曹 凱，張 勇，王雁坡，湯志宏，楊 怡，朱寧寧，趙 成*

（1．浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2． 浙江大學(xué)創(chuàng)新技術(shù)研究院，浙江杭州 310007）

體外產(chǎn)氣法評價辣木葉與玉米的組合效應(yīng)

曹 凱1，張 勇1，王雁坡1，湯志宏1，楊 怡1，朱寧寧2，趙 成2*

（1．浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2． 浙江大學(xué)創(chuàng)新技術(shù)研究院，浙江杭州 310007）

本試驗旨在以苜蓿為對照研究辣木葉與玉米的組合效應(yīng)。辣木葉/苜蓿與玉米分別按100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100的比例進行組合，采用體外發(fā)酵法研究不同組合間的體外發(fā)酵參數(shù)及其組合效應(yīng)值的變化。結(jié)果表明：隨著玉米比例的升高，兩組培養(yǎng)液pH、氨態(tài)氮（NH3-N）濃度和乙丙比均呈下降趨勢，而乙酸、丙酸、丁酸、總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）、48h產(chǎn)氣量（48 h GP）和潛在產(chǎn)氣量逐漸升高；辣木葉組和苜蓿組的pH、48 h GP和丁酸無差異（P＞0．05），TVFA、乙酸、丙酸、產(chǎn)氣速率和有機物消化率（OMD）極顯著高于苜蓿組（P＜0．01）；辣木葉組的48 h GP和微生物蛋白（MCP）組合效應(yīng)值以及綜合組合效應(yīng)值（AEs）與苜蓿組無差異（P＞0．05），TVFA、乙酸和NH3-N的組合效應(yīng)值顯著高于苜蓿組（P＜0．05）；以48 h GP、NH3-N、MCP、TVFA濃度和OMD的組合效應(yīng)值以及綜合組合效應(yīng)值A(chǔ)Es為主要衡量指標(biāo)，辣木葉與玉米的組合比例為60:40時，正組合效應(yīng)達(dá)到最大。從本試驗結(jié)果可以得知，辣木葉是一種與苜蓿營養(yǎng)價值相當(dāng)?shù)拇诛暳腺Y源，辣木葉與玉米比例為60:40時的飼料利用效率最高。

辣木葉；玉米；苜蓿；組合效應(yīng)

近年來，我國優(yōu)質(zhì)粗飼料資源嚴(yán)重短缺且價格昂貴，已經(jīng)成為制約反芻動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要因素。辣木作為一種起源于印度北部的熱帶、亞熱帶植物，具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性廣、栽培簡便、抗逆性強及營養(yǎng)豐富等特點[1]。對于反芻動物來說，每100 g辣木葉含粗蛋白質(zhì)25．7 g、脂肪2．3 g、水分6．9 g、粗纖維19．2 g、粗多糖15．9 g、鈣1．54 g和磷0．14 g[2]，符合優(yōu)質(zhì)粗飼料的要求。目前，有關(guān)辣木葉應(yīng)用于反芻動物飼養(yǎng)的報道較少。Aregheore等[3]將不同比例辣木鮮葉與有芒鴨嘴草（原變種）混合肥育山羊，發(fā)現(xiàn)添加20%、50%辣木鮮葉可顯著提高山羊的干物質(zhì)采食量、平均日增重、中性洗滌纖維和粗蛋白質(zhì)的消化率。Luuhm 等[4]認(rèn)為辣木葉粉可作為單一的山羊飼糧，在飼喂后干物質(zhì)采食量、反芻率及消化率方面同飼喂銀合歡葉無顯著差異。由于辣木葉具有高蛋白的特點，本試驗通過體外產(chǎn)氣技術(shù)以苜蓿作參照研究辣木葉與常用的能量飼料玉米的優(yōu)化組合，利用多項發(fā)酵參數(shù)、產(chǎn)氣參數(shù)以及組合效應(yīng)指標(biāo)來確定最優(yōu)的搭配組合，明確辣木葉的經(jīng)濟效益，為辣木葉飼料化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試驗時間及地點 試驗于2015年8月至12月在浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所進行。

