劉愛(ài)平，葉子熊，馬 榆，張周莉，熊 清，李文麗，孫海芹，李 誠(chéng)

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

基于抗單增李斯特菌單鏈抗體的膠體金探針制備及其活性鑒定

劉愛(ài)平，葉子熊，馬 榆，張周莉，熊 清，李文麗，孫海芹，李 誠(chéng)*

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安 625014）

以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備抗單增李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）的單鏈抗體，以膠體金作為示蹤物，優(yōu)化膠體金探針的制備，并經(jīng)免疫滲濾法鑒定膠體金探針的活性。結(jié)果表明該膠體金探針應(yīng)用于免疫滲濾法時(shí)，具有高度特異性，通過(guò)膠體金探針的直接顯色，可判斷陽(yáng)性樣品；對(duì)Lm的最低檢測(cè)限約為107CFU/mL；完成檢測(cè)過(guò)程僅需10 min左右。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于食品中Lm的檢測(cè)。

單增李斯特菌；單鏈抗體；膠體金；免疫滲濾

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，Lm）簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌，是一種對(duì)人畜危害較大的人獸共患病原菌[1]，肉、奶、蛋、水產(chǎn)品、蔬菜以及冷凍食品等均受到不同程度的污染[2]。因此對(duì)Lm的分析檢測(cè)顯得極其重要。Lm的分析檢測(cè)方法主要包括傳統(tǒng)的分離鑒定法[3]、顯色培養(yǎng)基快速檢測(cè)法[4]、分子生物學(xué)方法[5]及基于抗原-抗體反應(yīng)的免疫學(xué)方法[6-7]等。免疫分析技術(shù)因操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、檢測(cè)靈敏等優(yōu)點(diǎn)在食品檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用[8]。

抗體是免疫分析技術(shù)的核心試劑，常用的免疫分析方法中多采用單克隆抗體和多克隆抗體，前者特異性強(qiáng)、靈敏度高，但制備復(fù)雜、價(jià)格較昂貴；后者批間差異大，且易伴隨高交叉反應(yīng)率[9]?；蚬こ炭贵w是隨著分子生物學(xué)技術(shù)而發(fā)展起來(lái)的第3代抗體，其具有制備簡(jiǎn)單、生產(chǎn)周期短、成本低等特點(diǎn)[10]。基因工程抗體主要包括抗原結(jié)合片段、可變區(qū)片段、單鏈抗體（single chain Fv antibody fragment，scFv）、納米抗體等。scFv是由抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)15～20 個(gè)氨基酸的短肽連接而成[11]。scFv能較好地保留其對(duì)抗原的親和活性，并具有分子質(zhì)量小、易于體外表達(dá)等特點(diǎn)，廣泛用于食品安全檢測(cè)等方面[12-13]。

本研究參考文獻(xiàn)報(bào)道合成經(jīng)密碼子優(yōu)化適宜大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）表達(dá)的Lm scFv基因[14]，構(gòu)建pET-22b-scFv重組載體，在E. coli BL21(DE3)中表達(dá)純化；以檸檬酸三鈉法制備膠體金，與純化的scFv結(jié)合制備膠體金探針；采用免疫滲濾法檢測(cè)該膠體金探針的活性。本研究可為實(shí)現(xiàn)食品中的Lm快速篩查、現(xiàn)場(chǎng)快檢提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

菌株：Lm、E. coli DH5α和E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、pET-22b質(zhì)粒由課題組保存；SanPrep柱式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物純化試劑盒、兔源抗組氨酸多克隆抗體 生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶（NcoⅠ、XhoⅠ）、PCR Master mix 日本Takara公司；WesternBright ECL化學(xué)發(fā)光底物 美國(guó)Advansta公司；氯金酸 美國(guó)Sigma公司；硝酸纖維素膜 美國(guó)Pall公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

ST 16R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司；JY 92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)、Chem DocTMXRS+成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；WP700P21微波爐格蘭仕集團(tuán)。

