景巧麗，馬曉麗，裴雁曦

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

AtDES1基因在大白菜中的遺傳轉(zhuǎn)化

景巧麗，馬曉麗，裴雁曦*

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006)

[目的]硫化氫是繼一氧化氮和一氧化碳之后第三種氣體信號(hào)分子，在植物體的生長(zhǎng)發(fā)育和抵御外界脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來，環(huán)境污染日益嚴(yán)重，對(duì)大白菜的生長(zhǎng)發(fā)育過程產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。半胱氨酸脫巰基酶(DES1)是產(chǎn)生硫化氫的重要酶，將DES1基因整合入大白菜基因組，有可能提高其抗逆性，同時(shí)為白菜育種提供新種質(zhì)。[方法]本試驗(yàn)以中白60為材料，在已有的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上對(duì)種子的消毒時(shí)間、菌液侵染時(shí)間以及抗生素篩選壓進(jìn)行優(yōu)化，獲得有效的轉(zhuǎn)化體系。[結(jié)果]用0.1%的HgCl2對(duì)種子消毒6 min，既能保持較高的萌發(fā)率又能防止內(nèi)源菌的產(chǎn)生；用OD600為0.2～0.3的菌液侵染外植體5 min，分別以7.5 mg·L-1和5.0 mg·L-1的潮霉素作為抗性芽和根的抗生素篩選濃度，轉(zhuǎn)化效率較高，轉(zhuǎn)化率為6%。[結(jié)論]抗性植株經(jīng)PCR和qRT-PCR鑒定表明DES1基因已成功整合到大白菜基因組中且表達(dá)量有不同程度的提高。

大白菜； 硫化氫； 轉(zhuǎn)化； 轉(zhuǎn)基因植株

大白菜(BrassicacampestrisL.ssp.pekinensi)屬于十字花科蕓薹屬，是北方秋冬季主要的蔬菜作物。但近年來由于環(huán)境的污染，白菜種植遭受到重金屬、干旱和冷凍等多種逆境脅迫的影響，給大白菜生產(chǎn)造成很大損失。運(yùn)用基因工程手段培育優(yōu)良的抗逆蔬菜品種是解決這些問題的有效手段[1]。

本實(shí)驗(yàn)室先前已建立了比較有效的基于津育75為材料的大白菜轉(zhuǎn)化體系?；蛐捅尘皩?duì)大白菜的遺傳轉(zhuǎn)化效率影響嚴(yán)重[2]。因此，為提高本試驗(yàn)所選取的綜合性狀更符合育種目標(biāo)的中白60的轉(zhuǎn)化效率，需對(duì)已有遺傳轉(zhuǎn)化體系中種子的消毒時(shí)間、菌液侵染時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。另外，本試驗(yàn)所用表達(dá)載體含潮霉素抗性基因，還需對(duì)抗生素篩選濃度進(jìn)行優(yōu)化。

硫化氫(H2S)作為一種重要的氣體信號(hào)分子，在植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，例如抗旱[3]，抵御冷脅迫[4]和緩解重金屬毒害[5,6]等。植物體內(nèi)以半胱氨酸為底物產(chǎn)生H2S的酶有半胱氨酸脫巰基酶、半胱氨酸脫硫酶、β-氰丙氨酸合酶和 O-乙酰絲氨酸硫醇裂解酶[7]，其中L-半胱氨酸脫巰基酶1(DES1)被認(rèn)為是植物細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生內(nèi)源H2S的關(guān)鍵酶[8]，它可以以L-半胱氨酸為底物，分解產(chǎn)生H2S，并生成丙酮酸和NH3。它在植物發(fā)育的所有階段都有表達(dá)，尤其在植物的幼苗時(shí)期和成熟時(shí)期[9]。本試驗(yàn)旨在通過將DES1基因轉(zhuǎn)化入大白菜中白60，優(yōu)化適合該品種的轉(zhuǎn)化體系，以期獲得抗逆性增強(qiáng)的大白菜新種質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大白菜中白60種子由山西省農(nóng)科院蔬菜研究所提供；載體pET-28a-DES1和菌株LBA4404為本實(shí)驗(yàn)室保存；XF-246載體(含pCAMBIA1302骨架)為中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所曹曉風(fēng)研究員惠贈(zèng)，其T-DNA結(jié)構(gòu)見圖1；常規(guī)試劑購買于上海生工生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。

