卜小麗，程熠娜，王春維,2，陳 杰，祝家東，祝愛俠*

（1．武漢輕工大學生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023；2．武漢輕工大學武漢市畜禽飼料工程技術研究中心，湖北武漢 430023）

生物與物理復合法脫除棉籽粕中游離棉酚的工藝研究

卜小麗1，程熠娜1，王春維1,2，陳 杰1，祝家東1，祝愛俠1*

（1．武漢輕工大學生豬健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430023；2．武漢輕工大學武漢市畜禽飼料工程技術研究中心，湖北武漢 430023）

本試驗旨在研究微生物固態(tài)發(fā)酵與微波降解分步復合法脫除棉籽粕中游離棉酚的加工技術。以棉籽浸出制油后的棉籽粕為原料，通過不同的菌種、接種量、料液比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等影響因素進行試驗分析，以棉籽粕的脫毒率為評判標準。首先通過確定正交試驗的因素與水平，得出微生物固態(tài)發(fā)酵的最佳脫毒工藝參數(shù)；再以發(fā)酵后的濕棉籽粕為原料，采用微波降解工藝進行第二次物理輔助脫毒，確定最佳微波工藝參數(shù)；測定脫毒前后的棉籽粕粗蛋白含量和小肽含量。結果表明：混菌發(fā)酵比2∶1（枯草芽孢桿菌與酵母菌）、接種量10%、料液比2∶3、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30℃，脫毒效果最佳，此時脫毒率高達86．57%；當微波時間和功率分別為6 min和3 000 W時，最終棉籽粕脫毒可達90．57%。測定脫毒后的棉籽粕粗蛋白含量為52．17%，提高了25．29%；小肽含量為11．13%，提高了20．19%。所得產(chǎn)品色澤均一，呈黑褐色，無酸臭味。微波過程可脫出一部分水分，有效節(jié)約了棉籽粕的烘干成本和烘干時間。此方法工藝簡單、安全可靠、流程短、脫毒率高、水耗和能耗低，為棉籽粕的合理開發(fā)和利用提供理論基礎和試驗數(shù)據(jù)。

棉籽粕；游離棉酚；固態(tài)發(fā)酵；微波降解；脫毒條件

棉粕粗蛋白含量在38%～50%，是僅次于豆粕的世界第二大植物蛋白原料[1]。我國是世界上主要的產(chǎn)棉大國，年產(chǎn)棉籽餅粕在600萬t以上，對其合理開發(fā)利用能夠在一定程度上緩解我國蛋白資源的不足。但其含有的游離棉酚及環(huán)丙烯酸，尤其是游離棉酚會對畜禽造成損傷。動物攝入過量的游離棉酚，可與酶或其他蛋白質(zhì)結合，不僅降低蛋白質(zhì)消化率[2]，同時會使動物出現(xiàn)腹瀉、厭食、紅細胞數(shù)減少等中毒癥狀，嚴重的會導致肝臟和心肌變形壞死[3]；除此之外，游離棉酚可引起雄性動物的繁殖障礙，因此大大限制其在動物生產(chǎn)中的利用[4]。改善棉籽粕的營養(yǎng)價值，降低棉酚等抗營養(yǎng)物質(zhì)，已成為棉籽粕蛋白資源推廣運用的前提?，F(xiàn)在常用的脫毒法分為物理法、化學法、微生物法。物理法和化學法往往存在成本高、適口性差、無法規(guī)模化生產(chǎn)、脫毒率低等問題。微生物發(fā)酵法成本低，無化學殘留，且較安全，是目前常用的脫毒方法，但仍達不到較為理想的脫毒效果。微波可激發(fā)物料自身水分子的高速運動，極大地縮短熱處理時間，與高溫等脫毒法相比效率更高[5]。本研究旨在采用固態(tài)發(fā)酵和微波降解分步復合的方法對棉粕中的游離棉酚進行降解，確定最佳的降解工藝參數(shù)，為棉籽粕的合理開發(fā)和利用提供理論基礎和試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

1．1．1 試驗材料 棉籽粕原料由戰(zhàn)友生物科技有限公司提供；棉酚標準品購于Sigma中國有限公司；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由武漢輕工大學實驗室提供，酵母菌（Microzyme）購于安琪酵母有限公司；異丙醇、正己烷、冰乙酸、苯胺、3-氨基-1-丙醇、間苯三酚、丙酮為市售。

1．1．2 儀器設備 YB-1 000A分析天平（大連運邦科技發(fā)展有限公司）；Evolution 220紫外分光光度計（美國Thermo公司）；RC6 plus離心機（賽默飛世爾）；SFG-102立式壓力蒸汽滅菌鍋（寧波久興醫(yī)療器械有限公司），WBS-10隧道式微波干燥設備（貴陽新奇微波工業(yè)有限公司）；S-3000N掃描式電子顯微鏡（日立）。

