石征蓉，楊秀青，谷江華，袁強華，宋 英#（.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 60075；.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 6007）

HPLC-DAD波長轉(zhuǎn)換法同時測定糖腎清毒顆粒中7種活性成分的含量Δ

石征蓉1＊，楊秀青1，谷江華1，袁強華2，宋 英2#（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610072）

目的：建立同時測定糖腎清毒顆粒中7種活性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為島津Inert Sustain C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為327 nm（綠原酸和咖啡酸）、280 nm（黃芩苷）、228 nm（牛蒡苷）、276 nm（漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素），柱溫為35℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為4.830～154.6 μg/mL（r＝0.999 8）、0.750～24.1 μg/mL（r＝0.999 7）、22.859～731.5 μg/mL（r＝0.999 7）、8.491～271.7 μg/mL（r＝0.999 3）、2.471～79.0 μg/mL（r＝0.999 6）、6.656～213.0 μg/mL（r＝0.999 4）、2.756～88.2 μg/mL（r＝0.999 8）；精密性、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD＜2.0%；加樣回收率分別為96.86%～100.82%（RSD＝1.46%，n＝6）、98.79%～101.09%（RSD＝0.93%，n＝6）、97.57%～101.51%（RSD＝1.37%，n＝6）、97.76%～99.63%（RSD＝0.77%，n＝6）、97.99%～100.12%（RSD＝0.76%，n＝6）、96.54%～101.07%（RSD＝1.87%，n＝6）、96.60%～99.59%（RSD＝1.14%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于糖腎清毒顆粒中7種活性成分含量的同時測定。

高效液相色譜法；糖腎清毒顆粒；黃芩；黃酮類；牛蒡苷；含量測定

近年來，糖尿病微血管病變導(dǎo)致的糖尿病腎?。―iabetic nephrothy，DN）發(fā)病人群逐年擴大，成為攻克糖尿病的難題[1]。中醫(yī)認為，內(nèi)生熱毒損傷腎絡(luò)是此病發(fā)生發(fā)展的主要病機[2-3]，采用清熱解毒類藥物配伍組方可有效防治DN[4]。糖腎清毒顆粒為成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院在研的中藥六類新藥，由黃芩、牛蒡子、蒲公英和豨薟草組合而成，具有清熱解毒、活血通絡(luò)之功效，主治DN熱毒證。藥效研究表明，黃芩中的黃酮類成分能減少蛋白尿，增加尿肌酐排泄量，其作用機制可能與提高腎臟的抗氧化功能有關(guān)[5]；蒲公英和豨薟草中的有機酸類成分具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗過氧化損傷等作用[6-7]；牛蒡子主要含木脂素類成分牛蒡苷，對DN患者具有改善臨床癥狀、減少尿蛋白及微量白蛋白的作用[8]，上述3類成分為本方治療DN的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。成分定量研究方面，有文獻報道同時測定該制劑中的黃酮類和有機酸類含量[9]。本試驗采用高效液相色譜（HPLC）-DAD波長切換法首次對方中的綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素同時進行定量分析，并進行方法學(xué)驗證，以期為糖腎清毒顆粒的質(zhì)量控制提供一種合理可行的方法。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、DAD檢測器、在線脫氣裝置、OpenlAB工作站（美國Agilent公司）；BP211D型十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AS20500BD型超聲清潔儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）；CXP-500A型高速多功能粉碎機（上海市晟喜制藥機械有限公司）。

1.2 藥品與試劑

糖腎清毒顆粒（成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院自制，批號：20160513、20160515、20160519，規(guī)格：30 g/袋）；黃芩苷對照品（批號：110715-201318，純度：93.3%）、漢黃芩苷對照品（批號：112002-201501，純度：98.8%）、黃芩素對照品（批號：111595-201306，純度：97.8%）、漢黃芩素對照品（批號：111514-200403，純度：98.4%）、綠原酸對照品（批號：110753-201313，純度：96.6%）、咖啡酸對照品（批號：110885-200102，純度：100%）、牛蒡苷對照品（批號：110819-201007，純度：95.4%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為蒸餾水。