1.2 方法

1.2.1 重組載體pET-22b-scFv的構(gòu)建

參考Paoli等[14]的研究，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成密碼子經(jīng)優(yōu)化（適于E. coli表達(dá)系統(tǒng)）的抗Lm scFv基因片段，采用含NcoⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)的5’和3’引物擴(kuò)增scFv基因片段。分別對(duì)scFv基因片段與pET-22b質(zhì)粒進(jìn)行Nco Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切，以SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物。酶切后的scFv基因片段與pET-22b質(zhì)粒按物質(zhì)的量比6∶1進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，在LB-A（含100 μg/mL氨芐青霉素）固體培養(yǎng)基上37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將疑似正確的克隆菌株測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.2 抗Lm scFv的表達(dá)與純化

將測(cè)序驗(yàn)證的克隆菌株在液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組載體pET-22b-scFv，轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以菌落PCR驗(yàn)證陽(yáng)性克隆。挑取單個(gè)陽(yáng)性克隆菌落接種至LB-AG液體培養(yǎng)基（含0.5%葡萄糖和100 μg/mL氨芐青霉素），110 r/min，37 ℃培養(yǎng)，待OD600nm至0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG），于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)12 h后將菌液離心，棄上清液。以結(jié)合（binding，BD）緩沖液（50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）洗3 次，重懸菌體于20 mL BD緩沖液，在冰浴條件下超聲破碎菌體（超聲30 min，2 s 開(kāi)啟，2 s切斷，功率105 W）。將超聲后混合液在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，采用His標(biāo)簽純化樹(shù)脂親和純化上清液，并以十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot分析scFv表達(dá)與純化效果。

1.2.3 膠體金制備

參考劉穎沙等[15]報(bào)道，對(duì)制備膠體金的各種玻璃器具進(jìn)行清洗，高溫干燥，備用。采用檸檬酸三鈉法制備膠體金，并對(duì)檸檬酸三鈉的加入量進(jìn)行優(yōu)化。具體方案如下：取5 瓶40 mL 0.01%氯金酸分別加入1%檸檬酸三鈉0.4、1.2、1.6、2.4 mL和4.8 mL，充分混勻后，置于微波爐中小火加熱15 min。

通過(guò)目測(cè)得到膠體金的外觀特征，同時(shí)以紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)各條件下制備的膠體金在可見(jiàn)光波長(zhǎng)范圍（400～700 nm）進(jìn)行掃描并記錄結(jié)果。

1.2.4 膠體金探針的制備

1.2.4.1 最適標(biāo)記pH值的確定

取50 μL pH值分別為6、7、8、9和10的膠體金溶液，加入至96 孔酶標(biāo)板，向各孔依次加入純化的scFv，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到25 μg/mL，振蕩混合后室溫放置10 min。每孔加入10 μL 10%氯化鈉溶液，振蕩混合后室溫放置2 h，觀察各孔顏色變化。取膠體金溶液保持紅色不變的pH值，重復(fù)上述過(guò)程，但將scFv終質(zhì)量濃度降至5、4、3、2 μg/mL和1 μg/mL，觀察各孔顏色變化。取膠體金溶液仍保持紅色不變的pH值為最適標(biāo)記pH值。

1.2.4.2 最適scFv標(biāo)記量的確定

取pH值調(diào)至最適值的膠體金溶液50 μL分別加入至96 孔酶標(biāo)板，各孔依次加入不同量的純化scFv，使其質(zhì)量濃度達(dá)到0、10、15、25、30、40 μg/mL，振蕩混合后室溫放置10 min。每孔加入10 μL 10%氯化鈉溶液，振蕩混合后室溫放置2 h，觀察各管顏色變化。使得膠體金溶液保持紅色不變的最小抗體用量即為最低穩(wěn)定量，在此基礎(chǔ)上再加20%即為最適穩(wěn)定量。

