牛小花，陳洪源（重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 404100）

清喉利咽顆粒的UPLC指紋圖譜建立及主成分分析

牛小花＊，陳洪源#（重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404100）

目的：建立清喉利咽顆粒的超高效液相色譜（UPLC）指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析法（PCA）為其質(zhì)量控制提供參考。方法：采用UPLC法。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18，流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為2 μL。以鞣花酸為參照物，分析12批清喉利咽顆粒樣品，采用“中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件進(jìn)行相似度分析，并根據(jù)對照品對其中的共有峰進(jìn)行指認(rèn)，同時對共有峰進(jìn)行主成分分析。結(jié)果：12批清喉利咽顆粒指紋圖譜標(biāo)定了18個共有峰，指認(rèn)了6個主要色譜峰（沒食子酸、鞣花酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷）；12批樣品與對照指紋圖譜相似度均≥0.984。經(jīng)主成分分析，18個共有峰可綜合為3個主成分，累計方差貢獻(xiàn)率為78.277%；黃芩苷和16號峰為清喉利咽顆粒指紋圖譜中影響比較大的指標(biāo)。結(jié)論：該方法可為清喉利咽顆粒的質(zhì)量評價提供參考。

清喉利咽顆粒；超高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析

現(xiàn)有相關(guān)文獻(xiàn)僅針對清喉利咽顆粒中所含的柚皮苷、橙皮苷、黃芩苷等成分進(jìn)行含量測定[3-5]，未見指紋圖譜的相關(guān)研究；且2015年版《中國藥典》僅將黃芩苷含量作為其質(zhì)量控制指標(biāo)。清喉利咽顆粒成分復(fù)雜，只采用上述成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)較為局限，遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代制劑質(zhì)量控制要求。指紋圖譜是評價多成分樣品整體質(zhì)量的有效手段[6]。美國、英國等國外藥典早已經(jīng)將指紋圖譜作為質(zhì)量控制重要指標(biāo)[7]，2015年版《中國藥典》中部分藥材也將指紋圖譜作為質(zhì)量控制指標(biāo)之一。但指紋圖譜也存在信息量過大，不利于統(tǒng)計分析及篩選關(guān)鍵指標(biāo)等缺點；而主成分分析法（Principal component analysis，PCA）作為數(shù)據(jù)挖掘的一種方法，通過降維方法，可在不損失或較少損失原有指標(biāo)信息特征的情況下，將多個具有相關(guān)性的指標(biāo)轉(zhuǎn)換成少數(shù)幾個相互獨立的綜合指標(biāo)（即主成分），從而簡化控制指標(biāo)。目前該法多應(yīng)用于指紋圖譜數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，以挖掘其關(guān)鍵控制指標(biāo)[8-9]。超高效液相色譜法（UPLC）相比普通液相系統(tǒng)具有分析時間短，靈明度、分辨率高的特點，在中藥注射液等制劑質(zhì)量控制方面應(yīng)用廣泛[10-11]。因此，本試驗以鞣花酸為參照物，采用UPLC指紋圖譜法并結(jié)合PCA法研究清喉利咽顆粒的質(zhì)量控制方法，為其后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC H-CLASS型UPLC儀，包括QSM四元溶劑管理器、PDA eλ二極管陣列檢測器、SM-FTN樣品管理器、CH-A型柱溫箱、Empower3色譜工作站（美國Waters公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ-100DE型超聲波清洗器（昆山舒美超聲儀器有限公司，功率：100 W，頻率：40 kHz）；DISCOVER-Ⅲ/Ⅳ型實驗室專用超純水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥品與試劑

