朱愛文，倪黎剛，周春寶，朱淑斌，卞桂華

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

蘇姜豬A-FABP基因遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析

朱愛文，倪黎剛，周春寶*，朱淑斌，卞桂華

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

研究采用PCR- RFLP技術(shù)分析蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬群體A-FABP基因遺傳多態(tài)性，并用統(tǒng)計學(xué)方法分析基因座多態(tài)與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明：3個豬種A-FABP基因內(nèi)含子1均具有Bsm I酶切多態(tài)性，分別檢測到3種基因型（AA、AB和BB），χ2適合性檢驗顯示，3個豬種A-FABP基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05）。多態(tài)信息含量（PIC）分析顯示，3個品種豬均為中度多態(tài)；基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析顯示，不同基因型肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋差異顯著，大理石紋AA、AB型顯著高于BB型（P＜0．05），肌內(nèi)脂肪含量AA顯著高于AB、BB型（P＜0．05）。結(jié)論顯示，蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬A -FABP基因intron 1多態(tài)性對肉質(zhì)性狀影響顯著。

蘇姜豬；A-FABP基因；PCR-RFLP；肉質(zhì)性狀

哺乳動物機(jī)體內(nèi)脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白（Adipocyte Fatty Acid-binding Protein，A-FABP）主要在脂肪細(xì)胞中參與甘油三酯生成，以增加肌內(nèi)脂肪（Intramuscular Fat, IMF）含量。研究證實，IMF和肉質(zhì)呈正相關(guān)，影響肉的嫩度、風(fēng)味和多汁性，肉品2．5%～3%的肌內(nèi)脂肪含量可獲得理想口感[1]。利用分子生物學(xué)的手段——分子標(biāo)記輔助選育（MAS）去尋找控制IMF的基因，并進(jìn)行品種選育，以期提高肌內(nèi)脂肪含量，是改善肉質(zhì)行之有效的方法。

Brockmann等[2]研究發(fā)現(xiàn)，A-FABP基因位于含有影響脂肪性狀QTL的豬4號染色體上，在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，影響甘油三酯的生成與分解。Gerbens等[3]克隆、測序發(fā)現(xiàn)，豬A-FABP基因全長8 144 bp，核苷酸序列包括2 370 bp 的5′-上游區(qū)域和1 435 bp的3′-下游區(qū)域；含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，4個外顯子分別編碼24、58、34、16個氨基酸，內(nèi)含子的大小為2 629、840、471 bp，與人、小鼠及大鼠同源性分別為90%、83%、81%。Gerbens等[4]研究表明，杜洛克豬A-FABP多態(tài)性與含量IMF存在相關(guān)。

本研究以姜曲海豬、蘇姜豬（以杜洛克豬、姜曲海豬、楓涇豬為親本，經(jīng)7個世代選育，2013年9月經(jīng)國家畜禽遺傳委員會審定為豬新品種）、長白豬為研究對象，采用PCR-RFLP技術(shù)對改善豬肉質(zhì)性狀起重要作用的A-FABP基因進(jìn)行檢測、分析，旨在尋找與蘇姜豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的遺傳標(biāo)記，探索改善蘇姜豬肉質(zhì)性狀的有效途徑，并為蘇姜豬種質(zhì)資源特性及分子標(biāo)記輔助選擇（MAS）研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗材料 蘇姜豬220頭、姜曲海豬96頭、長白豬144頭，分別來自姜曲海豬保種場、常州康樂農(nóng)牧公司。取以上豬種耳組織樣約0．5 g/頭，置于預(yù)置70%乙醇的1．5 mL Eppendorf管，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｍ涝撞煌蛐蛯嶒炟i只，背最長肌中段最后肋與第一、二腰椎間中心部位取樣，測定肉質(zhì)性狀指標(biāo)。

