鄭淵潔，郝建宇，侯紅萍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

生物預(yù)處理秸稈降解木質(zhì)素條件的優(yōu)化

鄭淵潔，郝建宇，侯紅萍*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]優(yōu)化黃孢原毛平革菌生物預(yù)處理降解玉米秸稈中木質(zhì)素的條件。[方法]通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，分析不同pH、溫度、接種量和時(shí)間對(duì)黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素的影響。[結(jié)果]黃孢原毛平革菌降解玉米秸稈木質(zhì)素的最適條件為：溫度32 ℃，pH=6,接種量10片，時(shí)間15 d。[結(jié)論] 在最適條件下，還原糖得率由0.47 g·L-1提高到0.79 g·L-1。本研究可提高玉米秸稈中纖維素的利用率可用于后續(xù)研究。

木質(zhì)素； 黃孢原毛平革菌； 降解率； 玉米秸稈

農(nóng)作物秸稈富含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，是一種產(chǎn)量豐富的可再生資源。木質(zhì)素和半纖維素以共價(jià)鍵的形式結(jié)合將纖維素分子包裹，且結(jié)構(gòu)較為緊密，阻礙纖維素酶與纖維素接觸，影響秸稈的降解速率。木質(zhì)素是影響秸稈利用率的主要因素[1,2]。一定的條件下，纖維素可以被水解為單糖，通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，提高農(nóng)作物秸稈的利用率[3]。白腐菌分泌木質(zhì)素降解酶系，降解木質(zhì)素能力較強(qiáng)。適宜條件下，白腐菌分泌的酶降解秸稈表面的蠟質(zhì)層，隨后產(chǎn)生纖維素酶、半纖維素酶、過(guò)氧化物酶系，使木質(zhì)素徹底降解[4,5]。黃孢原毛平革菌是白腐菌中降解能力較強(qiáng)的一種[6]。諸多研究表明，白腐菌處理后的秸稈，大部分的木質(zhì)素可被降解，碳水化合物轉(zhuǎn)化為單糖更加迅速，有利于后續(xù)酶的進(jìn)行[7,8]。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃孢原毛平革菌：購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心CICC。

1.2 原料

玉米秸稈，取自山西省太谷縣，剪至1 cm長(zhǎng)度，80 ℃烘干至恒重。

1.3 培養(yǎng)基

黃孢原毛平革菌平板培養(yǎng)基：馬鈴薯提取液1.0 L，葡萄糖20 g， KH2PO43 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂15 g，酵母膏0.1 g，pH自然。

黃孢原毛平革菌液體培養(yǎng)基:液體培養(yǎng)基[9]，5 g秸稈，5 g麩皮。

1.4 液體菌種的制備

活化的黃孢原毛平革菌接種至平板培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)4 d，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，采用直徑8 mm已滅菌的打孔器打孔，得菌餅。將獲得的菌餅接種于100 mL/250 mL三角瓶中。

1.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 接種量秸稈木質(zhì)素降解率的影響

設(shè)置不同接種量5、10、15、20、25、30片，溫度為32 ℃，初始pH為5。將菌餅接分別接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，重復(fù)試驗(yàn)3次，140 r·min-1培養(yǎng)10 d，計(jì)算木質(zhì)素降解率，求平均值。

1.5.2 溫度對(duì)秸稈木質(zhì)素降解率的影響

設(shè)置不同培養(yǎng)溫度28、30、32、34 ℃，初始pH值為5，接種量為10片。將菌餅分別接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，重復(fù)試驗(yàn)3次，140 r·min-1培養(yǎng)10 d，計(jì)算木質(zhì)素降解率，求平均值。

1.5.3 pH對(duì)秸稈木質(zhì)素降解率的影響

設(shè)置不同初始pH 3、4、5、6，固定培養(yǎng)溫度為32 ℃。接種量為10片。將菌餅分別接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，重復(fù)試驗(yàn)3次，140 r·min-1培養(yǎng)10 d，計(jì)算木質(zhì)素降解率，求平均值。