清喉利咽顆粒（桂龍藥業(yè)有限公司，編號：S1～S12，規(guī)格：5 g/袋）；沒食子酸對照品（批號：20140412，純度：≥98.0%）、鞣花酸對照品（批號：20141008，純度：≥98.0%）購自上海金穗生物科技有限公司；柚皮苷對照品（批號：MUST-12030914，純度：≥98.0%）、橙皮苷對照品（批號：MUST-11030701，純度：≥98.0%）、新橙皮苷對照品（批號：MUST-12040812，純度：≥98.0%）、黃芩苷對照品（批號：MUST-12040812，純度：≥98.0%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，5%A；2～3 min，5%→12%A；3～11 min，12%→30%A；11～15 min，30%→70%A）；流速：0.4 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：2 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取沒食子酸、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、黃芩苷對照品各適量，精密稱定，置于同一50 mL量瓶中，用60%甲醇定容，制成每1 mL含沒食子酸0.10 mg、鞣花酸0.10 mg、柚皮苷0.05 mg、橙皮苷0.05 mg、新橙皮苷0.05 mg、黃芩苷0.10 mg的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品約0.5 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加60%甲醇適量，超聲處理15 min，用60%甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以鞣花酸的峰為參照，計算各色譜峰相對保留時間與相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD≤2.0%（n＝6），相對峰面積的RSD≤2.0%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以鞣花酸的峰為參照，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD≤2.0%（n＝6），相對峰面積的RSD≤2.50%（n＝6），表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號：S1）適量，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以鞣花酸的峰為參照，計算各色譜峰相對保留時間與相對峰面積。結(jié)果，各色譜峰相對保留時間的RSD≤1.50%（n＝6），相對峰面積的RSD≤2.0%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.4.1 指紋圖譜建立及共有峰指認(rèn) 將12批樣品指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”（2004A版），剪切掉前2 min色譜溶劑峰，取2～15min數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以S1號樣品的圖譜為校正參照，時間窗寬度設(shè)為0.20 s，得到12批樣品共有峰UPLC圖（詳見圖1），共確定18個主要色譜峰為各批次樣品所共有；同時，指認(rèn)了6個共有峰，分別為沒食子酸（1號峰）、鞣花酸（7號峰）、柚皮苷（11號峰）、橙皮苷（12號峰）、新橙皮苷（13號峰）、黃芩苷（14號峰）。以7號峰（鞣花酸）為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表1、表2。結(jié)果表明，12批樣品的18個共有峰的相對峰面積的RSD為0～41.98%。

圖1 12批樣品共有峰超高效液相色譜圖Fig 1 UPLC chromatograms of the common peaks of 12 batches of samples

2.4.2 相似度分析 以12批樣品共有峰UPLC圖為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行相似度評價，各批次藥材與對照指紋圖譜的相似度分別為0.992、0.984、0.997、0.987、0.995、0.998、 0.996、0.996、0.997、0.998、0.994、0.997，12批樣品的疊加指紋圖譜見圖2。由圖2可知，各批次樣品與對照指紋圖譜的相似度均≥0.984，表明各批次樣品質(zhì)量穩(wěn)定性較好。

2.5 PCA

用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件對12批樣品的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，再進(jìn)行PCA，計算相關(guān)系數(shù)、主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率。

2.5.1 成分相關(guān)性分析 指紋圖譜中各成分相關(guān)系數(shù)矩陣見表3（F1～F18為18個共有峰對應(yīng)的化學(xué)成分）。由表3可知，成分F1（沒食子酸）與成分F2、F7（鞣花酸）、F17有較大正相關(guān)性；成分F11（柚皮苷）與成分F13（新橙皮苷）有較大正相關(guān)性；成分F14（黃芩苷）與成分F16、F18有較大正相關(guān)性。

2.5.2 主成分特征值、方差貢獻(xiàn)率 以主成分的特征值（λ）及方差貢獻(xiàn)率作為選取主成分的依據(jù)，選取主成分對應(yīng)的λ＞1的前幾個主成分，共提取到5個主成分（見表4），其中第一主成分λ1＝7.850，方差貢獻(xiàn)率為43.609%，第二主成分λ2＝3.757，方差貢獻(xiàn)率為20.874%；第三主成分λ3＝2.483，方差貢獻(xiàn)率為13.790%；第四主成分λ4＝1.282，貢獻(xiàn)率為7.120%；第五主成分λ5＝1.241，方差貢獻(xiàn)率為6.896%，這5個主成分累計方差貢獻(xiàn)率（即方差貢獻(xiàn)率累計值）可達(dá)92.293%，涵蓋了主要成分的大部分信息。