1．2 供試樣品 辣木葉由福建廈門天竺辣木有限公司提供，采自2015年6月。苜蓿草、玉米從市場購入。

1．3 供試瘤胃液 取自3頭裝有瘤胃瘺管的湖羊，4層紗布過濾，39℃水浴保溫，并連續(xù)沖入CO2備用。

1．4 供試人工唾液 人工唾液按Menke等[5]的方法配制。

1．5 試驗設(shè)計 試驗分為6個處理：辣木葉（或苜蓿）與玉米分別以100:0、80:20、60:40、40:60、20:80、0:100的比例組合。每個組合3個重復(fù)。試驗采用Mauricio等[6]的壓力讀取式體外產(chǎn)氣系統(tǒng)（Reading Pressure System, RPT）進行體外瘤胃發(fā)酵培養(yǎng)。按不同處理的底物比例準(zhǔn)確稱入500 mg的底物至120 mL產(chǎn)氣瓶中，在持續(xù)通入CO2氣流下加入45 mL人工唾液，密封后在39℃恒溫培養(yǎng)箱中預(yù)處理培養(yǎng)12 h。次日早晨抽取用4層紗布過濾后的瘤胃液5 mL加入到產(chǎn)氣瓶中，同時設(shè)空白對照和標(biāo)準(zhǔn)羊草對照，每個處理4個重復(fù)，培養(yǎng)時間分別為48 h，試驗重復(fù)2次。

1．6 測定指標(biāo)及方法

1．6．1 樣品常規(guī)營養(yǎng)成分 供試飼料測定干物質(zhì)（DM），粗蛋白（CP）用凱氏定氮法測定，粗脂肪（EE）用抽濾法測定，粗灰分（Ash）按高溫灰化（550℃）的方法測定，有機物（OM）為絕干重去除粗灰分部分，鈣（Ca）用高錳酸鉀法測定、磷（P）用比色法測定[7]，中性洗滌纖維（NDF）、酸性洗滌纖維（ADF）按Van Soest法測定[8]。

1．6．2 pH 發(fā)酵終止后，使用SartoriusPB-20型pH計測定。

1．6．3 揮發(fā)性脂肪酸 使用氣相色譜儀（GC-2010，Shimadzu）測定乙酸、丙酸、丁酸和總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）的含量。

1．6．4 產(chǎn)氣量和體外有機物消化率 根據(jù)段智勇[9]的方法計算產(chǎn)氣量和有機物消化率（OMD）。

1．6．5 氨態(tài)氮 取上清混合液，采用比色法測定NH3-N濃度[10]。

1．6．6 微生物蛋白 采用Makkar等[11]的試驗方法，用嘌呤法測定微生物蛋白（MCP）產(chǎn)量。以嘌呤為微生物蛋白產(chǎn)量的標(biāo)志，采用紫外分光光度計通過比色法測定嘌呤，一方面瘤胃微生物內(nèi)嘌呤氮所占的比例是恒定的，另一方面所有飼料來源的RNA和DNA在瘤胃內(nèi)幾乎全部被降解。微生物蛋白在加熱條件下經(jīng)HClO4氧化，分離成游離堿基和環(huán)狀氨基酸，游離堿基再與硝酸銀結(jié)合生成硝酸銀嘌呤絡(luò)合物沉淀，然后與HCl反應(yīng)生成可溶性的游離氨基酸和AgCl沉淀。可溶性的游離堿基在波長260 nm紫外光條件下比色，從而測得嘌呤濃度。

1．6．7 組合效應(yīng)值和綜合組合效應(yīng)值 根據(jù)蘇海涯[12]的方法計算組合效應(yīng)值和綜合組合效應(yīng)（AEs）值。

組合效應(yīng)值（%）=（實測值-加權(quán)估算值）/加權(quán)估算值×100

式中，實測值為實際測定的樣品生產(chǎn)量（mL），加權(quán)估算值＝玉米的實測值×玉米配比（%）＋辣木葉/苜蓿實測值×辣木葉/苜蓿配比（%）。

綜合組合效應(yīng)值(%)=[GP實測值/GP加權(quán)估算值×SUBGP/（SUBGP+SUBMCP）+MCP實測值/MCP加權(quán)估算值×SUBMCP/（SUBGP+SUBMCP）-1]×100

式中，GP實測值、MCP實測值分別為實際測定的產(chǎn)氣量（mL）和微生物蛋白生成量（mg）；加權(quán)估算值＝玉米的實測值×玉米配比（%）＋辣木葉/苜蓿實測值×辣木葉/苜蓿配比（%）；SUBGP為用于生成氣體所需的飼料底物樣品數(shù)量（mg），SUBGP=2．27（mg/mL）×GP（mL），其中2．27為每生成1 mL氣體平均所需的飼料底物樣品數(shù)量（Blummel等[13]，2．20 ～2．34 mL）；SUBMCP為用于生成微生物所需的飼料底物樣品數(shù)量（mg），SUBMCP=微生物蛋白質(zhì)（mg）/0．625，其中0．625為微生物干物質(zhì)中蛋白質(zhì)的含量（Russell等[14]）。1．7 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用SAS 9．2軟件處理，用GLM模型進行二因素方差分析，采用鄧肯法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2．1 供試飼料常規(guī)營養(yǎng)成分 辣木葉、苜蓿、玉米的常規(guī)營養(yǎng)成分見表1。