1.5.4 時(shí)間對(duì)秸稈木質(zhì)素降解率的影響

固定pH為5，接種量為10片。將菌餅接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，重復(fù)試驗(yàn)3個(gè)，140 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)，分別在第5、10、15、20、25、30天計(jì)算木質(zhì)素降解率，求平均值。

1.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

Table 1 L9 (34) Factors and levels of L9 (34)experiments

水平Levels因素Factors接種量/片InoculumsizepH溫度/℃Temperature18430210532312634

1.7 木質(zhì)素含量的測(cè)定

[10]。

1.8 還原糖含量的測(cè)定

DNS法測(cè)定還原糖含量[11]。

1.9 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別向試管中加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 1 g·mL-1葡萄糖溶液，分別加入3 mLDNS溶劑，加熱煮沸5 min,冷卻，定容至25 mL，搖勻，于波長(zhǎng)540 nm[12]處測(cè)定吸光值，以含糖量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)曲，得曲線方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖1可見(jiàn)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為：y=0.561 5x+0.017 9，擬合度R2=0.992 21，表明此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

2.2 接種量對(duì)木質(zhì)素降解率的影響

由圖2可見(jiàn)，接種量對(duì)秸稈中木質(zhì)素降解率的影響先增加后降低，在10片時(shí)達(dá)到峰值43%，20片時(shí)降解率最低38%。接種量在10片時(shí)菌絲體生物量與降解底物達(dá)到最適搭配，過(guò)少底物不能充分接觸菌絲體，接種過(guò)多菌絲體底物不能充分利用，菌絲生長(zhǎng)占據(jù)了主導(dǎo)地位。

圖2 接種量對(duì)木質(zhì)素降解率的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on degradation rate of lignin

2.3 溫度對(duì)木質(zhì)素降解率的影響

由圖3可見(jiàn)，溫度對(duì)黃孢原毛平革菌降解秸稈木質(zhì)素的影響呈鐘罩形曲線，隨著溫度的升高降解率先升高而后降低，在32 ℃是達(dá)到最大值，降解率達(dá)到44%。降解木質(zhì)素是通過(guò)酶起作用，32 ℃為最適宜溫度。

2.4 pH對(duì)木質(zhì)素降解率的影響

由圖4可見(jiàn)，初始pH對(duì)黃孢原毛平革菌降解秸稈木質(zhì)素的影響呈鐘罩形曲線，即隨著pH的升高，降解率先升高而后降低，在初始pH為5時(shí)降解率達(dá)到最大值43%。黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素的酶為酸性酶系，最適初始pH為5。

2.5 時(shí)間對(duì)木質(zhì)素降解率的影響

由圖5可見(jiàn)，在接種5 d時(shí)，木質(zhì)素降解率較低，此時(shí)黃孢原毛平革菌處于生長(zhǎng)繁殖期。處理10 d、15 d以木質(zhì)素的降解率明顯增高。此時(shí)，黃孢原毛平革菌大量形成，開(kāi)始作用于底物，起降解作用。木質(zhì)素降解的最佳時(shí)間為15 d。

圖5 時(shí)間對(duì)木質(zhì)素降解率的影響Fig.5 Effect of time on lignin degradation rate

2.6 降解木質(zhì)素正交試驗(yàn)結(jié)果

黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素的過(guò)程中，接種量、溫度、pH、時(shí)間都對(duì)降解率有影響。以木質(zhì)素降解率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)方差分析

由單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)可以得出黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素影響因素的大小依次為：A、C、B即接種量>pH>溫度，最佳條件為A2B2C3，即接種量10片，溫度32 ℃，pH=6，在最優(yōu)條件下木質(zhì)素降解率達(dá)到47%。

2.7 還原糖含量的測(cè)定

黃孢原毛平革菌發(fā)酵秸稈15天，接入8%的纖維素酶液，繼續(xù)培養(yǎng)6天，測(cè)得還原糖含量0.79 g·L-1。對(duì)比組前15天未加入黃孢原毛平革菌，后接入8%纖維素酶發(fā)酵6天，測(cè)得還原糖含量0.47 g·L-1。