圖1 載體XF-246的T-DNA區(qū)Fig.1 The T-DNA of XF-246 vector

1.2 培養(yǎng)基的配制

參照吳玲玲的方法[2]并略作調(diào)整。

播種培養(yǎng)基：1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂；

預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+7 mg·L-1AgNO3；

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+7 mg·L-1AgNO3；

分化培養(yǎng)基：MS+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA+7 mg·L-1AgNO3+7.5 mg·L-1Hyg+200 mg·L-1Amp；

生根培養(yǎng)基：1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂+0.2 mg·L-1NAA+5 mg·L-1Hyg+200 mg·L-1Amp。

1.3 表達(dá)載體XF-246-DES1的構(gòu)建及鑒定

從pET-28a-DES1載體上用NcoⅠ和EcoRⅠ內(nèi)切酶切取DES1片段，切膠回收后，連接于用相同內(nèi)切酶消化的XF-246載體，具體操作方法參照《分子克隆》。

1.4 遺傳轉(zhuǎn)化基本過程

選取顆粒飽滿的大白菜種子，在超凈臺(tái)中，以本試驗(yàn)優(yōu)化的滅菌條件進(jìn)行處理，播種于1/2 MS培養(yǎng)基中，在溫度(23±1) ℃，光照時(shí)間16 h·d-1，光照強(qiáng)度3000 lx，60%的相對(duì)濕度下培養(yǎng)，5 d后獲得無菌苗，切取帶柄子葉作為外植體。用含有重組質(zhì)粒XF-246-DES1的農(nóng)桿菌LBA4404菌液，以本試驗(yàn)優(yōu)化的侵染時(shí)間處理5 min；處理后外植體在共培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d后接種到分化培養(yǎng)基；21 d后，將再生芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基；待再生植株根系發(fā)達(dá)后，煉苗移栽。詳細(xì)方法參照吳玲玲[2]。

1.5 大白菜遺傳轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

1.5.1 種子消毒時(shí)間

供試種子分成3組(每組30粒)，用70%乙醇消毒30 s后，用0.1%的HgCl2分別對(duì)種子處理4、6和8 min，5 d后觀察種子萌發(fā)和滅菌效果。

1.5.2 潮霉素篩選濃度

將外植體分為5組(每組30個(gè))，共培養(yǎng)2 d后，分別移到含有0，3.0，5.0，7.5和10.0 mg·L-1潮霉素的分化培養(yǎng)基中，21 d后統(tǒng)計(jì)再生芽分化率。

將2～3 cm的再生芽分為4組(每組30個(gè))，分別移到含有0，5.0，7.5和10.0 mg·L-1潮霉素的生根培養(yǎng)基中，21 d后觀察生根情況。

1.5.3 菌液侵染時(shí)間

將帶柄子葉預(yù)培養(yǎng)2 d后，分成5組(每組30個(gè))，分別在OD600為0.2～0.3的農(nóng)桿菌菌液中侵染0、3、5、7和10 min，于培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2 d，將外植體移到分化培養(yǎng)基中，21 d后統(tǒng)計(jì)抗性芽分化情況。

1.6 抗性植株的分子檢測(cè)

分別提取野生型和潮霉素抗性植株的基因組DNA，以DES1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定,引物序列為Forward primer: CATGCCATGGAAGACCGCGTC；Reverse primer：CCGGAATTCTCATTCAACTGGC。提取潮霉素抗性植株和對(duì)照植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，用qRT-PCR分析目的基因DES1的表達(dá)情況，引物序列為Forward primer：ACCTCTGCACCTAATGCTCTT；Reverse primer：GATTGAGGCAACGGGTGGTAA。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 表達(dá)載體XF-246-DES1的構(gòu)建及鑒定

以限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和EcoRⅠ對(duì)載體pET-28a-DES1進(jìn)行酶切，膠回收972 bp 的DES1片段，連接于具有同樣粘性末端的XF-246，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α后，以菌液為模板進(jìn)行PCR，特異地?cái)U(kuò)增出972 bp大小的條帶(圖2A)。對(duì)鑒定正確的菌液進(jìn)行小量提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定，可見線性載體和972 bp大小的條帶(圖2B)。證明載體XF-246-DES1構(gòu)建成功。

圖2 重組載體XF-246-DES1的鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid XF-246-DES1 注：A：含重組載體XF-246-DES1的大腸桿菌DH5α菌液PCR鑒定 M：DL2000；CK：ddH2O PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；DES1：cDNA PCR產(chǎn)物(陽性對(duì)照)；1～5：菌液PCR產(chǎn)物；B：酶切鑒定重組質(zhì)粒 M：DL2000 marker；1：NcoⅠ和EcoRⅠ酶切產(chǎn)物。Note： A: Identification of Escherichia coli DH5α with plasmid XF-246-DES1 M: DL2000 marker; CK: Products of ddH20 with PCR(negative control); DES1: Products of cDNA with PCR(positive control); Lane1～5: Products of bacterium suspension with PCR; B: Enzyme digestion of the recombinant plasmid; M: DL2000 marker; Lane1: Digested products with NcoⅠand EcoRⅠ.

