陳 戟，譚秀華，龐 韜，詹 鴻

·論著·

右美托咪定對(duì)全腦缺氧缺血損傷大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

陳 戟1，譚秀華1，龐 韜2*，詹 鴻1

目的 探討右美托咪定對(duì)全腦缺氧缺血損傷大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響。方法 取SD大鼠24只，體重250～280 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為3組(n=8)：假手術(shù)組(S組)、常規(guī)復(fù)蘇組(C組)和右美托咪定組(D組)。C組和D組采用窒息后心跳驟停法建立大鼠全腦缺氧缺血損傷模型，S組大鼠僅行氣管插管不夾閉窒息，D組于氣管夾閉前尾靜脈注射負(fù)荷劑量右美托咪定4 μg/kg，S組和C組分別給予等容量生理鹽水。各組大鼠于自主循環(huán)恢復(fù)后12、24、48及72 h進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分(Neuropathy disability score，NDS)，于72 h測(cè)定NDS后處死大鼠，取海馬組織，采用TUNEL法標(biāo)記檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況，采用免疫熒光雙標(biāo)法測(cè)定各組大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)情況。結(jié)果 與S組比較，C組各時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分均顯著升高(P<0.05)；D組大鼠在12 h時(shí)NDS評(píng)分與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),D組大鼠在24、48和72 h三個(gè)時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分顯著低于C組(P<0.05)。與S組比較，C組大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元凋亡率和星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)均升高；與C組比較，D組大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元凋亡率降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)論 右美托咪定可減輕全腦缺氧缺血損傷大鼠腦損傷，降低海馬內(nèi)神經(jīng)元的凋亡率，其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞上VEGF的表達(dá)有關(guān)。

右美托咪定；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；星形膠質(zhì)細(xì)胞；腦缺血；腦保護(hù)

0 引言

右美托咪定作為一種高選擇性α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，在腦保護(hù)方面具有積極作用。在大鼠大腦缺血再灌注損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，右美托咪定可減少海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的數(shù)量[1]，在大腦缺血后，腦組織氧供和血糖嚴(yán)重不足，谷氨酸蓄積引起細(xì)胞骨架破壞，右美托咪定通過(guò)還原機(jī)制增加谷氨酰胺在神經(jīng)細(xì)胞中的代謝，減少腦內(nèi)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[2-3]，然而上述機(jī)制不能完全解釋右美托咪定的腦保護(hù)作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，其激活血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞上的磷脂酶C釋放Ca2+,刺激細(xì)胞內(nèi)三磷酸肌醇積聚，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、遷移和增殖，提高血管通透性，并且誘導(dǎo)大量新生血管形成，增加缺血缺氧組織的血流灌注，減少組織的損傷程度[4-7]。右美托咪定是否通過(guò)影響腦內(nèi)VEGF的表達(dá)，對(duì)缺血缺氧損傷的腦組織產(chǎn)生保護(hù)作用鮮有報(bào)道。因此，本研究旨在探討右美托咪定對(duì)全腦缺氧缺血損傷大鼠海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇與分組 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠24只，體重250～280 g，由廣州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。于室溫24 ℃、濕度55%～65%的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將其分為3組(n=8)：假手術(shù)組(S組)、常規(guī)復(fù)蘇組(C組)和右美托咪定預(yù)處理組(D組)。

1.2 主要儀器與試劑 右美托咪定200 μg/2 mL(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，中國(guó))；兔抗大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP抗體(Abcam公司，美國(guó))；小鼠抗大鼠VEGF抗體(Santa公司，美國(guó))；多功能生理監(jiān)護(hù)儀(成都泰盟科技有限公司，中國(guó))；動(dòng)物呼吸機(jī)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司，中國(guó))。

