曹 媛

LC-MS-MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中阿戈美拉汀及其2種代謝產(chǎn)物的濃度

曹 媛

目的 建立同時(shí)測(cè)定人血漿中阿戈美拉汀及其代謝產(chǎn)物7-去甲阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀濃度的方法。方法 采用LC-MS/MS法(液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜)進(jìn)行檢測(cè)，以非那西汀為內(nèi)標(biāo)、Phenomenex ODS-3為色譜柱，A(0.2%甲酸銨+100%水)-B(甲醇)=30∶70為流動(dòng)相進(jìn)行色譜分離。采用ESI(電噴霧電離源)和MRM(多反應(yīng)監(jiān)測(cè))的方式進(jìn)行正電荷檢測(cè)，用作定量分析的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和非那西汀的離子反應(yīng)對(duì)m/z分別為244.1→185.1、230.1→171.1、260.1→201.1、180.1→110.1。結(jié)果 阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀分別在0.045 7～100 ng/mL、0.137 2～300 ng/mL、0.457 2～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；最低檢測(cè)限分別為0.045 7、0.137 2、0.457 2 ng/mL；所有待測(cè)樣本的日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度均符合相關(guān)生物樣品分析的要求，且RSD<10%。在穩(wěn)定性試驗(yàn)中，血漿樣品在室溫放置4 h、在4 ℃放置24 h、經(jīng)歷3 次冷凍-解凍循環(huán)及在-80 ℃中放置3個(gè)月等條件下均可保持穩(wěn)定。結(jié)論 該方法具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速及靈敏性好等特點(diǎn)，能夠用于臨床相關(guān)藥動(dòng)學(xué)研究。

阿戈美拉??；7-去甲阿戈美拉汀；3-羥基-阿戈美拉??；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法；血藥濃度

0 引言

阿戈美拉汀是第一個(gè)褪黑素受體激動(dòng)劑類抗抑郁藥物[1-2]，主要用于抗焦慮、抗抑郁、調(diào)節(jié)生物鐘及調(diào)整睡眠節(jié)律等[3]，對(duì)于重度抑郁癥患者，阿戈美拉汀的抗抑郁效果明顯優(yōu)于經(jīng)典抗抑郁藥物氟西汀[4-5]，由于該藥物的不良反應(yīng)較少，因此可能成為一種應(yīng)用廣泛的抗抑郁藥物。目前，臨床針對(duì)該藥物及其代謝產(chǎn)物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀LC-MS/MS的研究較少，對(duì)阿戈美拉汀的藥代動(dòng)力學(xué)研究亦不多見，而上述代謝產(chǎn)物同樣具有較強(qiáng)的抗焦慮與調(diào)整睡眠等藥理活性，3-羥基-阿戈美拉汀還能夠抗精神失常[6]，故對(duì)其藥動(dòng)學(xué)研究具有十分重要的意義。因此，本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的LC-MS/MS方法，此方法的通用性較強(qiáng)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器 5415R型低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；LC-20AD型高效液相色譜儀(HPLC，日本島津公司)；Techne氮吹儀(英國(guó)Techne有限公司)；API3200串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(MS/MS，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)有限公司)。

1.2 藥品及試劑 阿戈美拉汀(純度99.7%，批號(hào)：98140302)、3-羥基-阿戈美拉汀(純度99.4%，批號(hào)：98150104)、7-去甲-阿戈美拉汀(純度99.1%，批號(hào)：98150317)，法國(guó)Les Laboratoires Servier公司；非那西汀(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99.9%，批號(hào)：2015090133)作為本研究的內(nèi)標(biāo)；色譜甲醇(美國(guó)天地有限公司，批號(hào)：15040261)。其他試劑均為分析純?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 阿戈美拉汀(A)、3-羥基-阿戈美拉汀(B)、7-去甲-阿戈

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件 色譜條件：以Phenomenex ODS-3 (150 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Phenomenex有限公司)為色譜柱，A (0.2%甲酸銨+100%水)-B (甲醇)=30∶70為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為5 μL。進(jìn)樣方式為自動(dòng)進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：電噴霧電離源(ESI)，檢測(cè)為正電荷模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。電壓：4 000 V；用于定量的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和非那西汀的離子反應(yīng)對(duì)m/z分別為244.1 → 185.1、230.1 →171.1,260.1 → 201.1，180.1 → 110.1；去簇電壓(DP)分別為90、50、50、70 V，入口電壓(EP)分別為3.5、8、10、7 V，碰撞能量(CE)分別為10、10、15、20 eV。

2.2 對(duì)照品溶液的配制 將分析物阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)非那西汀用甲醇配成1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液并保存于-80 ℃冰箱。對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：取上述1.0 mg/mL的儲(chǔ)備液，加甲醇至阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372、0.457 2 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為3 000、1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為10 000、3 333、1 111、370.4、123.5、41.15、13.72、4.572 ng/mL的混合儲(chǔ)備液。內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為100 ng/mL。