1．1．2 主要試劑 Taq DNA 聚合酶、DL-2000 Marker、dNTPs、Bsm I限制性內(nèi)切酶等，分別購自寶生物（大連）工程有限公司、上海生工生物技術(shù)有限公司、賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1．2 方法

1．2．1 DNA提取 參照《分子克隆實驗指南》用酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE緩沖液[10 mmol/L Tris-HCl（pH 8．0），1 mmol/L EDTA（pH 8．0）]，4℃保存[5]。0．8%瓊脂糖凝膠電泳法檢測抽提基因組DNA質(zhì)量。

1．2．2 引物設(shè)計和 PCR擴(kuò)增體系 PCR引物根據(jù)GenBank發(fā)布的豬A-FABP基因DNA序列（登錄號：Y16039），參考朱弘焱等[6]發(fā)表的引物設(shè)計，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。所設(shè)計引物擴(kuò)增片段大小為783 bp。引物序列見表1。

基因型頻率=基因型個體數(shù)/測定群體總數(shù)。χ2適合性檢驗法分析基因型是否處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)?；蚣兒隙?、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量采用PopGene 32統(tǒng)計軟件分析?；蛐团c肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性采用 SPSS（16．0版本）的GLM進(jìn)行最小二乘方差分析，比較不同基因型之間肉質(zhì)性狀差異，統(tǒng)計模型：

其中，Yijklm為IMF測量值，μ為群體平均值，Ai為場效應(yīng)，Bj品種效應(yīng)，Ck為年齡效應(yīng)，Dl為性別效應(yīng)，Rm

為基因型效應(yīng)，eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2．1 PCR擴(kuò)增 所設(shè)引物用于 PCR 擴(kuò)增，結(jié)果獲得了特異性很好的產(chǎn)物（圖1），用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，片段長度與預(yù)期大小一致為783 bp，無非特異性擴(kuò)增條帶，可直接用于RFLP分析。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列

PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體系為20 μL：100 ng/μL DNA模板1．0 μL；10×PCR緩沖液2．0 μL；10 μmol/L引物1．0 μL； dNTPs終濃度為200 μmol/L；TaqDNA聚合酶1．0 U；其余用高壓滅菌ddH2O補齊。所設(shè)計引物的 PCR擴(kuò)增條件：95℃ 預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸60 s ，共32個循環(huán)，72℃后延伸10 min ，4℃ 保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1．2．3 RFLP分析 用BsmI酶切擴(kuò)增產(chǎn)物。酶切體系20 μL：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物15 μL，10×Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶1 μL，滅菌蒸餾水3 μL，37℃ 反應(yīng)6～8 h。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。

1．2．4 肉質(zhì)性狀測定 測定主要指標(biāo)包括肉色、大理石紋、pH、失水率、剪切力和IMF含量等。用索氏抽提法提取IMF。測定方法參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]。

1．2．5 統(tǒng)計分析 基因頻率計算公式：

其中，p是等位基因A的基因頻率，q是等位基因B的基因頻率，nAA、nAB、nBB分別是群體中基因型AA、AB和BB型的個體數(shù)。

圖1 豬A-FABP基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2．2 RFLP 檢測 對擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行BsmIRFLP分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物擴(kuò)增的目的片段存在多態(tài)性，出現(xiàn)3種基因型（圖2）。

圖2 豬A-FABP基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物BsmI-RFLP 分析

2．3 不同豬品種A-FABP基因遺傳多態(tài)性分析

2．3．1 等位基因頻率和基因型頻率 對3個豬種

A-FABP基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因型檢測，計算3個豬品種的等位基因頻率和基因型頻率。表2中χ2適合性檢驗結(jié)果顯示，A-FABP基因PCR產(chǎn)物在3個豬種中基因型分布處于Hardy-Weinberg平衡（P＞0．05）。