2.2 農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化及鑒定

將表達(dá)載體XF-246-DES1轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，菌液PCR鑒定，檢測(cè)出大約972 bp大小的條帶(圖3)，說明質(zhì)粒XF-246-DES1已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LBA4404中。

圖3 含有重組質(zhì)粒XF-246-DES1的農(nóng)桿菌LBA4404菌液PCR鑒定Fig.3 Identification of Agrobacterium LBA4404 with plasmid XF-246-DES1 注：M：DL2000；CK：ddH2O PCR產(chǎn)物(陰性對(duì)照)；DES1：cDNA PCR產(chǎn)物(陽性對(duì)照)；1～3：菌液PCR產(chǎn)物。Note： M: DL2000 Marker; CK: Products of ddH20 with PCR(negative control); DES1: Products of cDNA with PCR(positive control); Lane 1～3: Products of bacterium suspension with PCR.

2.3 影響遺傳轉(zhuǎn)化的因素

2.3.1 種子的消毒時(shí)間

用0.1% HgCl2對(duì)種子進(jìn)行不同時(shí)間的滅菌，5 d后種子的萌發(fā)狀況及后續(xù)培養(yǎng)過程中內(nèi)源菌生長(zhǎng)情況見表1。

2.3.2 不同濃度的潮霉素對(duì)不定芽的影響

大白菜外植體對(duì)于潮霉素十分敏感，因此合適的篩選壓對(duì)于抗性篩選很關(guān)鍵。最適潮霉素濃度篩選標(biāo)準(zhǔn)為：能有效抑制非轉(zhuǎn)花苗的生長(zhǎng)，但對(duì)轉(zhuǎn)化苗無明顯影響。本試驗(yàn)對(duì)分化培養(yǎng)基中潮霉素濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果如圖4和圖5，隨著潮霉素濃度的增大，不定芽的分化率降低；當(dāng)濃度達(dá)到10.0 mg·L-1時(shí)，不定芽被完全抑制，外植體基部嚴(yán)重褐化甚至死亡。所以本試驗(yàn)選取7.5 mg·L-1潮霉素作為不定芽最適篩選濃度。

表1 HgCl2滅菌時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)及滅菌效果的影響

Table 1 The effect of HgCl2sterilization time on seed germination and efficiency of sterilization

消毒時(shí)間/minSterilizationtime萌發(fā)率/%Germinationrate污染率/%Contaminationrate492.768%690.915%872.713%

圖4 不同濃度的潮霉素對(duì)不定芽的影響Fig.4 The effect of different concentration of hygromycin on the adventitious shoot

圖5 不同濃度的潮霉素對(duì)不定芽生長(zhǎng)狀況的影響Fig.5 The effect of different concentration of hygromycin on growth status of the adventitious shoot

2.3.3 不同濃度的潮霉素對(duì)不定根的影響

將獲取的抗性芽接入含有不同濃度潮霉素的生根培養(yǎng)基中，21 d后不定根生長(zhǎng)結(jié)果如圖6，隨著潮霉素濃度的增大，不定根的生長(zhǎng)受到不同程度的影響，在5.0 mg·L-1時(shí)，根的生長(zhǎng)明顯受到了抑制，但沒有完全被抑制。因此，本試驗(yàn)以5.0 mg·L-1作為不定根的抗生素篩選壓。

圖6 不同濃度的潮霉素對(duì)不定根的影響Fig.6 The effect of different concentration of hygromycin on adventitious root

圖7 侵染時(shí)間對(duì)于抗性芽分化的影響Fig.7 The effect of infection time on the differentiation rate of resistant shoot