1.3 大鼠全腦缺氧缺血損傷模型的制備 參考文獻(xiàn)[8]的方法，采用窒息后心跳驟停法建立大鼠全腦缺氧缺血損傷模型。C組和D組大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mg/kg麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上。用橡皮筋把大鼠上門(mén)齒向后拉牽引固定，用一小棉簽輕擦其喉部，清理呼吸道分泌物，無(wú)嗆咳反射即可行氣管插管操作，維持大鼠自主呼吸。使用多功能生理監(jiān)護(hù)儀連續(xù)監(jiān)測(cè)無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈壓和心電圖，連接動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣，呼吸頻率70次/min,潮氣量8 mL/kg，吸呼比為1∶2。待生命體征穩(wěn)定10 min，于氣管夾閉前5 min經(jīng)尾靜脈注射右美托咪定4 μg/kg，S組和C組分別給予等容量生理鹽水。30 s后夾閉氣管導(dǎo)管致大鼠窒息后心臟驟停，判斷大鼠心跳驟停的標(biāo)準(zhǔn)為心電圖示心電靜止、室顫、心電機(jī)械分離以及MAP≤20 mmHg。于心跳驟停后2 min開(kāi)始心肺復(fù)蘇，調(diào)整呼吸機(jī)參數(shù)，呼吸頻率90次/min，潮氣量10 mL/kg，并進(jìn)行快速胸外心臟按壓，頻率100次/min，幅度1～2 cm，同時(shí)經(jīng)尾靜脈注射腎上腺素0.02 mg/kg。當(dāng)大鼠出現(xiàn)自主心律及脈搏波、收縮壓≥60 mmHg，并持續(xù)10 min以上判定為自主循環(huán)恢復(fù)，即心肺復(fù)蘇成功，心肺復(fù)蘇操作超過(guò)10 min無(wú)效則放棄復(fù)蘇。自主呼吸恢復(fù)后撤離呼吸機(jī)，咽反射恢復(fù)，吸空氣無(wú)缺氧表現(xiàn)時(shí)拔除氣管導(dǎo)管，放回飼養(yǎng)籠中。S組大鼠僅行氣管插管但不夾閉窒息。

1.4 神經(jīng)功能缺陷評(píng)分 參照文獻(xiàn)[9]的方法，實(shí)驗(yàn)前行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(Neuropathy disability score,NDS)，排除原發(fā)性神經(jīng)功能缺陷大鼠。各組實(shí)驗(yàn)大鼠于自主循環(huán)恢復(fù)后(C組在拔管后)12、24、48和72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，評(píng)分由同一名不清楚分組的研究者完成，從而實(shí)現(xiàn)雙盲。評(píng)分內(nèi)容包括意識(shí)、視覺(jué)、聽(tīng)力、嗅覺(jué)、呼吸、神經(jīng)及角膜發(fā)射、運(yùn)動(dòng)及定向力、對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)力、飲食及有無(wú)癲癇發(fā)作等方面，神經(jīng)功能完全正常為0分，腦死亡為100分。

1.5 腦組織取材及處理 各組大鼠分別在72 h進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分后，10%水合氯醛3.5 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于手術(shù)臺(tái)后經(jīng)左心室插管灌注。先用生理鹽水200 mL快速灌注,再用4 ℃ 4%多聚甲醛200 mL緩慢灌注后，迅速開(kāi)顱取腦并分離海馬組織。將腦組織置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。

