陳 雷，劉紅兵，羅立廷

（中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心，湖北 武漢 430071）

氫核磁共振結(jié)合正交偏最小二乘法對油菜蜜中果葡糖漿摻假的判別分析

陳 雷，劉紅兵，羅立廷

（中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所，波譜與原子分子物理國家重點實驗室，武漢磁共振中心，湖北 武漢 430071）

利用氫核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）譜圖結(jié)合正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法對油菜蜂蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜進行判別分析。采集了303 個油菜蜜樣品和180 個按照不同比例配制的果葡糖漿摻假蜂蜜樣品的1H NMR譜圖，并對油菜蜜主要糖類成分和部分低含量化合物進行了信號歸屬。采用OPLS對訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進行分析，建立蜂蜜果葡糖漿摻假判別模型。通過排列實驗法對模型進行可靠性檢驗。結(jié)果顯示，油菜蜜和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品在OPLS得分圖中能明顯區(qū)分。訓(xùn)練集和測試集樣品的總體判別正確率分別為98.40%和98.24%。因此，1H NMR與OPLS相結(jié)合可以實現(xiàn)油菜蜜中果葡糖漿摻假的快速鑒別。該方法是基于對蜂蜜成分的整體分析，避免了僅僅分析個別成分指標的檢驗方法中存在的缺陷，為蜂蜜質(zhì)量監(jiān)控提供了一種新思路。

蜂蜜；核磁共振；正交偏最小二乘法；摻假

蜂蜜是一種蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或者蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。作為一種天然保健品和營養(yǎng)品，深受廣大消費者的青睞。盡管國家標準中明確規(guī)定蜂蜜是天然物質(zhì)，不允許人為添加和去除任何物質(zhì)，但目前國內(nèi)市場上蜂蜜摻假現(xiàn)象屢禁不止，嚴重損害了廣大消費者的利益，影響了蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。蜂蜜市場摻假嚴重的原因主要有4點：1）蜂蜜中主要糖類物質(zhì)是葡萄糖、果糖，結(jié)構(gòu)比較簡單，同時受蜜源植物種類、花期長短、氣候以及蜂蜜的加工、儲存、結(jié)晶等多種因素影響，造成蜂蜜各成分的含量波動范圍較大，這些客觀原因，使得蜂蜜摻假簡單、方便；2）目前摻假的主要手段是在蜂蜜中加入外源植物糖漿，例如玉米糖漿、甜菜糖漿、大米糖漿等[2-3]，市場上糖漿的價格遠低于蜂蜜的價格，不法生產(chǎn)廠商從摻假蜂蜜中能獲得更多的經(jīng)濟利益；3）摻假蜂蜜本身對人體危害程度不及其他一些摻假食品，沒有引起消費者的高度警惕；4）缺乏有效檢測手段，導(dǎo)致打擊蜂蜜摻假面臨困難。

蜂蜜品質(zhì)的傳統(tǒng)檢測方法包括感官鑒別、花粉分析以及理化指標測試[4-6]。感官鑒別帶有一定的主觀性、經(jīng)驗性；花粉分析受到的外界影響因素較多，存在較大的不確定性；僅依靠理化指標測試已不能區(qū)分蜂蜜的真假。近年來，利用先進的現(xiàn)代儀器設(shè)備，針對蜂蜜摻假發(fā)展了多種檢測分析技術(shù)和方法，主要包括穩(wěn)定碳同位素比率法[7-9]、色譜分析（氣相色譜、高效液相色譜、薄層色譜、離子色譜）及其聯(lián)用技術(shù)[10-15]、光譜分析（近紅外、熒光、拉曼、紫外-可見吸收光譜）[16-22]、淀粉酶檢測法[23-24]、差示掃描量熱法[25]、電子鼻[26]等。這些方法都存在缺點，并只在一定范圍內(nèi)適用[2,27]。因此，糖漿摻假蜂蜜的識別問題還沒有得到完全解決。檢測技術(shù)的滯后影響到蜂蜜產(chǎn)品的質(zhì)量保證和食用安全，必須進一步開展蜂蜜摻假的鑒別研究，建立一套靈敏、準確、高效、普適的蜂蜜摻假鑒定方法，以保護消費者利益和保證蜂蜜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