1.2.4.3 膠體金探針的制備和純化

將1.2.2節(jié)中純化的scFv置于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 8.0）中透析24 h，將透析后的scFv于4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液。用0.1 mol/L的HCl溶液和K2CO3溶液調(diào)節(jié)至最佳pH值，調(diào)整scFv添加量至最適穩(wěn)定量，搖勻15 min，室溫放置10 min；加入牛血清白蛋白至其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%，緩慢搖勻10 min。將標(biāo)記的膠體金溶液于4 000 r/min離心20 min，收集上清液；4 ℃條件下于13 000 r/min離心50 min，棄上清液；以原體積1/10的膠體金探針稀釋液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清蛋白溶液）重懸沉淀，加入疊氮鈉至其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，置4 ℃保存?zhèn)溆肹16]。

1.2.5 膠體金探針的活性鑒定

1.2.5.1 菌懸液的制備

將受檢菌種Lm、E. coli DH5α分別在含0.6%酵母膏的胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取少量培養(yǎng)液進(jìn)行平板稀釋法計(jì)數(shù)；剩余菌液離心收集，并采用PBS洗滌3 次，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 活性鑒定

采用免疫滲濾法對(duì)上述膠體金探針活性進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟參考諶志強(qiáng)等[17]研究，略有改動(dòng)。在硝酸纖維素膜上分別滴加不同稀釋度的菌樣4 μL，待滲入，加4 μL 5%脫脂牛奶封閉液（溶于0.1% PBST，含0.1%吐溫-20的PBS），待滲入，加6 μL膠體金探針，待滲入，加10 μL洗滌液（0.1% PBST），觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體pET-22b-scFv的構(gòu)建

按照1.2.1節(jié)中方法構(gòu)建重組載體pET-22b-scFv，并轉(zhuǎn)化至克隆菌株E.coli DH5α，經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證（圖1），得到大小約750 bp的片段，與理論值一致。然后將克隆菌株測(cè)序，驗(yàn)證重組載體構(gòu)建成功。

圖1 克隆菌株菌落PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR verif i cation of monoclonal colonies

2.2 抗Lm scFv的表達(dá)與純化

液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)克隆菌株，提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E.coli BL21(DE3)，再次經(jīng)PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功（圖2）。按照1.2.2節(jié)方法誘導(dǎo)scFv表達(dá)，并采用SDS-PAGE和Western blot對(duì)scFv表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。在同等菌濃度條件下（條帶1～3），含重組質(zhì)粒pET-22b-scFv的E.coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在12% SDS-PAGE膠上出現(xiàn)更明顯的大小約27 kD的蛋白條帶（圖3A），經(jīng)過(guò)His標(biāo)簽純化樹(shù)脂親和純化后，獲得的scFv在27 kD和54 kD左右顯示出條帶，且當(dāng)采用兔源抗組氨酸多克隆抗體進(jìn)行Western blot反應(yīng)時(shí)，在27 kD和54 kD左右處也顯示條帶（圖3B）。27 kD處條帶符合scFv預(yù)估分子質(zhì)量大小，54 kD處條帶的出現(xiàn)可能是由于scFv形成了二聚體[11]。

圖2 表達(dá)菌株菌落PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR verif i cation of monoclonal colonies

圖3 scFv表達(dá)的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）分析Fig.3 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analyses of scFv expression

2.3 檸檬酸三鈉還原法制備膠體金

表1 檸檬酸三鈉加入量對(duì)膠體金溶液最大吸收波長(zhǎng)、平均粒徑的影響Table1 Effect of sodium citrate concentration on the maximum absorption wavelength and average particle size of colloidal gold