2．3．2 群體遺傳雜合度、純合度、有效等位基因數(shù)及多態(tài)信息含量分析 PIC用于對標(biāo)記基因多態(tài)性的估計，是表示DNA變異程度高低的指標(biāo)。PIC＜0．25為低度多態(tài)，0．25＜PIC＜0．50為中度多態(tài)，PIC ＞0．50為高度多態(tài)。He是衡量群體內(nèi)遺傳變異的有效指標(biāo)。He越大，群體內(nèi)遺傳變異程度越大。由表3可知，3個豬種均表現(xiàn)為中度多態(tài)；蘇姜豬遺傳多樣性比姜曲海豬高。

3 討 論

3．1 豬A-FABP基因多態(tài)性 于小燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)，松遼黑豬群體存在A-FABP基因5′UTR區(qū)域位點多態(tài)性，測得3種基因型；李禎等[10]利用微衛(wèi)星技術(shù)研究分析11個豬種A-FABP基因的遺傳變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星基因座位點高度多態(tài)；姜延志等[11]利用PCR-RFLP標(biāo)記技術(shù)檢測中國地方豬種雅南豬、大河豬、大河烏豬，研究發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子 1區(qū)域BsmI酶切位點具有多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)2個等位基因，3種基因型；張保軍等[12]在8個豬種的A-FABP基因內(nèi)含子1的微衛(wèi)星位點上，發(fā)現(xiàn)16個等位基因，9種基因型。郭瑞等[13]研究豬A-FABP基因的多態(tài)性及其與背膘厚的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)民豬、長白豬等群體T65A位點的基因型和基因頻率分布存在顯著差異，突變位點對背膘厚存在顯著的影響，背膘厚度AA型豬顯著低于AB型。朱淑斌等[14]研究發(fā)現(xiàn)，地方豬種姜曲海豬在BsmI-RFLP位點上存在多態(tài)性。本研究在蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬3個豬種均發(fā)現(xiàn)BsmI-RFLP多態(tài)性，測得2個等位基因，3種基因型，與姜延志等[11]、朱淑斌等[14]結(jié)果相同。

表2 A-FABP基因在 3個豬品種中的等位基因頻率和基因型頻率

表3 A-FABP基因多態(tài)位點純合度、雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量

2．4 不同豬種A-FABP基因酶切不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響 由表4可知，蘇姜豬、姜曲海豬和長白豬A-FABP基因內(nèi)含子1BsmI酶切后，3種基因型對大理石紋和IMF含量均有顯著影響（P＜0．05），大理石紋為AA型和AB型均顯著高于BB型（P＜0．05），AA型和AB型之間差異不顯著（P＞0．05）；IMF含量為AA型顯著高于AB型和BB型（P＜0．05)），AB型和BB型差異不顯著（P＞0．05）；其他肉質(zhì)性狀的不同基因型之間差異均不顯著（P＞0．05）。

表4 A-FABP基因不同酶切基因型肉質(zhì)性狀比較

3．2A-FABP基因與豬肉質(zhì)性狀的關(guān)系 許多學(xué)者對豬A-FABP基因與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)進(jìn)行了分析研究。Andersson等[15]認(rèn)為在野豬與大白豬雜交F2代群體中第4號染色體上存在影響脂肪沉積的QTL，與Walling等[16]對梅山豬與大白豬雜交F2代群體研究結(jié)論相似。姜延志等[9]研究發(fā)現(xiàn)，地方豬種大河豬、雅南豬等豬種A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域存在BsmI位點多態(tài)性，IMF含量AA基因型個體極顯著高于AB、BB型。Gerbens等[4]在豬A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)內(nèi)檢測到一個（CA）n微衛(wèi)星序列，杜洛克群體分析發(fā)現(xiàn)6種基因型，且AlA3較AlAl基因型IMF含量顯著提高。王存芳等[17]研究表明，杜洛克、漢普夏、長白豬、大約克和萊蕪豬A-FABP基因微衛(wèi)星（CA）n位點與IMF含量密切相關(guān)。于小燕等[7]在松遼黑豬群體中發(fā)現(xiàn)A-FABP基因內(nèi)含子1位點多態(tài)性，不同基因型對大理石紋、IMF含量有極顯著影響，而對其他肉質(zhì)性狀影響不顯著。本研究中，3 個豬種不同A-FABP基因型在大理石紋和IMF含量2個肉質(zhì)性狀指標(biāo)中存在顯著差異，最小二乘均值關(guān)系為AA ＞ AB＞ BB，試驗結(jié)果與姜延志等[11]、于小燕等[9]相似。