3 結(jié)論

黃孢原毛平革菌降解秸稈中木質(zhì)素的影響因素很多，主要研究了接種量、溫度、pH、時(shí)間4個(gè)因素。通過(guò)優(yōu)化黃孢原毛平革菌降解木質(zhì)素的條件，得到最優(yōu)發(fā)酵條件：最佳條件為：接種量10片，pH=6，溫度32 ℃，接種時(shí)間為15天。黃孢原毛平革菌最優(yōu)條件下發(fā)酵培養(yǎng)15天后接入纖維素酶混合菌降解纖維素，還原糖得率較未優(yōu)化前由0.47 g·L-1提高到0.79 g·L-1。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]趙林果,金耀光,李強(qiáng),等.白腐菌及黑曲霉所產(chǎn)纖維素復(fù)合酶對(duì)稻草秸稈的生物降解[J].中國(guó)生物工程雜志,2007,27(3):71-75.

[2]楊世關(guān)，李繼紅，孟卓，等.木質(zhì)纖維素原料厭氧生物降解研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2006,22(增刊Ⅰ):120-124

[3]張立霞,纖維降解菌組合的篩選、優(yōu)化及對(duì)玉米秸稈的降解效果[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2014.

[4]張玉輝,肖文顯,賈翠英,等.黃孢原毛平革菌降解玉米秸稈禪堂條件的優(yōu)化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(11):5857-5859.

[5]王偉,白腐菌預(yù)處理與酶解轉(zhuǎn)化楊木研究[D].北京：北京林業(yè)大學(xué)，2014.

[6]徐偉,王金鳳,范洪臣,等.黃孢原毛平革菌發(fā)酵稻草秸稈降解木質(zhì)素的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2014(11):10-16.

[7]王義剛，吳淑芳，劉剛，等.白腐菌預(yù)處理對(duì)稻草化學(xué)組分及酶水解的影響[J].纖維素科學(xué)與技術(shù),2013,21(3);16-22.

[8]許敬亮,尹依婷,張宇,等.白腐菌預(yù)處理稻草秸稈對(duì)Z28產(chǎn)纖維素酶的影響[J].太陽(yáng)能學(xué)報(bào)，2010,31(8):955-957.

[9]張慧芳，混菌發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[10]王金主,王元秀,李峰,等.玉米秸稈中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測(cè)定[J].山東食品發(fā)酵,2010,3：44-47.

[11]齊香君,茍金霞,韓戌珺,等.3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定溶液中還原糖的研究[J].纖維素科學(xué)與技術(shù),2004,12(3):17-19.

[12]杜蘇萌,趙金安,等.利用黑曲霉和酵母共發(fā)酵秸稈產(chǎn)乙醇的研究[J].太原師范學(xué)院(自然科學(xué)版),2012,11(3):132-134.

(編輯：馬榮博)

Optimization of lignin degradation conditions for biological pretreatment of corn straw

Zheng Yuanjie, Hao Jianyu, Hou Hongping*

(CollegeofFoodScienceandEngineering，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801,China)

[Objective]The research aimed to optimize the conditions of corn straw degradstion byPhanerochaetechrysosporium.[Methods]Influences of different pH,temperatures.inoculum concentration and time of degradstion ofPhanerochaetechrysosporiumwere analyzed by respectively using single factor design and orthogonal design. [Results]The optimum conditions for the degradation of lignin were as follow: the temperature 32 ℃,the initial pH 6,the inoculum concentration 10 piece,10 days.[Conclusion]Under the optimum conditions,the yield of reducing sugar increased from 0.47 g·L-1to 0.79 g·L-1.The research can improve the utilization ratio of cellulose in corn straw, and further apply to the next step.

Lignin， Phanerochaete chrysosporium， Degradation rate， Corn straw

2016-08-24

2016-11-09

鄭淵潔(1991-)，女(漢)，山西太原人，碩士，研究方向：食品微生物與發(fā)酵技術(shù)

*通信作者：侯紅萍，教授，研究生導(dǎo)師，Tel:15934425958，E-mail:sphhping@126.com

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.201403110192)

Q93-335

A

1671-8151(2017)03-0214-03