2.3 血漿樣品處理 精密移取200 μL人體血漿置于1.5 mL規(guī)格的離心管中，精密加入20 μL焦亞硫酸鈉溶液(20 g/L)后渦旋混合30 s；再加入30 μL內(nèi)標(biāo)液(100 ng/mL)，渦旋混合30 s；于4 ℃條件下，添加600 μL 15%的鹽酸甲醇溶液，渦旋混合5 min；處理后的血漿在12 000 r/min 條件下高速離心(15 700 ×g)10 min，吸取上清液5 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.4 方法學(xué)專屬性的考察 在優(yōu)化之后的色譜和質(zhì)譜條件下，分別得到空白血漿(圖2A)、對(duì)照品血漿(圖2B)和受試者血漿(圖2C)的典型色譜圖，見圖2。阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)非那西汀的保留時(shí)間分別為5.5、3.4、3.1、3.1 min，液質(zhì)圖峰形良好，血漿中存在的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀、3-羥基-阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低定量限(LLOQ)的考察 收集不含待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)的血漿，分別配制同時(shí)含有阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀3種藥物的對(duì)照品血漿，其中阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115、1.372、0.457 2 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為3 000、1 000、333.3、111.1、37.04、12.35、4.115及1.372 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為10 000、3 333、1 111、370.4、123.5、41.15、13.72及4.572 ng/mL，并根據(jù)“2.3”項(xiàng)中相關(guān)方法對(duì)處理后的樣品進(jìn)行進(jìn)樣測(cè)定。

以阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(R1)為縱坐標(biāo)，以其濃度(c1)為橫坐標(biāo)，計(jì)算阿戈美拉汀在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其直線回歸方程：Y=0.118 8 X-0.000 5 (r2=0.996 2)；以7-去甲-阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(R2)為縱坐標(biāo)，以其濃度(c2)為橫坐標(biāo)，計(jì)算7-去甲-阿戈美拉汀在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其直線回歸方程：Y=0.073 4 X-0.000 3 (r2=0.997 5)；以3-羥基-阿戈美拉汀和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(R3)為縱坐標(biāo)，以其濃度(c3)為橫坐標(biāo)，計(jì)算3-羥基-阿戈美拉汀在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得其直線回歸方程：Y=0.054 3 X-0.000 7(r2=0.997 8)；結(jié)果表明，阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的LLOQ分別為0.457 2、1.372、4.572 ng/mL，其分別在0.045 7～100 ng/mL、0.137 2～300 ng/mL及0.457 2～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

注：A.空白血漿，B.空白血漿+0.045 7 μg/L阿戈美拉汀+0.137 2 μg/mL 7-去甲-阿戈美拉汀+0.457 2 μg/mL 3-羥基-阿戈美拉

2.6 精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取200 μL空白血漿，根據(jù)“2.2”項(xiàng)和“2.3”項(xiàng)方法配制成低、中、高濃度梯度的QC樣品(阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為0.109 7、3.704、80 ng/mL，7-去甲-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為0.329 2、11.11、240 ng/mL，3-羥基-阿戈美拉汀質(zhì)量濃度分別為1.097、37.04、800 ng/mL)，各個(gè)濃度均分別進(jìn)行5樣本分析且均連續(xù)測(cè)定3 d。按照當(dāng)日所測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀及3-羥基-阿戈美拉汀的日內(nèi)精密度，并根據(jù)上述方法，在不同的日期重復(fù)操作另外樣品，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果

2.7 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿，按照“2.3”項(xiàng)中方法處理后，分別加入“2.6”項(xiàng)低、中、高濃度的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀，分別取10 μL進(jìn)樣。分別用2種方法處理不同濃度各種化合物，取其峰面積的比值，計(jì)算各種化合物的提取回收率(n=5)。結(jié)果顯示，低、中、高濃度阿戈美拉汀回收率分別為88.5%、87.7%、90.7%；7-去甲-阿戈美拉汀回收率分別為99.5%、91.4%、95.3%；3-羥基-阿戈美拉汀回收率分別為104.6%、99.9%、100.3%。結(jié)果表明，3種藥物的回收率均符合要求且穩(wěn)定。