1.6 TUNEL法標(biāo)記檢測(cè)凋亡細(xì)胞 隨機(jī)取各組大鼠的4個(gè)海馬組織，海馬延冠狀方向做石蠟包埋后連續(xù)切片，片厚5 μm。切片常規(guī)二甲苯脫臘，梯度酒精脫水后，蒸餾水沖洗。3% H2O2室溫處理10 min,蒸餾水沖洗3 min×3次。標(biāo)本片加TBS 1∶200新鮮稀釋ProteinaseK 37 ℃消化15 min,TBS洗1 min×3次。標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling，buffer),20 μL/片,以保持切片濕潤(rùn)，并置樣品于濕盒中，37 ℃標(biāo)記2 h,TBS洗3 min×3次。用1%的TBS稀釋SABC,均勻后50 μL/片加至切片,37 ℃反應(yīng)60 min,TBS洗5 min×4次。DAB顯色10 min，蒸餾水沖洗5 min。蘇木素復(fù)染1 min。TBS洗,蒸餾水洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)脂封片。應(yīng)用Image-pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析處理，各組每只大鼠選取5張切片,每張切片在損傷區(qū)隨機(jī)釆集5個(gè)高倍(400倍)視野。高倍視野下計(jì)算凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 星形膠質(zhì)細(xì)胞和VEGF免疫熒光雙染 取各組大鼠剩余的4個(gè)海馬組織，30%蔗糖溶液脫水，經(jīng)OCT包埋劑包埋后冰凍，連續(xù)切片制成厚度10 μm撈片，漂洗后封閉。分別加入VEGF(1∶500)一抗及GFAP一抗(1∶200)孵育，再分別加入FITC熒光二抗(1∶200)孵育，繼之以驢抗兔AlexaFluor 536熒光二抗(1∶200)孵育，經(jīng)染核、貼片、封片后，于激光共聚焦顯微鏡下掃描。應(yīng)用Image-pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析處理，各組每只大鼠選取5張切片,每張切片隨機(jī)釆集5個(gè)高倍(400倍)視野。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分的比較 與S組比較，C組各時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分均顯著升高(P<0.05)。D組大鼠在12 h時(shí)NDS評(píng)分與C組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，D組大鼠在24、48和72 h 3個(gè)時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分與C組相比顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)NDS評(píng)分比較

注：與S組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05

2.2 神經(jīng)元凋亡率和星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF表達(dá)比較 與S組比較，C組大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元凋亡率和星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)均升高(P<0.05)。與C組比較，D組大鼠海馬內(nèi)神經(jīng)元凋亡率降低，星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF的表達(dá)升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2和表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)元凋亡率和星形膠質(zhì)細(xì)胞VEGF 表達(dá)的比較(n=4)

注：與S組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05

圖1 TUNEL染色結(jié)果(×400)

圖2 免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果(×400)

3 討論

本研究采用夾閉氣管窒息法制備大鼠全腦缺氧缺血損傷模型，是目前研究全腦缺氧缺血損傷常用的動(dòng)物模型，窒息后機(jī)體經(jīng)歷了循環(huán)停止、低氧血癥、酸中毒、缺血再灌注、應(yīng)激反應(yīng)、代謝紊亂等一系列過(guò)程，很好地模擬了臨床上心源性休克心跳停止后復(fù)蘇過(guò)程可能引起的腦損傷。本研究結(jié)果顯示，夾閉大鼠氣管窒息后均出現(xiàn)心跳停止，復(fù)蘇后出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能障礙，證實(shí)模型制備成功。

右美托咪定是一種高選擇性腎上腺素能受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、遺忘、抗焦慮等作用，且無(wú)呼吸抑制作用。有研究通過(guò)動(dòng)物腦損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定能改善腦缺血損傷，明顯減輕皮質(zhì)的損傷，并減少神經(jīng)元凋亡的數(shù)量和腦梗死面積[10-11]。本研究結(jié)果表明，右美托咪定可有效降低缺血缺氧腦損傷大鼠的神經(jīng)功能缺失評(píng)分，降低海馬內(nèi)神經(jīng)元的凋亡率，證實(shí)右美托咪定在一定時(shí)間范圍內(nèi)具有較好的腦保護(hù)作用。