1.3 飲片

黃芩（批號：1408018）、蒲公英（批號：1407093）、牛蒡子（批號：1408046）、豨薟草（批號：1208022）均購自四川新荷花中藥飲片股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inert Sustain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：327 nm（0～38 min，綠原酸和咖啡酸）、280 nm（38～48 min，黃芩苷）、228 nm（48～56 min，牛蒡苷）、276 nm（56～80 min，漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素）；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取綠原酸對照品4.79 mg、咖啡酸對照品2.50 mg、黃芩苷對照品9.81 mg、牛蒡苷對照品7.12 mg、漢黃芩苷對照品2.00 mg、黃芩素對照品6.44 mg、漢黃芩素對照品5.64 mg，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液溶解并定容，制成單一對照品貯備液；分別精密吸取黃芩苷對照品貯備液2 mL，另外6種對照品溶液各1 mL，置于同一10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，制成綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為0.047 9、0.025 0、0.196 0、0.071 2、0.020 0、0.064 4、0.056 4 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品0.6 g，置于100 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，超聲處理30 min，冷卻，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按糖腎清毒顆粒處方和工藝分別制備缺黃芩、牛蒡子、蒲公英的單一陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成單一陰性對照溶液。

2.2.4 空白對照溶液 以流動相作為空白對照溶液。

2.2.5 藥材樣品溶液 取蒲公英、豨薟草飲片各適量，分別按2015年版《中國藥典》（一部）供試品溶液制備方法制成單一藥材樣品溶液[10]。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗與專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液、藥材樣品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰計均＞3 000；分離度＞1.5，各成分互不干擾。缺黃芩、牛蒡子的陰性對照色譜圖在相應(yīng)位置上無干擾，因此本方法對黃芩苷、牛蒡苷、黃芩素和漢黃芩素專屬性良好；缺蒲公英的陰性對照色譜圖在相應(yīng)位置上出現(xiàn)了色譜峰，為作進一步分析本試驗參考相關(guān)文獻[11]測定處方的藥材成分；蒲公英和豨薟草藥材均含有綠原酸與咖啡酸，牛蒡子藥材含有綠原酸，因此綠原酸和咖啡酸不具有專屬性。

2.4 線性關(guān)系考察與檢測限、定量限考察

精密稱取各待測對照品適量，加甲醇制成綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素質(zhì)量濃度分別為154.56、24.00、731.47、271.69、79.04、212.99、88.19 μg/mL的混合對照品貯備液，倍比稀釋，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素回歸方程與線性范圍，詳見表2。取上述系列混合對照品溶液，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，當信噪比為10∶1時，得定量限；當信噪比為3∶1時，得檢測限，詳見表2。

2.5 精密度試驗

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

表2 回歸方程、線性范圍、檢測限與定量限Tab 2 Regression equation，linear range，limits and quantification of detection

2.5.1 日內(nèi)精密度 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件一日內(nèi)連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.82%、1.77%、0.91%、0.97%、0.75%、1.14%、0.45%（n＝6），表明日內(nèi)精密度良好。

2.5.2 日間精密度 取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件分別于第1、3、7日連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.90%、1.50%、1.10%、0.79%、0.95%、1.30%、0.82%（n＝6），表明儀器日間精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20160513）適量，分別于室溫下放置0、3、6、12、18、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素峰面積的RSD分別為0.88%、1.70%、1.23%、0.89%、0.43%、1.10%、1.54%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品（批號：20160513）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果，綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、牛蒡苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素的平均含量分別為0.84、0.13、35.07、16.52、、9.41、3.66、1.18 mg/g，RSD分別為0.80%、1.90%、0.64%、1.20%、0.29%、0.71%、0.92%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量樣品（批號：20160513）適量，共6份，每份0.4 g，分別加入一定質(zhì)量的待測成分對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 檢測指標的選擇

中醫(yī)治療疾病強調(diào)用藥的系統(tǒng)性和整體性，復(fù)方療效的發(fā)揮是方中多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，僅用某一個成分或一類成分作為評價指標無法全面反映該制劑的質(zhì)量優(yōu)劣，所以有必要建立多指標成分的含量測定方法。2015年版《中國藥典》通過測定黃芩苷的含量，對黃芩藥材及相關(guān)制劑進行質(zhì)量控制，而現(xiàn)代研究表明，黃芩藥材中其他黃酮類成分（漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等）同樣具有黃芩的部分藥理活性。在制劑工藝中，黃酮類成分可能受溫度、pH等影響相互轉(zhuǎn)化，黃芩苷降解為其苷元黃芩素。另外，闞紅玉等[12]檢測發(fā)現(xiàn)，黃芩藥材中黃酮類成分因產(chǎn)地不同含量差異巨大，這進一步說明了單一用黃芩苷作為藥材及其制劑的質(zhì)量控制指標具有片面性。牛蒡苷屬于木脂素類化合物，是牛蒡子治療DN的主要活性成分[13]。蒲公英和豨薟草均含有綠原酸和咖啡酸，是本方清熱解毒的有效成分，通過測量有機酸的含量有助于制劑整體質(zhì)量控制。綜上所述，7種成分均與本方主治功能相符，因此筆者選取它們作為質(zhì)量控制指標。由于綠原酸和咖啡酸沒有專屬性，本課題在質(zhì)量標準研究時，采用藥材對照方法確定制劑中是否含蒲公英和豨薟草。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of recovery test（n＝6）