1．2 復合法工藝流程 選取新鮮棉籽粕→菌種、接種量、料液質(zhì)量比、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間單因素試驗→正交試驗→確定最佳發(fā)酵試驗參數(shù)→微波降解脫毒法（時間、功率）→檢測棉粕成分變化。

1．3 試驗設計 將棉籽粕、玉米粉、麩皮按照7:2:1形成底物。自然pH的條件進行發(fā)酵試驗，發(fā)酵后微波降解，并在65℃下烘干，粉碎過40目篩，以棉籽粕中游離棉酚含量為指標進行測定。

1．3．1 發(fā)酵單因素試驗 ①菌種分別為枯草芽孢桿菌、酵母菌、兩種菌種復配（枯草芽孢桿菌:酵母菌=1:1、1:2、2:1）。②接種量以6%、8%、10%、12%為單因素，初始含水率為60%，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間48 h。③初始含水率以50%、60%、70%、80%為單因素，接種量采用①的試驗結果，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間48 h。④發(fā)酵溫度以25、30、35、40℃為單因素，采用①、②的試驗結果，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間48 h。⑤發(fā)酵時間以24、48、72、96 h發(fā)酵時間為單因素，接種量采用①的試驗結果，初始含水率采用②的試驗結果，發(fā)酵溫度采用③的試驗結果進行發(fā)酵試驗。

1．3．2 發(fā)酵正交試驗設計 試驗設計見表1。

表1 棉籽粕發(fā)酵正交試驗設計

1．3．3 微波降解研究 ①在確定最佳發(fā)酵工藝的基礎上，以固態(tài)發(fā)酵正交試驗得到最佳發(fā)酵條件。發(fā)酵后的濕基棉籽粕為原料，以1 000、2 000、3 000、3 500 W微波功率為單因素，微波4 min時進行微波輔助脫毒；②以2、4、6、8 min微波時間為單因素，在①基礎上進行微波技術脫毒，確定不同微波時間對棉籽粕中游離棉酚脫毒工藝的影響。發(fā)酵結束后測定棉籽粕總蛋白、小肽含量和氨基酸變化。

1．4 測定指標及方法

1．4．1 棉酚含量測定 采用間苯三酚法[6]測定棉酚的含量。

1．4．2 掃描電鏡觀察發(fā)酵底物形態(tài) 通過掃描電鏡觀察固態(tài)發(fā)酵棉籽粕底物顯微形態(tài)，觀察枯草芽孢桿菌、酵母菌對棉籽粕的利用情況。

1．4．3 脫毒前后棉籽粕中粗蛋白質(zhì)和小肽含量 采用GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》、GB/T 22492-2008《大豆肽相對分子質(zhì)量的測定方法》，測定脫毒前后棉籽粕中蛋白和小肽的含量。

1．4．4 脫毒前后棉籽粕中氨基酸及氨基酸評分變化采用OPA柱后衍生法測定氨基酸含量[7]。

1．5 統(tǒng)計分析 本試驗中不同處理試驗結果采用Excel（2007）進行預處理，試驗數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計軟件SPSS17．0進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Duncan’s多重比較檢驗，以P＜0．05為差異顯著性標準；結果以平均值±標準差表示。

2 結 果

2．1 不同菌種對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 由圖1可知，枯草芽孢桿菌的發(fā)酵脫毒效果顯著高于酵母菌（P＜0．05），但脫毒率均低于混菌發(fā)酵的脫毒效果；在混菌發(fā)酵時，枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為2:1時脫毒率顯著高于其他兩組混菌發(fā)酵的效果（P＜0．05）。說明這兩種菌協(xié)同性好，在同一個發(fā)酵環(huán)境下能較好的互利共生。因此根據(jù)以上試驗結果對枯草芽孢桿菌與酵母菌接種比例為2:1進行復合發(fā)酵，以期找出復合發(fā)酵的最佳工藝條件。

2．2 接種量、含水率、溫度、時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 由圖2可知，脫毒率隨接種量、含水率、溫度、時間增加均呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢，菌種接種量為10%時脫毒率最大。在接種量從6%增加到10%的過程中，脫毒率明顯增加。但當接種量大于10%后，脫毒率反而下降。在一定范圍內(nèi)，含水率越高，棉酚降解率越高。含水率為60%時脫毒率最高，且含水率從50%增加到60%時，脫毒率明顯增大。在溫度由25℃增加到30℃時脫毒率明顯增加，且在發(fā)酵溫度為30℃時脫毒率最高，當發(fā)酵溫度高于35℃時，脫毒率明顯下降。在發(fā)酵24 h時，脫毒率不足40%；在發(fā)酵48 h時脫毒率達到最高，隨著發(fā)酵時間的增加，脫毒率略有下降的趨勢。

