劉亞莉+易佳麗+劉春英

[摘要] 探討補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549/DDP移植瘤裸鼠中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR表達(dá)的影響。BALB/C裸鼠60只隨機(jī)分為空白對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組、順鉑組和補(bǔ)中益氣湯高劑量+順鉑組（高聯(lián)組）、補(bǔ)中益氣湯中劑量+順鉑組（中聯(lián)組）、補(bǔ)中益氣湯低劑量+順鉑組（低聯(lián)組），培養(yǎng)A549/DDP細(xì)胞（濃度為5×106個(gè)/mL），接種于各組，觀察各組成瘤情況。給予相應(yīng)治療，14 d后取瘤組織固定、切片，免疫組織化學(xué)方法、Real-time PCR方法檢測(cè)各組裸鼠移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR 蛋白和mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示補(bǔ)中益氣湯聯(lián)合順鉑可降低移植瘤體積，中聯(lián)組和高聯(lián)組的抑瘤率與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與荷瘤對(duì)照組比較，中聯(lián)組和高聯(lián)組Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的蛋白和mRNA的表達(dá)明顯減少（P<0.05），caspase-9的蛋白和mRNA在中聯(lián)組和高聯(lián)組的表達(dá)逐漸增多，與荷瘤對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Bad，NF-κB，caspase-9的mRNA，中聯(lián)組和高聯(lián)組與順鉑組、低聯(lián)組、荷瘤對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低聯(lián)組、順鉑組、荷瘤對(duì)照組兩兩比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，各因子蛋白和mRNA的表達(dá)中聯(lián)組和高聯(lián)組比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明補(bǔ)中益氣湯與順鉑聯(lián)合作用可抑制A549/DDP移植瘤的生長(zhǎng)，補(bǔ)中益氣湯抑制A549/DDP移植瘤的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR，促進(jìn)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 補(bǔ)中益氣湯； A549/DDP； 裸鼠； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

[Abstract] This study was aimed to explore the effects of Buzhong Yiqi decoction on the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR in nude mice with A549/DDP transplantation tumors.Sixty BALB/C mice were randomly divided into blank control group， tumor-bearing control group， cisplatin group and Buzhong Yiqi decoction of high， medium and low doses+cisplatin groups （hereinafter referred to as the high，medium and low combined groups）. A549/DDP cells （concentration of 5×106 cells/mL）were cultured and inoculated in various groups， then the tumor-forming situations were observed. Corresponding treatment was given in all groups. Fourteen days later， immunohistochemistry and Real-time PCR methods were used to detect the expression levels of Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， mTOR protein and mRNA in tumors.Results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin could reduce the volume of transplanted tumors， and there was significant difference between medium combined group and high combined group（P<0.05）. As compared with the tumor-bearing control group， the expression levels of Bad， NF-κB， Survivin and mTOR were significantly reduced in medium and high combined groups（P<0.05）； the protein and mRNA expression levels of caspase-9 were gradually increased in medium combined and high combined groups（P<0.05）， with statistical difference with tumor-bearing control group（P<0.05）. There were statistical difference in mRNA expression of Bad， NF-κB and caspase-9 between medium combined group， high combined group and cisplatin group， low-combined group， tumor-bearing control group（P<0.05）， but there was no statistical difference between cisplatin group， low-combined group， and tumor-bearing control group. In addition， there was no statistical difference between medium combined group and high combined group in protein and mRNA expression levels of various factors. Experimental results showed that Buzhong Yiqi decoction combined with cisplatin can inhibit the growth of A549/DDP transplanted tumors， and the mechanism may be associated with regulating Bad， NF-κB， caspase-9， Survivin， and mTOR levels as well as promoting apoptosis.

[Key words] Buzhong Yiqi decoction； A549/DDP； nude mice； Bad； NF-κB； caspase-9； Survivin； mTOR

肺癌已成為威脅居民健康的主要疾病之一，其發(fā)病率的上升趨勢(shì)與吸煙等不良生活方式的增多、空氣質(zhì)量下降等因素有關(guān)[1]。肺癌作為腫瘤死亡的首要原因，受到全世界的廣泛研究。肺癌由于不易及早發(fā)現(xiàn)，在失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)時(shí)就只能以放、化療為主?；煹目陀^有效率約30%，中位生存期8～10個(gè)月，1年生存率30%～40%，且不良反應(yīng)較嚴(yán)重，多數(shù)患者難以完成有效的治療周期[2]。袁惠芳等[3]發(fā)現(xiàn)采用培美曲塞聯(lián)合鉑類方案治療晚期肺癌時(shí)加以補(bǔ)中益氣湯輔助，可在一定程度上提高聯(lián)合用藥療效，并明顯減輕化療所致胃腸反應(yīng)，降低不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，提高患者治療期間生活質(zhì)量。劉明等[4]研究發(fā)現(xiàn)化療聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯加減在治療中晚期非小細(xì)胞肺癌時(shí)臨床療效有所提高，而且在明顯改善患者生活質(zhì)量的基礎(chǔ)上有效降低骨髓抑制的發(fā)生率。