表1 12批清喉利咽顆粒指紋圖譜的相對保留時間Tab 1 Relative retention time in fingerprint of 12 batches of Qinghou liyan granule

初始因子載荷矩陣中，每一個載荷量（數(shù)據(jù)）表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)，詳見表5。由表5可知，第一主成分主要反映成分F3、F4、F5、F7、F9、F10、F11（柚皮苷）、F13（新橙皮苷）、F14（黃芩苷）、F15、F16、F17、F18的信息，第二主成分主要反映成分F1（沒食子酸）、F2、F12（橙皮苷）的信息，第三主成分主要反映成分F6、F8的信息。第四、第五主成分的相關(guān)系數(shù)顯示沒有突出反映哪個成分峰。綜合表4和表5數(shù)據(jù)分析：3個主成分包含了18個共有峰信息，其累計方差貢獻(xiàn)率為78.277%，第四、第五主成分由于方差貢獻(xiàn)率低，可以忽略。因此，分別以第一、第二、第三主成分來建立坐標(biāo)系進(jìn)行投影，即可得到所有樣本的PCA三維投影圖，詳見圖3；圖中每個點對應(yīng)1個共有峰，18個共有峰可分為3類。

將初始因子矩陣中的數(shù)據(jù)除以主成分相對應(yīng)的特征值開平方根，便得到各個主成分中每個指標(biāo)所對應(yīng)的系數(shù)，經(jīng)計算可得主成分的模型為：x1＝0.181f1+0.191f2+ 0.216f3+0.274f4+0.278f5+0.131f6+0.298f7+0.009f8+0.213f9+ 0.213f10+0.205f11+0.079f12+0.259f13+0.323f14+0.183f15+

0.334f16+0.284f17+0.275f18；x2＝0.431f1+0.312f2+0.250f3+ 0.153f4－0.131f5+0.027f6－0.247f7－0.333f8+0.148f9+ 0.111f10－ 0.356f11+0.322f12－ 0.198f13－ 0.146f14－0.077f15－0.133f16+0.249f17－0.175f18；x3＝0.025f1－0.132f2－0.352f3+0.056f4－0.124f5+0.441f6－0.004f7+ 0.397f8+0.304f9+0.214f10+0.063f11+0.271f12+0.135f13－0.135f14－0.461f15－0.063f16+0.124f17－0.061f18。式中，x1、x2、x3分別表示3個主成分，f1、f2……f18分別表示各個色譜峰的相對峰面積經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。3個主成分中x1的特征值最大，所涵蓋信息最多，而第一主成分中系數(shù)較大的為f14（0.323）和f16（0.334）。從圖2可知，14號峰為黃芩苷，表明黃芩苷和16號峰成分在質(zhì)量控制中起著相對比較重要的作用。

表2 12批清喉利咽顆粒指紋圖譜的相對峰面積Tab 2 Relative peak area of fingerprint of 12 batches of Qinghou liyan granule

圖212 批樣品UPLC疊加圖Fig 2 The overlapped UPLC chromatogram of 12 batches of samples

圖3 PCA3D投影Fig 3 3D projection of PCA

表3 相關(guān)系數(shù)矩陣Tab 3 The matrix of correlation coefficient

表4 主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率Tab 4 Eigenvalue and variance contribution rate of principal component

表5 初始因子載荷矩陣Tab 5 Load matrix of initial factors

3 討論

中藥制劑成分復(fù)雜，采用常規(guī)高效液相色譜法建立指紋圖譜，一般需要較長時間（60～120 min）[12]，而本試驗采用UPLC法建立清喉利咽顆粒指紋圖譜，分析時間僅為15 min，且各色譜峰分離度較好，基本達(dá)到基線分離，相比傳統(tǒng)分析方法，節(jié)約了時間和流動相。