2．2 辣木葉/苜蓿與玉米組合對發(fā)酵參數(shù)的影響由表2可知，不同處理之間的發(fā)酵參數(shù)差異極顯著（P＜0．01）。隨著玉米比例的增加，乙酸、丙酸、丁酸、TVFA生成量同步上升，但乙丙比逐漸下降，同時pH、NH3-N濃度也有下降的趨勢。辣木葉組與苜蓿組對比中，辣木葉組MCP、乙丙比和NH3-N濃度極顯著低于苜蓿組（P＜0．01），苜蓿組乙酸、丙酸極顯著低于辣木葉組。辣木葉組TVFA顯著高于苜蓿組（P＜0．05），兩組pH和丁酸無差異。除了TVFA、乙酸和丙酸，其他參數(shù)上均無交互作用。上述結(jié)果表明，辣木葉作為一種粗飼料資源，其綜合品質(zhì)與苜蓿相當(dāng)，同時辣木葉按一定比例與玉米進行組合能夠提高VFA和MCP的生成量，并通過降低乙丙比，改變瘤胃發(fā)酵模式，從而提高辣木葉的利用率。

表1 飼料原料的常規(guī)營養(yǎng)成分（絕干基礎(chǔ)）

表2 辣木葉/苜蓿與玉米組合對發(fā)酵參數(shù)的影響 %

表3 辣木葉與玉米組合對產(chǎn)氣參數(shù)及組合效應(yīng)的影響 %

2．3 辣木葉與玉米組合對組合效應(yīng)的影響 由表3可知，不同處理之間的產(chǎn)氣參數(shù)均出現(xiàn)差異極顯著（P＜0．01）。當(dāng)辣木葉/苜蓿與玉米的比例為20:80時，48 h GP、a+b、c和OMD均極顯著高于其他組（P＜0．01），與苜蓿相比，辣木葉組a+b、c和OMD極顯著高于苜蓿組（P＜0．01）。對于綜合組合效應(yīng)值，辣木葉/苜蓿與玉米的組合中都是比例為60:40時最高，而OMD、48 h GP的組合效應(yīng)值與其并不一致。辣木葉組TVFA和NH3-N的組合效應(yīng)值極顯著高于苜蓿組（P＜0．01），苜蓿組OMD的組合效應(yīng)值極顯著高于辣木葉組，48 h GP、MCP的組合效應(yīng)值以及綜合組合效應(yīng)值兩組無差異（P＞0．05）。所有的產(chǎn)氣參數(shù)均有極顯著的交互作用（P＜0．01）。而NH3-N、MCP和OMD組合效應(yīng)均無交互作用（P＞0．05）。48 h GP、TVFA、AEs組合效應(yīng)有顯著的交互作用（P＜0．05）。以上結(jié)果表明，辣木葉在產(chǎn)氣參數(shù)上略優(yōu)于苜蓿，以48 h GP、TVFA、NH3-N、MCP和OMD的組合效應(yīng)值以及綜合組合效應(yīng)值為主要指標(biāo)，辣木葉與玉米的比例60:40時為最優(yōu)組合。

3 討 論

3．1 辣木葉/苜蓿與玉米組合對pH、NH3-N濃度、MCP濃度及組合效應(yīng)的影響 瘤胃pH是反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的一個綜合指標(biāo)，只有在適宜的pH下，粗飼料中的纖維物質(zhì)才能夠被充分消化。瘤胃中大多數(shù)細(xì)菌的最適pH值在6．0以上。Depeters等[15]研究表明，瘤胃pH在6．6～6．8可以保證纖維分解菌的正?；顒?。本試驗中，隨著玉米比例的增加，兩組培養(yǎng)液pH均呈下降趨勢，因為碳水化合物分解產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸能夠引起pH的下降，從而表明碳水化合物是影響瘤胃參數(shù)的一個重要因素。與林奕等[16]研究結(jié)果相一致，同時試驗結(jié)果表明，不同的玉米比例對pH值的影響是極其顯著的，隨著玉米比例的增加，更多碳水化合物的加速分解使得pH值降低，從而在飼料日糧配制過程中可以通過改變玉米的比例實現(xiàn)對pH的調(diào)控。