本研究將人肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP細(xì)胞接種裸鼠，制備成荷瘤模型，用不同濃度的補(bǔ)中益氣湯和順鉑進(jìn)行干預(yù)，將順鉑作為陽(yáng)性對(duì)照，采用一般性觀察、免疫組織化學(xué)、Real-time PCR等方法，評(píng)價(jià)補(bǔ)中益氣湯對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的影響，并探討其作用機(jī)制，為應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯干預(yù)肺癌順鉑耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞 BALB/C裸鼠，SPF級(jí)，5周齡，雌雄各半，體重（20±2） g，購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001，A549和A549/DDP細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究中心細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物制備 補(bǔ)中益氣湯生藥購(gòu)于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房，組成參照《方劑學(xué)》新世紀(jì)版規(guī)定，按“動(dòng)物與人體的每千克體重劑量折算系數(shù)表”[5]，計(jì)算裸鼠的等效劑量，按成人日推薦量的2，1，1/2倍設(shè)置高、中、低劑量組。常規(guī)煎制成每毫升含生藥3.939，1.970，0.985 g。

1.3 儀器及試劑 formaUL-1168751H CO2孵育箱（Thermo Fisher Scientific美國(guó)）；PE 9700PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)）；KOHTRON高速低溫離心機(jī)（瑞典）；BT-31恒溫水浴振蕩儀（日本，KAMAMOTO）；紫外分光光度計(jì)（英國(guó)UV-visible Spectrometer，UV300）。Survivin抗體、mTOR抗體（南京凱基生物技術(shù)有限公司），鼠抗人Bad，NF-κB，caspase-9單克隆抗體（PTGLAB公司），Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR熒光定量PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，引物合成由北京華大基因公司提供。注射用順鉑（齊魯制藥廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)2030132DB）。

2 方法

2.1 細(xì)胞懸液配制人肺腺癌耐藥細(xì)胞株 A549/DDP按常規(guī)5%CO2，37 ℃孵育箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，0.25%胰蛋白酶消化，3～4 d傳代1次。傳代擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)量至足夠時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A549/DDP細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸液，1 000 r·min-1離心5 min，去上清液，以PBS洗滌，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，制備成A549/DDP細(xì)胞懸液。

2.2 移植瘤制備及標(biāo)本收集 60只裸鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組：①空白對(duì)照組，②荷瘤對(duì)照組，③順鉑組，④補(bǔ)中益氣湯高劑量+順鉑組（高聯(lián)組），⑤補(bǔ)中益氣湯中劑量+順鉑組（中聯(lián)組），⑥補(bǔ)中益氣湯低劑量+順鉑組（低聯(lián)組），每組10只。①組裸鼠給予腹股溝皮下接種0.2 mL/只生理鹽水；②～⑥組裸鼠給予腹股溝皮下接種A549/DDP細(xì)胞懸液0.2 mL/只。觀察各組成瘤情況，待肉眼觀察到移植瘤出現(xiàn)時(shí)，空白對(duì)照組、荷瘤對(duì)照組給予生理鹽水0.5 mL灌胃；順鉑組給予等量生理鹽水灌胃的同時(shí)，腹腔注射順鉑2 mg·kg-1；高聯(lián)組、中聯(lián)組、低聯(lián)組分別給予高、中、低濃度的補(bǔ)中益氣湯0.5 mL灌胃，同時(shí)腹腔注射順鉑2 mg·kg-1，每日1次，14 d后，無(wú)菌剝離瘤體，稱瘤重，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤最大長(zhǎng)徑（a）和橫徑（b），瘤體標(biāo)本部分用10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，免疫組化檢測(cè)；部分迅速置于-80 ℃冰箱保存，做Real-time PCR。