另取200 μL健康志愿者的空白血漿，按照“2.3”項(xiàng)中方法處理后，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀20 μL及內(nèi)標(biāo)20 μL，對(duì)上述樣品均進(jìn)行LC-MS/MS 分析并獲得峰面積，與直接進(jìn)樣的相同濃度混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液得到的峰面積相互比較，并考察本研究中的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，低、中、高濃度阿戈美拉汀基質(zhì)效應(yīng)分別為112.1%、102.7%、107.5%；7-去甲-阿戈美拉汀基質(zhì)效應(yīng)分別為107.0%、103.3%、108.0%；3-羥基-阿戈美拉汀基質(zhì)效應(yīng)分別為104.6%、110.1%、111.7%。內(nèi)標(biāo)的平均基質(zhì)效應(yīng)為105.3%。結(jié)果表明，3種藥物在本檢測(cè)方法下均不存在基質(zhì)效應(yīng)。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在不同的保存條件下，對(duì)阿戈美拉汀、7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行考察(n=5)，各次檢測(cè)結(jié)果的RSD均<15%。結(jié)果顯示，三種血漿樣品于室溫中放置4 h、在4 ℃的進(jìn)樣溫度下放置24 h、在3次冷凍-解凍循環(huán)處理及在-80 ℃的保存條件中保存3個(gè)月后均穩(wěn)定。結(jié)果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(ng/mL，n=5)

2.9 藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn) 20名中國(guó)籍漢族健康志愿者(18～26歲)于試驗(yàn)日晨，在空腹條件下用100 mL溫水送服阿戈美拉汀片(1片，25 mg)；受試者于給藥前0 h及給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8 h時(shí)，采集各志愿者靜脈血1 mL。將上述取得的血漿樣本分別置于肝素管中，用冰浴冷卻后，以5 000 r/min的離心條件離心10 min，得到分離后的血漿并置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存待測(cè)。利用LC-MS/MS法檢測(cè)給藥后不同時(shí)間的阿戈美拉汀血藥濃度，利用DAS 2.1.1軟件對(duì)本研究中的藥-時(shí)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并得到主要藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，包括峰值濃度(Cmax)、達(dá)峰時(shí)間(Tmax)、所有時(shí)間點(diǎn)的曲線下面積(AUClast)、藥-時(shí)曲線下面積(AUCinf)及半衰期(t1/2)。見表3。阿戈美拉汀及其代謝產(chǎn)物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的藥-時(shí)曲線見圖3。本研究藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)得到我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且各受試者均同意并簽署知情同意書。

表3 本研究中藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)主要參數(shù)(n=5)

圖3 阿戈美拉汀(A)、7-去甲-阿戈美拉汀(B)和3-羥基-阿戈美拉汀(C)的血漿藥-時(shí)曲線

3 討論

阿戈美拉汀是一種褪黑素類似物，是首個(gè)上市銷售的褪黑素受體激動(dòng)劑，臨床試驗(yàn)顯示，其對(duì)抑郁癥具有較好的療效[7]，不良反應(yīng)亦較少[8]，可能成為一種應(yīng)用廣泛的抗抑郁藥物。但臨床針對(duì)該藥物及其代謝產(chǎn)物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀LC-MS/MS的研究十分匱乏[9-12]。因此，建立準(zhǔn)確且簡(jiǎn)便的阿戈美拉汀血藥濃度測(cè)定方法具有非常重要的意義。沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院應(yīng)用LC-MS/MS方法，測(cè)定了比格犬血漿中阿戈美拉汀的藥代動(dòng)力學(xué)行為及其相對(duì)生物利用度，靈敏度較高，但是其為動(dòng)物水平研究，與人體實(shí)際情況具有一定的差異，且其峰形較差，準(zhǔn)確度不高[13]；尚德為等[14]建立了一種人血漿中阿戈美拉汀濃度的快速檢測(cè)方法，并對(duì)該藥物的2種片劑的生物等效性進(jìn)行研究。盡管其對(duì)于阿戈美拉汀人體藥代動(dòng)力學(xué)研究起到重要作用，但其未對(duì)該藥物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

筆者為了同時(shí)檢測(cè)阿戈美拉汀及其代謝產(chǎn)物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的人體血漿含量，希望通過增加流動(dòng)相中的質(zhì)子供體來增強(qiáng)分離效果，因此液相條件選擇中初始選擇添加醋酸銨，但發(fā)現(xiàn)其對(duì)響應(yīng)無明顯改善，因此，通過在流動(dòng)相中添加0.2%甲酸銨，有效增強(qiáng)了分離度；此外，一般情況下，乙腈的洗脫能力明顯強(qiáng)于甲醇，但本研究中乙腈流動(dòng)相的色譜峰形較差，且重復(fù)性不佳，選用甲醇后，發(fā)現(xiàn)分離效果較好，且無保留時(shí)間過長(zhǎng)等問題。盡管本課題得到較為理想的檢測(cè)結(jié)果，但仍存在一些問題，主要在于本研究的阿戈美拉汀體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究中，志愿者均選擇為中國(guó)籍漢族人群，但對(duì)于其余人種，該方法是否存在一定的影響還需要進(jìn)一步考證。

綜上所述，本方法可應(yīng)用于阿戈美拉汀及其代謝產(chǎn)物7-去甲-阿戈美拉汀和3-羥基-阿戈美拉汀的人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究，對(duì)該藥物的應(yīng)用及代謝的研究具有重要意義。

[1] Patil SR,Nerurkar KK,Kalamkar AM,et al.Validated LC-MS/MS method for quantification of agomelatine in human plasma and its application in a pharmacokinetic study[J].J Mass Spectrom,2012,47(1):23-28.