氫核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1H NMR）是一種非常重要的研究和分析測試工具，在化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，對有機小分子和生物大分子的結(jié)構(gòu)解析具有重要作用。NMR技術(shù)有如下特點：1）樣品預(yù)處理簡單，無需預(yù)篩選，可以避免由于分離所造成的微小成分的丟失；2）無損傷性，不會破壞樣品的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，可以進行實時和動態(tài)的檢測；3）譜圖中信號的相對強弱直接反映了樣品中各組分的相對含量；4）可設(shè)計多種編輯手段，實驗方法靈活多樣。

采用1H NMR技術(shù)測試食品等復(fù)雜混合體系可以得到樣品中多種化學(xué)成分的信息[28-29]，但是各種成分信號的重疊也使得圖譜變得十分復(fù)雜。通常，僅靠肉眼觀察只能從NMR圖譜中獲得很有限的信息。而多元統(tǒng)計分析可以有效而全面地分析譜圖數(shù)據(jù)，從復(fù)雜的數(shù)據(jù)中最大限度地提取信息，建立數(shù)學(xué)模型。通常采用的多元統(tǒng)計分析方法包括主成分分析、聚類分析、偏最小二乘（partial least squares，PLS）法、正交偏最小二乘（orthogonal partial least squares，OPLS）法、支持向量機等。其中OPLS法是在PLS法的基礎(chǔ)上提出的一種新型的多元統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析方法[30]，其最大的特點是可以去除自變量X中與分類變量Y無關(guān)的變化，使分類信息主要集中在一個主成分中，模型變得簡單和易于解釋，其判別效果及主成分得分圖的可視化效果更加明顯[31]。

1H NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析在食品研究中已得到比較廣泛的使用，在食品成分分析、真?zhèn)舞b別、品質(zhì)評價和產(chǎn)地、年份區(qū)分等領(lǐng)域有很多應(yīng)用成果[32-35]。Godelmann等[32]報道了1H NMR結(jié)合多元統(tǒng)計分析應(yīng)用于葡萄酒種類、產(chǎn)地和釀造年份的區(qū)分；Schievano等[33]采集了118 份蜂蜜氯仿提取物的1H NMR譜圖，結(jié)合主成分分析和PLS進行蜂蜜溯源分析；李愛平等[34]對食醋的1H NMR數(shù)據(jù)利用判別-PLS法進行分析，建立了食醋品種分類模型，比較了不同食醋的差異化學(xué)成分；蔡波太等[35]結(jié)合聚類和判別分析建立了鑒別地溝油的模型，盲測的正確率達93.8%。

本實驗利用1H NMR技術(shù)結(jié)合OPLS法對蜂蜜摻假進行鑒別研究。首先采集油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品的1H NMR譜圖，對譜圖進行分析，歸屬特征信號。然后利用OPLS對譜圖的分段積分數(shù)據(jù)矩陣進行分析，建立真假蜂蜜鑒別模型。最后對訓(xùn)練集和測試集樣品進行鑒別，驗證模型的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用的蜂蜜來至湖北省仙桃、松滋、漢川以及湖南省澧縣等地區(qū)的養(yǎng)蜂場，品種為油菜花蜜。為保證樣品的真實性，直接從蜂箱中的巢脾取樣，選取自然釀造成熟的封蓋蜂蜜采集。共收集了303 個樣品，貯藏在4～8 ℃冰箱中備用。

摻假用的果葡糖漿從市場上采購。共購買了8 家生產(chǎn)商的18 種不同規(guī)格的果葡糖漿。將果葡糖漿按質(zhì)量比（m糖漿/m蜂蜜）5%、10%、30%、50%以及70%加入到油菜蜜中。每種果葡糖漿分別摻入任選的2 個油菜蜜樣品，共配制糖漿摻假蜂蜜樣品180 份。