2.3.4 侵染時(shí)間的篩選

將預(yù)培養(yǎng)2 d的帶柄子葉在菌液中分別侵染不同的時(shí)間，共培養(yǎng)2 d后移至分化培養(yǎng)基中，21 d后抗性芽分化情況見圖7。當(dāng)侵染時(shí)間為0 min時(shí)，無抗性芽的形成；隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，抗性芽分化率逐漸升高。在本試驗(yàn)的幾個(gè)處理中，侵染5 min時(shí)，分化率最高；當(dāng)侵染時(shí)間延長(zhǎng)至7～10 min時(shí)，外植體逐漸褐化，抗性芽分化率降低；侵染10 min時(shí)，抗性芽的產(chǎn)生受到嚴(yán)重抑制。因此，本試驗(yàn)選擇5 min作為菌液最佳侵染時(shí)間。

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

將已擁有健壯根的再生植株在三角瓶中煉苗7 d左右，移至裝有已滅菌基質(zhì)土的培養(yǎng)缽中，用塑料膜覆蓋3 d左右揭膜，正常培養(yǎng)。再生植株的整個(gè)生長(zhǎng)過程如圖8所示。

圖8 轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育的不同時(shí)期Fig.8 The different stage of transgenic plants 注：A：外植體；B：再生植株；C：不定根；D：再生植株的移栽。Note: A: Cotyledon; B: Regenerated plants; C: Adventitious root; D: Transplantation of regenerated plants.

2.5 轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

對(duì)50個(gè)帶柄子葉外植體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，共獲得了3株抗性植株，經(jīng)PCR鑒定，3株抗性植株DES1基因擴(kuò)增全部呈陽性，轉(zhuǎn)化率為6%。經(jīng)qRT-PCR分析，與野生型相比，z1，z2，z3轉(zhuǎn)化植株中DES1表達(dá)量分別提高1、123、38倍；PCR和qRT-PCR分析結(jié)果分別見圖9和圖10。

圖9 抗性植株的PCR檢測(cè)Fig.9 The PCR test on the resistant plants 注：M：DL2000；D：陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株；DES1：DES1基因；z1～z3：轉(zhuǎn)基因植株。Note: M: DL2000 Marker; D: Negative control; CK: The untransformed plants; DES1: DES1 gene; z1～z3: The transformed plant.

圖10 不同轉(zhuǎn)基因植株DES1的表達(dá)量Fig.10 The expression of DES1 in different transgenic plants 注：**表示轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株間在0.01水平存在顯著性差異。Note: **stands for significant difference between transgenic plants and untransgenic plants.

3 討論與結(jié)論

獲得無菌苗是轉(zhuǎn)化過程的第一步，不同物種不同基因型背景材料間，對(duì)滅菌方式和時(shí)間敏感程度千差萬別。恰當(dāng)?shù)臏缇鷷r(shí)間是保證高萌發(fā)率低污染率的關(guān)鍵，滅菌時(shí)間過短，種子萌發(fā)率高，但由于殺菌不徹底，后續(xù)培養(yǎng)過程中易生內(nèi)源菌；滅菌時(shí)間過長(zhǎng)，種子萌發(fā)過程中的淀粉酶、蛋白酶以及脂肪酶的活性易受到抑制，導(dǎo)致種子活力降低。本試驗(yàn)對(duì)大白菜中白60種子消毒6 min，種子萌發(fā)率高且后期污染率底，而本實(shí)驗(yàn)室已有研究中對(duì)津育75種子滅菌4 min。這說明不同遺傳背景的材料對(duì)HgCl2的敏感度差異很大。

影響大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素除了種子滅菌時(shí)間外，還有預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、菌液侵染時(shí)間以及共培養(yǎng)時(shí)間等。有報(bào)道認(rèn)為大白菜轉(zhuǎn)化過程中對(duì)外植體預(yù)培養(yǎng)2～3 d[10～12]、菌液OD600=0.2～0.5[2,10,13]、共培養(yǎng)2～3 d[11,14，15]時(shí)，對(duì)于不同大白菜品種轉(zhuǎn)化差異不大。目前只有范正棋[16]認(rèn)為對(duì)青菜外植體共培養(yǎng)5 d轉(zhuǎn)化效率較高。但農(nóng)桿菌菌液侵染時(shí)間依品種不同差異較大，不能普遍適用。Bhuiyan MSU等[17]認(rèn)為用農(nóng)桿菌菌液侵染芥菜子葉15 min轉(zhuǎn)化效果最佳；吳玲玲等[2]用菌液侵染大白菜子葉3 min得到較高的轉(zhuǎn)化率；張鳳蘭[14]用菌液侵染白菜外植體15 min轉(zhuǎn)化效率較高。本文選用5 min作為菌液最佳侵染時(shí)間，與以上結(jié)果不同[2,14,17]，這可能是由于不同物種及同一物種不同基因型外植體對(duì)轉(zhuǎn)化過程中侵染時(shí)間的要求存在顯著差異。