圖1 不同菌種發(fā)酵棉籽粕對其游離棉酚脫率的影響

2．3 固態(tài)發(fā)酵法脫除游離棉酚的正交試驗結果 從表2結果可以得出，對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚含量的影響因素主次是D＞A＞B＞C，即發(fā)酵時間＞接種量＞初始含水率＞發(fā)酵溫度。最佳方案是A2B2C1D2，未在試驗組合中，所以對該組合做驗證試驗，結果顯示脫毒率為86．57%，高于正交試驗中的最高脫毒率85．89%，因此確定最佳工藝組合為A2B2C1D2，即接種量為10%、初始含水率為60%、發(fā)酵溫度為30℃、發(fā)酵時間為48 h。

2．4 微波降解脫毒法脫除游離棉酚的工藝優(yōu)化 由圖3可知，脫毒率隨著微波功率和時間增加均呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢。微波功率為3 000 W時的脫毒率顯著高于1 000 W的脫毒率（P＜0．05），其余微波功率組之間均沒有顯著性差異（P＞0．05）；但從數(shù)值上看，在微波功率達到3 000 W時，脫毒率達到最大。微波6 min的脫毒率顯著高于2 min的脫毒率（P＜0．05），隨著微波時間的增加，脫毒率并沒有顯著變化（P＞0．05）。從數(shù)值上來看，6 min脫毒率最高。

2．5 脫毒前后棉籽粕變化

圖2 不同接種量、含水率、溫度、時間對棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響

圖3 微波功率、時間對游離棉酚脫毒率的影響

表2 棉籽粕發(fā)酵正交試驗

圖4 固態(tài)發(fā)酵棉籽粕形態(tài)

2．5．1 掃描電鏡觀察固態(tài)發(fā)酵棉籽粕形態(tài) 由圖4可知，酵母菌、枯草芽孢桿菌在棉籽粕底物中很好的生長，同時由圖4 b觀察到經(jīng)過2種菌混合發(fā)酵后，棉籽粕底物被分解得更加徹底，表明這兩種菌具有協(xié)同生長、共同利用棉籽粕底物的作用。

2．5．2 脫毒后棉籽粕中粗蛋白質(zhì)、小肽含量變化 由表3可知，利用復合法脫毒后的棉籽粕蛋白質(zhì)和小肽均有顯著提高（P＜0．05）。脫毒后棉籽粕中蛋白質(zhì)含量提高了25．29%，小肽含量提高了20．19%。

2．5．3 脫毒前后棉籽粕中氨基酸的變化 由表4可以看出，脫毒后所測棉籽粕中必需氨基酸含量由脫毒前的9．95 nmol/mL提高到11．45 nmol/mL，非必需氨基酸含量與脫毒前比較也有提高。其中蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸均有顯著性提高（P＜0．05）。必需氨基酸蘇氨酸提高14．6%，纈氨酸提高18．35%，蛋氨酸提高提高21．43%，異亮氨酸提高19．59%，亮氨酸提高15．81%，苯丙氨酸提高12．22%，賴氨酸提高11．81%。

表3 發(fā)酵后棉籽粕營養(yǎng)成分變化 %

3 討 論

3．1 接種量、含水率、溫度、時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響

3．1．1 接種量對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 菌種的接種量在固態(tài)發(fā)酵中是一個很重要的因素[8]。接種量過少，則菌體生長緩慢、代謝少，在限定的時間內(nèi)游離棉酚降解率低。而接種量過高，導致發(fā)酵營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，后期菌體長勢不明顯，不利于產(chǎn)物的形成和毒性物質(zhì)的降解；同時培養(yǎng)基粘度大、易結塊，導致氧氣交換受到限制，菌種生活力不斷衰退，增加了雜菌污染的機會[9]。本試驗中，適量接種量為10%，脫毒效果較好。

表4 復合法脫毒前后棉籽粕中氨基酸的變化

3．1．2 含水率對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 底物的含水率對微生物的生長及其代謝能力有重要影響。本試驗結果與劉國娟等[10]研究結果相同。含水率低會降低營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性、酶的穩(wěn)定性和微生物的生長，進而降低脫毒效果[10]；含水率過高，發(fā)酵物料顏色過深，氣味變差，脫毒率下降，不利于菌體的生長和發(fā)酵物料的干燥。其原因可能是發(fā)酵物料中含水量過高會使底物粘度增大、易結塊、通氣差、易染菌[11]，限制了氧的傳遞和細胞的氧需求，影響菌體生長。本試驗表明，含水率為60%時脫毒率最高。