研究者多用檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、硼氫化鈉為還原劑制備膠體金，其中檸檬酸三鈉法最常用。通過(guò)改變反應(yīng)體系中還原劑的量可得到不同直徑的金顆粒[18]。本研究探索了在40 mL 0.01%氯金酸溶液體系中，檸檬酸三鈉加入量對(duì)膠體金顆粒大小的影響。添加0.4、1.2 mL的1%檸檬酸三鈉溶液所得到的膠體金的顏色偏紫色；當(dāng)添加1.6、2.4、4.8 mL的1%檸檬酸三鈉溶液時(shí)，制得的膠體金顏色為酒紅色，視覺(jué)效果良好、透明度高、無(wú)懸浮顆粒出現(xiàn)。采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)不同檸檬酸三鈉溶液添加量條件下制備的膠體金進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描（400～700 nm），根據(jù)膠體金的最大吸收峰波長(zhǎng)與平均粒徑的線(xiàn)性關(guān)系回歸方程Y = 0.427 1X+514.56（X為納米金平均粒徑；Y為最大吸收峰），可得到膠體金的粒徑（表1）。結(jié)合膠體金顏色及前人研究報(bào)道中膠體金的粒徑[19]，確定本實(shí)驗(yàn)中，40 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%檸檬酸鈉溶液的最佳添加量為2.4 mL，加熱時(shí)間為15 min。

2.4 最適標(biāo)記pH值和scFv標(biāo)記量的確定

膠體金探針的最適標(biāo)記pH值和scFv的最佳標(biāo)記量實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4A可知，pH值為6和10時(shí)，膠體金有明顯褪色現(xiàn)象，將每孔的scFv質(zhì)量濃度分別降至5、4、3、2、1 μg/mL，如圖4B所示，在scFv質(zhì)量濃度為1 μg/mL和2 μg/mL，pH值為7和8的微孔都有褪色現(xiàn)象，故選擇pH 9為最佳標(biāo)記pH值。

圖4 最適標(biāo)記pH和scFv標(biāo)記量的優(yōu)化Fig.4 Optimization of pH and scFv concentration for colloidal gold probe

由圖4C、D觀察可知，除空白外其他孔顏色都較為穩(wěn)定，但15 μg/mL相對(duì)10 μg/mL顏色更加鮮艷，故最低scFv穩(wěn)定量為15 μg/mL，最佳scFv標(biāo)記量為15 μg/mL的1.2 倍，即18 μg/mL。

2.5 膠體金探針的活性鑒定

圖5 膠體金探針的活性鑒定Fig.5 Determination of the activity of colloidal gold probe

采用免疫滲濾法檢測(cè)無(wú)菌水、E. coli DH5α、Lm的結(jié)果如圖5所示。檢測(cè)無(wú)菌水時(shí)，硝酸纖維素膜上無(wú)明顯顏色變化（圖5A）；檢測(cè)濃度約108CFU/mL E. coli DH5α?xí)r，硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣處周?chē)闵⒎植技t色斑點(diǎn)（圖5B）；檢測(cè)濃度約109CFU/mL E. coli DH5α?xí)r，硝酸纖維素膜上點(diǎn)樣處出現(xiàn)較淺的紅色圓圈，靠圓圈邊緣零散分布幾個(gè)紅色斑點(diǎn)（圖5C）；這可能是由于菌液擴(kuò)散引起的。當(dāng)Lm濃度達(dá)到107CFU/mL時(shí)（圖5D），點(diǎn)樣處即出現(xiàn)明顯的紅色圓圈，且圈內(nèi)有大量紅色斑點(diǎn)；該現(xiàn)象與楊小姣[20]的報(bào)道一致。

3 討 論

抗體是免疫學(xué)分析的核心試劑，基于免疫膠體金探針檢測(cè)Lm的免疫學(xué)方法多采用多克隆抗體和單克隆抗體[6-7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展而興起的基因工程抗體備受研究者關(guān)注，基因工程抗體可不經(jīng)動(dòng)物免疫過(guò)程直接篩選獲得，具有成本低、耗時(shí)短、易于修飾、可體外利用原核或真核細(xì)胞表達(dá)等特點(diǎn)[21-23]。本研究以Paoli等[14]報(bào)道的scFv氨基酸序列為基礎(chǔ)，優(yōu)化并合成scFv基因，經(jīng)E. coli表達(dá)系統(tǒng)制備scFv，獲得的scFv特異性強(qiáng)、靈敏度高、且成本低，可為基于免疫學(xué)原理的分析技術(shù)建立提供優(yōu)良試劑。