2.3 免疫組化方法檢測(cè)移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR的表達(dá) 取出固定樣本，經(jīng)常規(guī)脫水，透明、浸蠟，包埋后，將每個(gè)樣本蠟塊連續(xù)切片3張，每張厚約4～5 μm。切片常規(guī)脫蠟至水，PBS清洗5 min，2次，高壓熱修復(fù)，內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，PBS清洗5 min，2次，加一抗37 ℃孵育1 h，PBS清洗5 min，2次，加二抗37 ℃孵育45 min，PBS清洗5 min，2次，DAB顯色，透明后封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組。免疫組化結(jié)果采用Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在400倍高倍鏡下，分別測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的總面積（Area） 和積分光密度（IOD），求出平均光密度（AOD）。

2.4 Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)各組移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR mRNA的表達(dá) 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，PCR 引物見(jiàn)表1。取各組樣品，分別進(jìn)行總RNA的提取，待樣本純度檢測(cè)計(jì)算合格后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s，1個(gè)循環(huán)。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃ 0.5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)；PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20 μL。各基因完成PCR擴(kuò)增循環(huán)后，進(jìn)行產(chǎn)品熔解曲線分析，以確定產(chǎn)品純度。根據(jù)PCR產(chǎn)物熔解曲線的平均熔解溫度確定產(chǎn)物的純度。根據(jù)系統(tǒng)給出數(shù)值，計(jì)算各組mRNA的表達(dá)比率，進(jìn)行分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示。各組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，方差齊時(shí)，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法；不符合參數(shù)檢驗(yàn)者，采用多組計(jì)量資料秩和檢驗(yàn)。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)中益氣湯對(duì)荷瘤裸鼠一般狀況的影響 各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物活動(dòng)良好，未見(jiàn)明顯的拒食、不安、便溏現(xiàn)象。高聯(lián)組裸鼠體重與空白對(duì)照組比較，無(wú)明顯變化，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。致瘤率以實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，解剖出瘤組織并經(jīng)HE染色證明為標(biāo)準(zhǔn)，高聯(lián)組有2只，中聯(lián)組有1只，未出現(xiàn)瘤組織，從樣本含量上給予剔除。隨著補(bǔ)中益氣湯劑量的增加，移植瘤體積減小，高聯(lián)組、中聯(lián)組抑瘤率與順鉑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低聯(lián)組與順鉑組比較則無(wú)顯著差異，見(jiàn)表2。

3.2 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組移植瘤中Bad，NF-κB，caspase-9，Survivin，mTOR蛋白表達(dá) 各組Bad，NF-κB，Survivin，mTOR的表達(dá)顯示，各組中均有棕黃色顆粒表達(dá)，荷瘤對(duì)照組最多，順鉑組和低聯(lián)組表達(dá)量有所減少，而中聯(lián)組和高聯(lián)組表達(dá)最少。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，中聯(lián)組和高聯(lián)組與荷瘤對(duì)照組、順鉑組、低聯(lián)組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；低聯(lián)組、荷瘤對(duì)照組、順鉑組兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；中聯(lián)組和高聯(lián)組比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1～5。

caspase-9蛋白在各組中的表達(dá)情況為：荷瘤對(duì)照組中棕黃色顆粒最少，中聯(lián)組和高聯(lián)組棕黃色顆粒最多，順鉑組和低聯(lián)組居中。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：中聯(lián)組和高聯(lián)組與荷瘤對(duì)照組、低聯(lián)組和順鉑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），低聯(lián)組、順鉑組和荷瘤對(duì)照組兩兩比較則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3，6。