合適的抗生素篩選壓是轉(zhuǎn)化成功的另一關(guān)鍵因素。潮霉素常被用作大白菜轉(zhuǎn)化的篩選劑，但是大白菜對(duì)于潮霉素非常敏感。選擇濃度過高，易造成外植體褐化甚至死亡；濃度過低，外植體易產(chǎn)生耐受性，形成大量的逃逸體，導(dǎo)致最后篩選轉(zhuǎn)基因植株工作量加大，假陽性率明顯升高。張蕊等[18]以5.0 mg·L-1潮霉素作為大白菜津育60 轉(zhuǎn)化的抗生素篩選濃度；張曉東等[19]認(rèn)為在分化培養(yǎng)基中添加10.0 mg·L-1潮霉素對(duì)大白菜抗性芽的篩選最有效。徐娟[20]以17.5 mg·L-1作為甘藍(lán)型油菜后期對(duì)轉(zhuǎn)化苗的篩選壓；謝建坤等[21]探討白菜抗蟲基因轉(zhuǎn)化受體體系時(shí)，潮霉素的選擇濃度為20.0 mg·L-1。本試驗(yàn)確定中白60再生芽和根的潮霉素篩選濃度分別為7.5 mg·L-1和5.0 mg·L-1，這與之前報(bào)道中的植物材料有明顯差異，可能是不同基因型背景對(duì)潮霉素的敏感度存在差異所導(dǎo)致。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)再生芽和根的篩選壓也存在差異，這可能是不同組織器官的發(fā)育過程差異造成的。

總之，大白菜中白60帶柄子葉轉(zhuǎn)化最適條件是：對(duì)種子滅菌6 min，預(yù)培養(yǎng)2 d，OD600=0.2～0.3的菌液中侵染5 min，共培養(yǎng)2 d，分別以7.5 mg·L-1和5.0 mg·L-1潮霉素作為再生芽和根的最適抗生素篩選濃度。

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[19]張曉東,李利斌,宋宜現(xiàn),等.大白菜高效穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(2):1-7.

[20]徐娟.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜的研究[D].河南鄭州大學(xué)生物工程系,2010.

[21]謝建坤,崔海瑞,舒慶堯,等.白菜抗蟲基因轉(zhuǎn)化受體體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào),2001,28(2):175-176.

(編輯：邢國(guó)芳)

The genetic transformation of Chinese cabbage withDES1 gene

Jing Qiaoli, Ma Xiaoli, Pei Yanxi*

(CollegeofLifeScience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006，China)

[Objective]Hydrogen sulfide, considered as the third gasotrasmitter after nitric oxide and carbonic oxide, is playing a significant role in plant developmental processes and defenses. In recent years, with the increased environmental pollution, the growth and developmental processes of Chinese cabbage have been seriously inhibited. L-cysteine desulfhydrase (DES1) is an important enzyme to produce hydrogen sulfide. IntegratingDES1 into cabbage genome can not only increase its stress resistance, but provide cabbage breeding with new germplasm. [Methods]On the basis of the existed transformation system, this study using ‘zhongbai 60’ as material optimized the seed sterilization time, microbial infection time and antibiotics concentration, so as to acquire an efficient transgenic system. [Results]The results indicated that seeds disinfectived with 0.1% HgCl2for 5 min could maintain a higher rate of germination and it could also prevent the formation of endogenous bacteria simultaneously. When the explants were immersed in bacterium concentration of OD600=0.2～0.3 for 5 min and 7.5 mg·L-1and 5.0 mg·L-1were respectively resgarded as the resistant selection pressure for shoots and roots, the transformation rate reached up to 6%. [Conclusion]The results of PCR and qRT-PCR turned out thatDES1 was successfully integrated into the genome of Chinese cabbage, meanwhile, the expression ofDES1 has improved in different degrees.

Chinese cabbage， Hydrogen sulfide， Transformation， Transgenic plant

2016-09-14

2016-11-29

景巧麗(1992-)，女(漢)，山西晉城人，碩士研究生，研究方向：植物細(xì)胞分子生物學(xué)

*通信作者：裴雁曦，教授，博士生導(dǎo)師.Tel:13934559401;E-mail:peiyanxi@sxu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372085)

Q785

A

1671-8151(2017)03-0177-06