制備高質(zhì)量的膠體金探針是檢測(cè)Lm的前提，其中pH值和標(biāo)記scFv的用量是兩個(gè)重要的影響因素[24]。因此，本研究對(duì)這兩個(gè)因素都進(jìn)行了優(yōu)化。同時(shí)，膠體金探針制備后須進(jìn)行活性鑒定，以確保膠體金探針的可用性。研究結(jié)果表明將制備的膠體金探針用于免疫滲濾法時(shí)，對(duì)Lm的檢測(cè)限約為107CFU/mL。但是將該探針置于4 ℃保存28 d后，探針喪失活性，這可能是由于scFv相對(duì)完整抗體分子的分子質(zhì)量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性較差[11]等原因造成的，因此后續(xù)需要研究如何提高膠體金探針的穩(wěn)定性，增強(qiáng)膠體金探針的易用性。

免疫膠體金技術(shù)主要包括膠體金免疫層析和膠體金免疫滲濾法。但研究者多采用免疫層析技術(shù)檢測(cè)Lm，鮮見(jiàn)免疫滲濾法的報(bào)道。崔煥忠[7]、Shim[25]等利用單克隆抗體構(gòu)建免疫層析法檢測(cè)Lm的檢測(cè)限均達(dá)到105CFU/mL；Ueda等[26]采用商業(yè)化免疫層析試劑盒檢測(cè)Lm的檢測(cè)限為106CFU/mL；熊?chē)?guó)華[27]利用多克隆抗體構(gòu)建免疫層析法檢測(cè)Lm的敏感性為106CFU/mL。免疫滲濾法操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但本研究的檢測(cè)靈敏度仍有提升的空間。

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Preparation and Activity Determination of Colloidal Gold Probe Based on Anti-Listeria monocytogenes Single Chain Fv Antibody Fragment

LIU Aiping, YE Zixiong, MA Yu, ZHANG Zhouli, XIONG Qing, LI Wenli, SUN Haiqin, LI Cheng*
(College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

In this study, an anti-Listeria monocytogenes (Lm) single chain Fv antibody fragment was expressed in Escherichia coli. After purif i cation, the antibody fragment was used to prepare a colloidal gold probe with colloidal gold as a tracer and the preparation process was optimized. The activity of the probe was determined by using an immunof i ltration assay. The results showed that the colloidal gold probe exhibited high specificity. Positive samples could be directly identif i ed by color development using the probe. The detection limit (LOD) for Lm was approximately 107CFU/mL and the whole process of immunof i ltration assay took approximately 10 min. The method developed is simple, rapid and accurate, and it could be applied for Lm detection in food samples.

Listeria monocytogenes; single chain Fv antibody fragment; colloidal gold; immunof i ltration assay

10.7506/spkx1002-6630-201704049

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0301-05

劉愛(ài)平, 葉子熊, 馬榆, 等. 基于抗單增李斯特菌單鏈抗體的膠體金探針制備及其活性鑒定[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 301-305. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704049. http://www.spkx.net.cn

LIU Aiping, YE Zixiong, MA Yu, et al. Preparation and activity determination of colloidal gold probe based on anti-Listeria monocytogenes single chain Fv antibody fragment[J]. Food Science, 2017, 38(4): 301-305. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704049. http://www.spkx.net.cn

2016-06-20

四川省烹飪科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室一般項(xiàng)目（PZKX2015Z05）；四川省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201610626077）

劉愛(ài)平（1986—），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c免疫學(xué)檢測(cè)。E-mail：aipliu@outlook.com

*通信作者：李誠(chéng)（1964—），男，教授，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制。E-mail：lichenglcp@163.com