NH3-N是瘤胃代謝過程中重要的組成部分，一方面是瘤胃中飼料分解的終產(chǎn)物之一，另一方面是瘤胃微生物自身蛋白合成的原料。McDonald等[17]認(rèn)為，瘤胃最佳的NH3-N濃度在5～25 mg/dL。本試驗中各組NH3-N濃度范圍在12．83～18．9 mg/ dL，在文獻(xiàn)報道范圍之內(nèi)。NH3-N濃度受到多方面的影響，主要包括日糧蛋白質(zhì)水平、日糧蛋白質(zhì)在瘤胃內(nèi)的降解率、瘤胃對NH3-N的吸收利用以及外排等。隨著玉米比例的增加，蛋白質(zhì)水平逐漸降低。兩組培養(yǎng)液NH3-N濃度呈現(xiàn)下降趨勢。辣木葉/苜蓿與玉米的組合均在100:0時NH3-N濃度顯著高于其他組，辣木葉與玉米組合比例為60:40時，NH3-N的組合效應(yīng)值最高，苜蓿與玉米的組合中，組合效應(yīng)值最高的出現(xiàn)在比例80:20時?？赡芤驗椴煌孜锏淖罴褷I養(yǎng)配比不同，在最佳配比下，培養(yǎng)液中蛋白分解菌的作用效果最好，從而NH3-N濃度最高。

MCP濃度能夠反映發(fā)酵體系中微生物種群數(shù)量和微生物對NH3-N的利用能力[18]。能量和蛋白質(zhì)是維持微生物生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)反芻動物所需的能氮比例適宜時，瘤胃微生物合成MCP的效率能夠最大限度的提高[19]。本試驗中，隨著玉米比例的增加，2組培養(yǎng)液的MCP濃度都經(jīng)歷一個先升高再降低的過程，并且都是在比例為60:40時達(dá)到最大濃度。表明該組辣木葉/苜蓿與玉米的能氮比例是所有組合里面最好的。同時兩組的MCP濃度均產(chǎn)生了正組合效應(yīng)，辣木葉與玉米的最大組合效應(yīng)值出現(xiàn)在比例為60:40時，而苜蓿與玉米的則出現(xiàn)在比例為80:20時。在適宜的能氮比例下，底物為微生物提供了較充足的氮源，從而有效地提高了瘤胃微生物蛋白合成效率。

3．2 辣木葉/苜蓿與玉米組合對VFA、GP及組合效應(yīng)的影響 瘤胃液中的VFA是反芻動物碳水化合物在瘤胃中降解的主要產(chǎn)物，與能量代謝密切相關(guān)。乙酸在瘤胃TVFA中所占比例很高，是反芻動物合成脂肪的重要前體物質(zhì)。丙酸一方面在體內(nèi)碳水化合物的中間代謝過程中發(fā)揮著重要的作用；另一方面作為瘤胃揮發(fā)性脂肪酸中唯一能生糖的揮發(fā)性脂肪酸，丙酸的糖異生作用為反芻動物提供了絕大部分的葡萄糖。不同的乙丙比代表了瘤胃的不同發(fā)酵模式。本試驗中隨著玉米比例的增加，2組培養(yǎng)液中的TVFA、乙酸、丙酸、丁酸都逐漸增加，當(dāng)玉米比例達(dá)到最大時，乙丙比降到最低。TVFA、乙酸、丙酸和丁酸都極顯著地高于其他組，但并沒有隨著玉米比例的增加而呈線性增加，從而表明在揮發(fā)性脂肪酸的各項指標(biāo)中存在組合效應(yīng)，辣木葉與玉米的組合中，TVFA的生成均產(chǎn)生了正組合效應(yīng)，并且當(dāng)辣木葉與玉米的配比接近時組合效應(yīng)值最大，表明底物中可降解碳水化合物水平較適宜，然而在苜蓿與玉米的組合中，TVFA的生成均產(chǎn)生了顯著的負(fù)組合效應(yīng)。

