的表達,表明RACK1可能促進骨骼肌分化過程,但其調控機制可能與PI3K/Akt和Erk/MAPK通路無關。

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Knock-down ofRACK1Ιnhibits the Expressions of Myog and MHC Genes in C2C12 Myoblast

ZHANG Jing1*,WANG Sheng-jun1,2,Liu Yan1,2, WANG Weng-jun2, LⅠU Yu-lan1
(1. Hubei Key laboratory of Animal Nutrition and Feedscience, Wuhan Polytechnic University, Hubei Wuhan 430023, China; 2. College of lifesciences,South-Central University for Nationalities, Hubei Wuhan 430074, China)

The purpose of the study was to investigate the inf l uence of RACK1genesilencing by RNA interference (RNAi) on the expressions of two myogenic dif f erentiation markgenes (MHC and MyoG) in C2C12 myoblast. We transfected three chemically synthesized RACK1siRNA (siRNA-1,2,3) into C2C12 myoblasts, and detected the interference efficiency with RT-qPCR in order toselect thesiRNA with the highest interference efficiency. Then, we transfected the selected siRNA into C2C12 cells and induced C2C12 dif f erentiation. Ⅰn order to study the ef f ect ofRACK1gene silencing on the expressions of MHC and MyoG, we examined MHC and MyoG mRNA and protein expressions by using RT-qPCR, Western blot and immunof l uorescence methods. Ⅰn addition, the ef f ect of theRACK1silencing on the activation of pⅠ3K/Akt and Erk/MApK pathway was detected by Western blot analysis. The result showed thatRACK1-siRNA-2 had the highest interference efficiency, and its interference efficiency was approximately 70% at 48 h after the transfection. C2C12 myoblasts were transfected with siRNA-2 and induced into differentiation for 48 h and 72 h respectively. RT-qPCR showed that MHC and MyoG mRNA were significantly decreased in siRNA-2 transfected cells after 48 h of differentiation; Western blot and immunof l uorescence showed that MHC and MyoG protein were decreased after 72 h of dif f erentiation. However, no signif i cant changes in phosphorylation levels of Akt and Erk were observed. We conclude that downregulation ofRACK1by RNAi signif i cantly inhibits the expressions of MHC and MyoG, indicating thatRACK1is involved in positive regulation of C2C12 dif f erentiation.

Myoblast;RACK1; Myogenin; Myosin heavy chain; RAN interference

S814.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-106

2016-04-12;

2016-05-24

湖北省自然科學資助項目(2015CFB514);湖北省高等學校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃項目(T201508)

張晶(1985-),女,武漢人,博士,講師,研究方向:骨骼肌發(fā)育和肌肉損傷的機制,E-mail:judyzhang1103@163.com

*通訊作者

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