[2] Wang X,Zhang D,Liu M,et al.LC-MS/MS method for the determination of agomelatine in human plasma and its application to a pharmacokinetic study[J].Biomed Chromatogr,2014,28(2):218-222.

[3] 呂志強(qiáng),楊建云,肖炳坤,等.褪黑素能類藥物研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志,2013,40(2):162-166.

[4] 胡孝芬,歐陽澤祥,韓友松.阿戈美拉汀抗抑郁藥應(yīng)用的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2014,25(6):554.

[5] Kim J,Woo SY,Im CY,et al.Insights of a lead optimization study and biological evaluation of novel 4-hydroxytamoxifen analogs as estrogen-related receptor γ (ERRγ) inverse agonists[J].J Med Chem,2016,59(22):10209-10227.

[6] Saracino MA,Mercolini L,Carbini G,et al.Multi-matrix assay of the first melatonergic antidepressant agomelatine by combined liquid chromatography-fluorimetric detection and microextraction by packed sorbent[J].J Pharm Biomed Anal,2014,95:61-67.

[7] Bhutada P,Dixit P,Thakur K,et al.Effects of agomelatine in a murine model of obsessive-compulsive disorder:interaction with meta-chlorophenylpiperazine,bicuculline,and diazepam[J].Kaohsiung J Med Sci,2013,29(7):362-367.

[8] De Berardis D,Serroni N,Campanella D,et al.A case of obsessive-compulsive disorder successfully treated with agomelatine monotherapy[J].J Clin Psychopharmacol,2012,32(2):289-290.

[9] De Berardis D,Fornaro M,Serroni N,et al.Agomelatine beyond borders:current evidences of its efficacy in disorders other than major depression[J].Int J Mol Sci,2015,16(1):1111-1130.

[10]Chenu F,El MM,Blier P.Electrophysiological effects of repeated administration of agomelatine on the dopamine,norepinephrine,and serotonin systems in the rat brain[J].Neuropsychopharmacology,2013,38(2):275-284.

[11]Taylor D,Sparshatt A,Varma S,et al.Antidepressant efficacy of agomelatine:meta-analysis of published and unpublished studies[J].BMJ,2014,348:g1888.

[12]Musazzi L,Seguini M,Mallei A,et al.Time-dependent activation of MAPK/Erk1/2 and Akt/GSK3 cascades:modulation by agomelatine[J].BMC Neurosci,2014,15:119.

[13]欒心怡,趙慧敏,劉舒,等.LC-MS /MS 法測(cè)定Beagle 犬血漿中阿戈美拉汀的質(zhì)量濃度[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2015,32(10):801-807.

[14]尚德為,倪曉佳,張明,等.HPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中阿戈美拉汀的濃度[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2013,29(4):366-369.

Simultaneous determination of agomelatine and two of its metabolites in human plasma by LC-MS/MS

CAO Yuan

(Department of Pharmacy,Baoji People′s Hospital,Baoji 721000,China)

Objective To establish a method for the simultaneous determination of agomelatine,7-desmethyl-agomelatine and 3-hydroxy-agomelatine in human plasma.Methods The LC-MS/MS method was used with phenacetin as internal standard,and the determination was performed on Phenomenex ODS-3 column with 0.2% ammonium formate+100% water-methanol (30∶70) as the mobile phase.Agomelatine (244.1→185.1),7-desmethyl-agomelatine (260.1→201.1) and 3-hydroxy-agomelatine (180.1→110.1) were detected by electrospray ionization (ESI) with positive ion in MRM mode quantitatively.Results The linear range was good within 0.045 7～100 ng/mL of agomelatine,0.137 2～300 ng/mL of 7-desmethyl-agomelatine and 0.457 2～1 000 ng/mL of 3-hydroxy-agomelatine,respectively,and the lowest limits of quantitation were 0.045 7,0.137 2 and 0.457 2 ng/mL,respectively.The intra-day and inter-day precision and accuracy were all in line with the requirements of biological sample analysis.The plasma samples were stable after 3 freeze-thaw cycles and being stored for 4 h at room temperature and 90 d at -80 ℃.Conclusion The method is rapid,sensitive and repeatable,which can be used for the determination of plasma concentration and pharmacokinetic study.

Agomelatine;7-desmethyl-agomelatine;3-hydroxy-agomelatine;LC-MS/MS;Plasma concentration

2016-07-28

寶雞市人民醫(yī)院藥劑科，陜西 寶雞 721000

10.14053/j.cnki.ppcr.201703023