本研究考察了不同體積分?jǐn)?shù)（0、20%、40%、60%、80%、100%）甲醇對指紋圖譜中色譜峰吸收強度的影響，結(jié)果表明60%甲醇作為提取溶劑時，指紋圖譜中各色譜峰吸收強度值均較高，因此本試驗選擇60%甲醇作為提取溶劑。本試驗還考察了流動相組成、柱溫、檢測波長和流速對色譜圖的影響。結(jié)果顯示，乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，柱溫為30℃，檢測波長為280 nm，流速為0.4 mL/min時，色譜圖中各色譜峰分離度較好且平均吸收強度較高。

12批清喉利咽顆粒指紋圖譜相似度分析結(jié)果顯示，所有批次樣品與對照圖譜相似度均≥0.984，說明該制劑生產(chǎn)工藝成熟，不同批次產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。利用PCA法中的降維模式分類方法，將反映清喉利咽顆粒制劑指紋圖譜的多維特征參數(shù)用5個主成分來描述，可實現(xiàn)對該復(fù)方制劑指紋圖譜數(shù)據(jù)的快速分析，為該制劑質(zhì)量控制提供一種直觀、科學(xué)、全面的評價方法。將其與本研究前期的指標(biāo)性成分含量測定相結(jié)合，可更加全面、科學(xué)地評價制劑質(zhì)量[13]。

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（編輯：劉 柳）

Establishment of the UPLC Fingerprint and Analysis of Principal Component of Qinghou Liyan Granule

NIU Xiaohua，CHEN Hongyuan（Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404100，China）

OBJECTIVE：To establish the UPLC fingerprint for Qinghou liyan granule，and provide reference for its quality control by combining with principal component analysis（PCA）.METHODS：UPLC was performed on the column of ACQUITY UPLC BEH C18with mobile phase of acetonitrile（A）-0.1%aqueous phosphoric acid solution（B）（gradient elution）at a flow rate of 0.4 mL/min，the detection wavelength was 280 nm，column temperature was 30℃，and injection volume was 2 μL.Using ellagic acid as a reference，12 batches of samples were analyzed，“Similarity Evaluation Software for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine”was used for the similarity analysis and identification of the common peaks，and the PCA was used for common peaks.RESULTS：There were 18 common peaks in the fingerprints of 12 batches of samples，and 6 principal peaks（gallic acid，ellagic acid，naringin，hesperidin，neohesperidin and baicalin）were identified；the similarity degree of 12 batches and reference fingerprints were no less than 0.984.According to PCA，the 18 peaks can be integrated into 3 principal components，with cumulative contribution rate of principal component of 78.277%；baicalin and 16 peaks were the discriminating factors of the fingerprint of Qinghou liyan granule.CONCLUSIONS：The method can provide reference for the quality control of Qinghou liyangranule.

Qinghou liyan granule；UPLC；Fingerprint；Principal component analysis清喉利咽顆粒是由黃芩、西青果、桔梗、竹茹、胖大海、橘紅、枳殼等藥材組成，具有清熱利咽、寬胸潤喉的功效；常用于外感風(fēng)熱所致咽喉發(fā)干、聲音嘶啞，急慢性咽炎、扁桃體炎等見上述證候者，長期使用有保護聲帶的作用[1]。相關(guān)研究表明，其主要含有沒食子酸[2]等有機酸類及柚皮苷[3-4]、橙皮苷[3-4]、黃芩苷[4-5]等黃酮類成分。

R927.2

A

1001-0408（2017）06-0826-05

2016-02-28

2016-08-16）

＊講師，碩士。研究方向：中藥提取純化。電話：023-58567305。E-mail：Xiaohua_206@163.com

#通信作者：講師，碩士。研究方向：中藥化學(xué)成分分析。電話：023-58556066。E-mail：Chyuan123@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.03.29