3．3A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域BsmI位點AA基因型遺傳力 經(jīng)過對7窩89頭仔豬的實驗室檢測，并結(jié)合實驗豬場生產(chǎn)數(shù)據(jù)資料，發(fā)現(xiàn)蘇姜豬A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域BsmI多態(tài)位點AA基因型公豬和AA基因型母豬交配，后代仔豬均為AA型，暫未出現(xiàn)分離或突變現(xiàn)象，該結(jié)果可能與檢測樣品數(shù)量偏少有關(guān)，是否會出現(xiàn)分離或變異需進(jìn)一步檢測、研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，蘇姜豬、姜曲海豬、長白豬3個豬種A-FABP基因內(nèi)含子1區(qū)域存在BsmI位點多態(tài)性，檢測到2個等位基因，3種基因型（AA、AB、BB），A為優(yōu)勢等位基因。不同基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，不同基因型大理石紋和IMF含量差異顯著，大理石紋最小二乘均值關(guān)系為AA、AB型顯著高于BB型，IMF含量最小二乘均值關(guān)系為AA型顯著高于AB、BB型，其他肉質(zhì)性狀的不同基因型差異均不顯著。筆者認(rèn)為，該突變位點值得引起關(guān)注，最終定論還需要擴(kuò)大樣本數(shù)、增加豬品種數(shù)、對標(biāo)記與肉質(zhì)性能關(guān)聯(lián)作進(jìn)一步深入的研究。

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Genetic Polymorphism of A-FABP Gene and Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Sujiang Swine

ZHU Ai-wen, NⅠ Li-gang, ZHOU Chun-bao*, ZHU Shu-bin, BⅠAN Gui-hua
(Jiangsu Agri-animal Husbandry vocation College, Jiangsu Taizhou 225300, China)

Aesearch by PCR-RFLP technical analyzed Sujiang swine, Jingquhai swine and landrace groups’A-FABPgenetic polymorphisms, and analyzed the correlation between loci polymorphism and meat quality traits. Results showed that the three swine-breeds’ A - FABP gene intron 1 haveBsmⅠenzyme polymorphisms, three genotypes were detected (AA, AB, and BB). The Chi-square test results showed that three swine-breeds’A-FABPgenotype distribution in Hardy-Weinberg equilibrium (P＞0.05) .Polymorphism information content (PⅠC), which were moderately polymorphic in three varieties of swines.According to the association analysis of different genotypes of marbling and intramuscular fat content(ⅠMF), signif i cant dif f erence was found in marbling, genotype AA, AB was signif i cantly higher than BB (P＜0.05), intramuscular fat content genotype AA was signif i cantly higher than AB, BB (P＜0.05). Conclusion showed that Sujiang swine, Jiangquhai swine and landrace groups’A-FABPgene intron 1 polymorphism had signif i cant ef f ects on meat quality traits.

Sujiang swine;A-FABPgene; PCR-RFLP; Meat quality traits

S828.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-029

2016-07-25；

2016-08-08

江蘇省科技項目（BY2014124）；江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項目（SXGC[2014]271）；江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項目（PPZY2015A083）

朱愛文（1972-），男，碩士，講師，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail：ZAW_0@163．com

* 通訊作者：周春寶（1973-），男，博士，教授，主要從事動物遺傳育種研究，E-mial：zhou_tz@ 163．com