研究表明，體外產(chǎn)氣量和化學(xué)成分結(jié)合估算的消化率與體內(nèi)法測定的消化率高度相關(guān)，而體外瘤胃發(fā)酵的產(chǎn)氣量與反芻動物飼料體內(nèi)消化率呈正相關(guān)[13]。飼糧中可發(fā)酵的有機物含量直接關(guān)系到產(chǎn)氣量的高低。本試驗中當(dāng)辣木葉/苜蓿與玉米的比例為20:80時，48 h GP、潛在產(chǎn)氣量和產(chǎn)氣速率都極顯著地高于其他比例，表明該比例下底物的消化率達(dá)到最高，這與段智勇[9]的研究結(jié)果一致，這是由于該組精料所占比例最高，而精料易于消化，從而產(chǎn)氣量最高。本試驗中，辣木葉/苜蓿與玉米的48 h GP組合效應(yīng)均不是很明顯，大部分出現(xiàn)了微弱的負(fù)組合效應(yīng)，并且各組之間差異不顯著，可能是由于發(fā)酵條件不同導(dǎo)致。

研究表明，能量與蛋白的比例和使用量對粗飼料纖維的利用率影響很大，是產(chǎn)生組合效應(yīng)的一個主要原因[20]。能氮平衡是保證瘤胃內(nèi)微生物充分發(fā)揮降解作用的重要條件。飼糧中不同水平的蛋白質(zhì)需要對應(yīng)相應(yīng)水平的能量，才能夠充分發(fā)揮作用。本試驗中，辣木葉/苜蓿與玉米的組合均是在比例為60:40時AEs最大，表明在該比例下，底物中飼料原料之間的組合是比較合理的，保證了能氮的相對平衡，從而最大程度上提高了瘤胃發(fā)酵和飼料利用效率。

4 結(jié) 論

在本試驗條件下，辣木葉/玉米組合與苜蓿/玉米組合的各項發(fā)酵參數(shù)、產(chǎn)氣參數(shù)及組合效應(yīng)差異不顯著，部分指標(biāo)優(yōu)于苜蓿/玉米組合，表明辣木葉是一種營養(yǎng)價值與苜蓿相當(dāng)?shù)拇诛暳?。?dāng)辣木葉/玉米組合比例為60:40時，能氮平衡較為合理，正組合效應(yīng)達(dá)到最大，為最優(yōu)組合，可提高辣木葉的利用效率。因此，辣木葉是一種優(yōu)質(zhì)的反芻動物飼料資源，值得開發(fā)與利用。

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Evaluation of Associative Ef f ects of Moringa Oleifera Leaves and Corn by Using anin vitroGas Production Technique

CAO Kai1, ZHANG Yong1, WANG Yan-po1, TANG Zhi-hong1, YANG Yi1, ZHU Ning-ning2, ZHAO Cheng2*
(1.College of Animal Sciences, Zhejiang University, Zhejiang Hangzhou 310058, China; 2.Zhejiang University Ⅰnnovation Technology Research Ⅰnstitute Co., Ltd. Zhejiang Hangzhou 310007, China)

This experiment was conducted to study the associative effect of Moringa oleifera leaves and corn in comparison of alfalfa. Moringa oleifera leaves and alfalfa both mixed with corn in the proportions of 100:0, 80:20, 60:40, 40:60, 20:80 and 0:100. Rumen fermentation parameters and associative ef f ects of the fermented mixtures were evaluatedin vitroby reading pressure system techinique (RPT) to determine the best combination. As a result, rumen pH, NH3-N and the ration of acetate and propionate were decreased with the rise of the ratio of corn, but the yield of acetate, propionate, byrate, VFA, total gas production and potential gas production were increased. There were no significant dif f erences between Moringa oleifera leaves group and alfalfa group in the associative ef f ects of gas production, MCP and the synthetic associative ef f ect(AEs).However TVFA, the yield of acetate and NH3-N in the Moringa oleifera leaves group were signif i cantly higher than those in the alfalfa group(P＜0.05). While the associative ef f ects of gas production, NH3-N, MCP, TVFA, OMD and the synthetic associative ef f ect(AEs) were used as the evaluation indexes, the value of associative ef f ects of the group with corn at proportion 40 and Moringa oleifera leaves at proportion 60 reached the peak(P＜0.01).Ⅰn summary, Moringa oleifera leaves is a coarse feed resource of which the nutrient value is equal to the alfalfa, and feed efficiency tended to be the highest when the ratio of corn and Moringa oleifera leaves is 60:40.

Moringa oleifera leaves; Corn; Alfalfa; Associative ef f ects

S827.5

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-073

2016-07-13；

2016-08-14

辣木枝、葉用于家畜飼料的應(yīng)用技術(shù)研發(fā)（15-518004-005）

曹凱（1992-），男，安徽安慶人，在讀碩士，研究方向為粗飼料資源的開發(fā)與利用，E-mail:aiock@foxmail．com

* 通訊作者：趙成，E-mail: zhaoc@zjuiti．com