3．1．3 溫度對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響復合菌種的生長和代謝對溫度具有敏感性[12]。溫度是保證菌種生長和產(chǎn)物合成的重要因素，是固態(tài)發(fā)酵的關鍵控制點。本試驗結果表明，在發(fā)酵溫度為30℃時脫毒率最高，這與金紅春[13]用微生物發(fā)酵脫毒棉粕及在青魚養(yǎng)殖上的利用研究結果一致。發(fā)酵溫度達到37℃時不適合酵母菌的生長；同時溫度過高，芽孢桿菌會啟動自我保護機制，形成芽孢，不利于菌體的生長代謝，進而對棉粕脫毒的生化和代謝產(chǎn)生不利影響。而且固態(tài)發(fā)酵傳熱效果較差，會造成培養(yǎng)基局部溫度過高而導致菌體死亡，降低棉酚脫毒率。

3．1．4 發(fā)酵時間對發(fā)酵棉籽粕中游離棉酚脫毒率的影響 在發(fā)酵48 h時脫毒率最高，延長發(fā)酵時間并不能增大脫毒率，這與朱德偉等[8]研究結果一致。在發(fā)酵前期，脫毒率明顯增加，因在24～48 h菌體處于對數(shù)期，菌體生長迅速、代謝旺盛產(chǎn)物多，脫毒率增加明顯。但當發(fā)酵時間超過96 h后，脫毒率略有下降趨勢，由于過長的發(fā)酵時間，基質(zhì)被過度消耗，而菌體過了穩(wěn)定期后，單位時間產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物減少，雜菌的繼續(xù)生長又消耗底物，進而使脫毒率降低。但發(fā)酵時間太短，不足以到達菌體的生長對數(shù)期，影響菌體的脫毒作用。因此，在發(fā)酵時間為48 h時，脫毒效果較好。

3．2 微波降解法脫除游離棉酚的工藝優(yōu)化 在輸出功率達到3 000 W時，脫毒效果最好。在微波時間為6 min時，脫毒率最高。可能由于微波加熱作用，使棉籽粕溫度迅速增加，從而破壞棉籽粕中游離棉酚結構，或游離棉酚在經(jīng)過微波后與蒸發(fā)的水分一起被釋放。同時微波處理是一種重要的蛋白改性方式，其與傳統(tǒng)制油工藝中采用的高溫蒸炒壓榨技術較為相似。研究資料表明，微波處理可有效降解棉籽蛋白中的各個亞基，并提高其在動物消化道內(nèi)的利用率[5]。由固態(tài)發(fā)酵法和微波技術方法復合脫毒后，制得的棉籽粕產(chǎn)品的脫毒率達到90．57%，原料中棉酚含量僅為72 mg/kg，遠遠低于國家飼料標準值300 mg/kg[14]，屬于低酚棉籽粕。

3．3 脫毒后棉籽粕形態(tài)/粗蛋白質(zhì)、小肽和氨基酸含量變化 脫毒后的棉籽粕蛋白質(zhì)提高了25．29%，小肽含量提高了20．19%。說明在發(fā)酵過程中棉籽粕經(jīng)枯草芽孢桿菌、酵母菌分泌的蛋白酶使得發(fā)酵后棉籽粕蛋白質(zhì)含量提高，發(fā)酵使其中部分大分子蛋白質(zhì)分解為小分子肽，提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收率，改變飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)，產(chǎn)生促生長因子改善棉籽粕飼料的適口性[15]。蛋白質(zhì)以小肽形式直接吸收有很多優(yōu)點：肽之間的運轉不存在競爭性和抑制性，吸收小肽和氨基酸的機制是彼此獨立，互不干擾的，且小肽所占比例越大，越有較好的吸收效果。

4 結 論

在本試驗條件下，通過單因素和正交試驗研究得出，當枯草芽孢桿菌與酵母菌以2:1進行復合發(fā)酵，最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)為接種量10%、初始含水量60%、發(fā)酵時間48 h、發(fā)酵溫度30℃，此時脫毒率可達86．57%。以發(fā)酵后棉籽粕為原料，采用微波輔助脫毒，工藝條件是微波功率3 000 W、微波時間6 min，棉籽粕中游離棉酚脫毒率可達90．57%，發(fā)酵后游離棉酚含量僅為72 mg/kg。

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S828.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-079

2016-07-22；

2016-08-13

湖北省教育廳科研項目（Q20141706）

卜小麗（1989-），女，河南商丘人，在讀研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學專業(yè)，研究方向為飼料添加劑及資源開發(fā)與利用，E-mail: syrlbxl@163．com

* 通訊作者：祝愛俠，博士，E-mail: zhuaixia807@163．com