4 討論

在肺癌的化療過(guò)程中，耐藥和毒副反應(yīng)是多種多樣的。如食欲減退、嘔吐、骨髓抑制等。對(duì)補(bǔ)中益氣湯的研究很多，沈富林等[7]研究證明，在多種腫瘤的聯(lián)合化療方案中采用補(bǔ)中益氣方，均可有效減輕化療的毒副反應(yīng)。除此之外，將單純化療法和化療聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯法進(jìn)行對(duì)比研究，可以發(fā)現(xiàn)，與單純化療組相比，聯(lián)合組患者毒副反應(yīng)的發(fā)生率顯著降低，李雁等[8]進(jìn)行的相關(guān)研究證實(shí)了此結(jié)果。同時(shí)，還有大量的研究表明，在腫瘤尤其是肺癌的化療方案中，應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯藥不但緩解患者在化療期間的不適反應(yīng)，還可提高放療耐受性，特別是能夠減少放射治療所致炎癥反應(yīng)[9]。本研究以先天性缺乏胸腺的裸鼠為研究對(duì)象，采用典型的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549/DDP細(xì)胞，以皮下移植的方式造模，呈瘤率都在90%以上。在增加了補(bǔ)中益氣湯的干預(yù)后，與順鉑組比較，抑瘤率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示補(bǔ)中益氣湯與順鉑的抑瘤作用有協(xié)同效應(yīng)。免疫組化的結(jié)果表明，順鉑聯(lián)合補(bǔ)中益氣湯干預(yù)后Bad，NF-κB，Survivin，mTOR蛋白的表達(dá)明顯減少，caspase-9蛋白的表達(dá)增多，與順鉑組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），提示聯(lián)合應(yīng)用順鉑和中、高劑量的補(bǔ)中益氣湯后，下調(diào)了腫瘤組織中抗凋亡因子Bad，NF-κB，Survivin，mTOR等因子的表達(dá)，并且上調(diào)促凋亡因子caspase-9的表達(dá)，而在基因檢測(cè)方面，Real-time PCR的結(jié)果顯示以上各因子mRNA的表達(dá)與蛋白表達(dá)的變化是一致的，提示補(bǔ)中益氣湯對(duì)肺癌順鉑耐藥相關(guān)因子的干預(yù)是在基因水平上發(fā)生的，增加腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而使瘤組織體積縮小。

順鉑在進(jìn)入腫瘤細(xì)胞之后，與細(xì)胞的DNA形成加合物并激發(fā)細(xì)胞周期的停止和凋亡過(guò)程的啟動(dòng)，所以在此過(guò)程中，阻礙順鉑與DNA的加合物形成，或其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡的因素都有可能引起順鉑耐藥[10]。核因子-κB（NF-κB）是廣泛存在于真核生物中的一種多功能的核轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中有重要的促進(jìn)作用，這是因?yàn)镹F-κB能夠控制多種細(xì)胞因子和生存基因表達(dá)[11]。Survivin是一種在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的特異性凋亡抑制因子，抑制Survivin的表達(dá)可有效減少腫瘤血管的生成，有研究證明，腫瘤細(xì)胞中大多數(shù)血管生成或抑制因子都是通過(guò)調(diào)節(jié)Survivin的表達(dá)來(lái)發(fā)揮作用的[12]。王淳等[13]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯含藥血清可激活A(yù)549 細(xì)胞內(nèi)caspase-3依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)生，其作用是通過(guò)提高A549細(xì)胞ROS水平，并激活其下游各級(jí)激酶產(chǎn)生的。王雨等[14-15]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)中益氣湯不但可上調(diào)caspase-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平，也可增加caspase-3 蛋白的表達(dá)，從而使二者共同作用，增強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。促凋亡蛋白Bad通過(guò)結(jié)合并滅活抗凋亡的Bcl-2家族蛋白發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用。在之前的研究中，本課題組已經(jīng)闡述補(bǔ)中益氣湯可能通過(guò)調(diào)控PI3K，AKT基因和蛋白的表達(dá)而干預(yù)順鉑的耐藥機(jī)制，并且這種干預(yù)作用具有一定的量效關(guān)系[16]。PI3K/AKT通路可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的抑制，順鉑與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合后，即DNA收到了損傷，這種損傷信息可激活PI3K/AKT通路，從而引起細(xì)胞凋亡閾值增高，產(chǎn)生了對(duì)順鉑的耐受。本研究為了解補(bǔ)中益氣湯在PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，檢測(cè)了此通路下游促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR在補(bǔ)中益氣湯干預(yù)時(shí)表達(dá)的變化，為解釋臨床應(yīng)用補(bǔ)中益氣湯改善肺癌順鉑耐藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

綜上，補(bǔ)中益氣湯抑制肺癌腫瘤生長(zhǎng)的作用，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)A549/DDP細(xì)胞中的促凋亡蛋白Bad，NF-κB，caspase-9以及Survivin和mTOR，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)的，補(bǔ)中益氣湯是培土生金法的代表方藥，對(duì)肺癌患者補(bǔ)虛扶正、培本固元、改善患者生活質(zhì)量、逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥的作用，值得進(jìn)一步研究。

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[15] 井歡，于丹，唐瑩，等.補(bǔ)中益氣湯對(duì)A549/DDP腺癌耐藥動(dòng)物模型中凋亡相關(guān)信號(hào)分子Caspase-9的影響[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2014，20（2）：134.

[16] 劉亞莉，唐瑩，易佳麗，等.補(bǔ)中益氣湯對(duì)肺腺癌順鉑耐藥細(xì)胞株裸鼠移植瘤作用及其制的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（9）：14.