右美托咪定通過(guò)參與調(diào)節(jié)腦血流與腦氧供需產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。Iida等[12]研究發(fā)現(xiàn)，心肺復(fù)蘇時(shí)，使用右美托咪定后，腦動(dòng)脈直徑和腦氧攝取保持不變，但減少了心肺復(fù)蘇期間用于維持血壓的去氧腎上腺素的劑量及之后異位心室起搏心率的數(shù)量。Chi等[13]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，出血時(shí)使用右美托咪定，可減少局部的腦血流和腦氧耗，保持了一個(gè)理想的氧供需平衡狀態(tài)，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。上述研究均提示右美托咪定的腦保護(hù)作用得益于其調(diào)控腦血流作用。VEGF作為一種強(qiáng)效的促血管生成因子，具有促進(jìn)毛細(xì)血管再生、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、刺激神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)、抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)血管干細(xì)胞分化等生物學(xué)功能，在缺血缺氧性疾病中發(fā)揮著重要作用[14-16]。在腦缺血損傷后，缺血缺氧不僅可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)，還可誘導(dǎo)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞胞漿表達(dá)VEGF，同時(shí)激活缺血損傷處血管內(nèi)皮細(xì)胞上的VEGF受體，誘導(dǎo)大量新生血管形成，增加缺氧缺血組織的血流灌注，減少腦組織的損傷程度[17]。本研究證實(shí)，對(duì)腦缺氧缺血損傷大鼠給予右美托咪定干預(yù)治療后，可顯著提高VEGF在海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，提示右美托咪定部分腦保護(hù)作用是通過(guò)進(jìn)一步上調(diào)VEGF的表達(dá)完成的。

綜上所述，右美托咪定可減輕全腦缺氧缺血損傷大鼠的腦損傷，降低海馬內(nèi)神經(jīng)元的凋亡率，其機(jī)制可能與促進(jìn)海馬內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞上VEGF的表達(dá)有關(guān)。

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Influences of dexmedetomidine on VEGF expressions of hippocampal astrocytes in rats with hypoxic-ischemic brain damage

CHEN Ji1,TAN Xiu-hua1,PANG Tao2*,ZHAN Hong1

(1.Department of Anesthesiology,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150,China;2.Family Planning Special Hospital of Guangdong,Guangzhou 510600,China)

Objective To explore the influences of dexmedetomidine on expressions of vascular endothelial growth factor (VEGF) of hippocampal astrocytes in rats with hypoxic-ischemic brain damage.Methods Totally 24 SD rats,weighting from 250～280 g,were divided into 3 groups (n=8) with a random number table methods:sham-operation group (group S),the routine cardiopulmonary resuscitation group (group C) and dexmedetomidine group (group D).Hypoxic-ischemic brain damage models in rats were established with asphyxia-induced cardiac arrest method in group C and group D,while rats of group S were given tracheal intubation only rather than occlusion asphyxia.Group D was given load dosage of dexmedetomidine (4 μg/kg) via caudal vein injection before occlusion of trachea,while group S and group C were given same volume of normal saline.Neuropathy disability scores (NDS) were determined at 12 h,24 h,48 h and 72 h after recovery of spontaneous circulation in each group of rats.After determination of NDS at 72 h,the rats were sacrificed to sample hippocampus.TUNEL was used to detect the apoptosis of hippocampal neuron.Immunofluorescence double staining was used to determine VEGF expression in hippocampal astrocytes of rats.Results Compared with group S,NDS scores were significantly increased in group C at each time point (P<0.05).There was no difference between group D and group C in NDS at 12 h (P>0.05);however,rats of group D had significantly decreased NDS at 24 h,48 h and 72 h compared with group C (P<0.05).Apoptosis rate of hippocampal neuron and astrocytes VEGF expressions of group C were higher than those of group S (P<0.05).Compared with group C,apoptosis rate of hippocampal neuron was decreased and astrocytes VEGF expression was increased in group D (P<0.05).Conclusion Dexmedetomidine can reduce hypoxic-ischemic brain damage in rats,and reduce the apoptosis rate of hippocampal neurons.The mechanism may be related to the stimulation of VEGF expression in hippocampus astrocytes.

Dexmedetomidine;VEGF;Astrocyte;Brain ischemia;Cerebral protection

2016-08-09

1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院麻醉科，廣州 510150；2.廣東省計(jì)劃生育專(zhuān)科醫(yī)院，廣州 510600

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201703001