表4 樣品含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）Tab 4 Results of contents determination of samples（n＝3，mg/g）

3.2 樣品制備方法的選擇

制備樣品時，筆者分別以甲醇、75%甲醇溶液和50%甲醇溶液為提取溶劑，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，結(jié)果50%甲醇溶液提取效率高，色譜峰對稱性好，故選擇50%甲醇溶液作為提取溶劑；以50%甲醇溶液作為提取溶劑，分別考察超聲時間20、30、40 min對7種活性成分的提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲30 min和超聲40 min成分含量差異不大，超聲20 min成分卻未提取完全，因此選擇超聲30 min為提取時間。

3.3 色譜條件的選擇

筆者分別考察了25、30、35、40℃的柱溫對7種活性成分分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫越高，黃芩苷和牛蒡苷的分離度越好，但考慮到溫度過高，影響綠原酸的含量，因此最終選定35℃的柱溫?？疾炝鲃酉鄷r，本試驗前期對不同比例的甲醇-水、乙腈-水和乙腈-磷酸溶液流動相系統(tǒng)進行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動相中加入一定比例的磷酸有助于提高待測成分峰與雜質(zhì)峰之間的分離度；筆者還對磷酸的用量進行了考察，結(jié)果表明，當流動相的pH在2.0～2.5時，待測成分牛蒡苷含量最高，這與0.1%磷酸溶液的pH相符，因此選擇乙腈-0.1%磷酸溶液組成的流動相系統(tǒng)進行梯度洗脫。選擇檢測波長時，采用DAD檢測器在200～400 nm范圍內(nèi)對供試品溶液進行了全波長掃描，結(jié)果顯示綠原酸和咖啡酸在327 nm、黃芩苷在280 nm、牛蒡苷在228 nm和漢黃芩苷、漢黃芩素、黃芩素在276 nm波長處紫外吸收較優(yōu)，同時各待測成分互不干擾，因此選擇波長切換法測定7個待測成分，且各成分響應(yīng)信號穩(wěn)定。

綜上所述，本方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于糖腎清毒顆粒中7種活性成分含量的同時測定。

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Simultaneous Determination of 7 Active Constituents in Tangshen Qingdu Granule by HPLC-DAD

SHI Zhengrong1，YANG Xiuqing1，GU Jianghua1，YUAN Qianghua2，SONG Ying2（1.School of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China；2.The Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610072，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of 7 active constituents in Tangshen qingdu granule.METHODS：HPLC was performed on the column of SHIMADZU Inert Sustain C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength was 327 nm for chlorogenic acid and caffeic acid，280 nm for baicalin，228 nm for arctiin and 276 nm for wogonoside，baicalein and wogonin，column temperature was 35℃，and injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range was 4.830-154.6 μg/mL for chlorogenic acid and（r＝0.999 8），0.750-24.1 μg/mL for caffeic acid（r＝0.999 7），22.859-731.5 μg/mL for baicalin（r＝0.999 7），8.491-271.7 μg/mL for arctiin（r＝0.999 3），2.471-79.0 μg/mL for wogonoside（r＝0.999 6），6.656-213.0 μg/mL for baicalein（r＝0.999 4）and 2.756-88.2 μg/mL for wogonin（r＝0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%，recoveries were 96.86%-100.82%（RSD＝1.46%，n＝6），98.79%-101.09%（RSD＝0.93%，n＝6），97.57%-101.51%（RSD＝1.37%，n＝6），97.76%-99.63%（RSD＝0.77%，n＝6），97.99%-100.12%（RSD＝0.76%，n＝6），96.54%-101.07%（RSD＝1.87%，n＝6）and 96.60%-99.59%（RSD＝1.14%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple with good precision，stability and reproducibilty，and can be used for the simultaneous determination of 7 active constituents in Tangshen qingdu granule.

HPLC；Tangshen qingdu granule；Baicalin；Flavonid；Arctiin；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2017）06-0816-05

2016-08-23

2016-09-26）

（編輯：張 靜）

四川省科技計劃項目（No.2014SZ0140）

＊碩士研究生。研究方向：中藥新制劑、新工藝和新技術(shù)。E-mail：501560079@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新制劑、新工藝和新技術(shù)。電話：028-87783251。E-mail：songying624@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.26