1.2 試劑

K2HPO4·3H2O、NaH2PO4·2H2O（均為分析純）上海國藥集團試劑有限公司；NaN3（分析純） 天津福晨化學(xué)試劑廠；重水（D2O，99.9%氘代，含0.05 g/100 mL 2,2,3,3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（2,2,3,3,-d(4)-3-(trimethylsilyl)propionic acid sodium salt，TSP）） 美國Cambridge Isotope Laboratories公司；用于樣品制備的磷酸鹽緩沖溶液（0.15 mol/L K2HPO4/NaH2PO4，pH 7.40）使用含10% D2O的雙蒸水配制而成。其中緩沖溶液包含的TSP和NaN3（0.01 g/100 mL）分別用作化學(xué)位移內(nèi)標物和防腐劑。

1.3 儀器與設(shè)備

AVANCE 500MHz液體NMR儀（配有寬帶反相檢測探頭、自動進樣器） 瑞士布魯克公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；移液槍德國艾本德公司；Micro 17R微量臺式離心機 美國賽默飛世爾科技公司；5 mm核磁管 美國諾雷爾公司。

1.4 方法

1.4.1 NMR樣品的制備

先將油菜蜜從冰箱取出，放置至室溫。對于已結(jié)晶的樣品，在60 ℃水浴中加熱，待樣品完全溶解，再進行取樣。稱取蜂蜜樣品50.00 mg，置于離心管中，加入600 μL磷酸鹽緩沖溶液。在渦旋混合器上振蕩10 min，實現(xiàn)均勻混合?；旌衔镫x心10 min，取550 μL上清液轉(zhuǎn)移到5 mm NMR管中。共配制303 個油菜蜜的NMR樣品待檢。

對于糖漿摻假蜂蜜，按上面所述方法，共配制成180 個NMR待測樣品。

對于果葡糖漿，按上面所述方法，共配制成18 個NMR待測樣品。

1.4.2 NMR測試及數(shù)據(jù)處理

油菜蜜樣品、糖漿摻假樣品以及果葡糖漿樣品的NMR測試在500 MHz液體NMR儀上進行，使用寬帶反檢測探頭，溫度298 K。采用noesypr1d脈沖序列（90°-t1-90°-tm-90°-采樣）采集1D1H NMR譜。序列中90°脈沖的脈寬為10.2 μs，t1和tm（混合時間）分別設(shè)為4 μs和100 ms，延遲等待時間為2.0 s。采用預(yù)飽和方法進行水峰抑制，即施加強度約為50 Hz的低功率連續(xù)波脈沖照射水峰，持續(xù)時間2.0 s。1H NMR的譜寬設(shè)為δ 20，采樣點數(shù)為32 768，信號累加次數(shù)為64 次。

使用Topspin軟件（3.2, Bruker Biospin）對采集到1D1H NMR數(shù)據(jù)進行處理。變換點數(shù)設(shè)為65 536，指數(shù)線寬因子為0.3 Hz，手動調(diào)相位和基線校正。內(nèi)標TSP的共振峰設(shè)為δ 0.00，進行化學(xué)位移定標。將處理好的1H NMR譜圖導(dǎo)入AMIX軟件（3.9.11，Bruker Biospin）中進行分段積分。為消除殘余水信號的影響，剔除δ 4.73～δ 4.93區(qū)間的信號。采用峰面積歸一化，即各分段積分值除以積分區(qū)域總的峰面積，得到歸一化的強度積分數(shù)據(jù)。

1.4.3 多元統(tǒng)計分析

1.4.3.1 訓(xùn)練集和測試集的構(gòu)建

從303 個油菜蜜樣品中隨機選出213 個樣品，從180 個糖漿摻假蜂蜜樣品中選出100 個樣品（5 種糖漿摻入量，每種各20 個），構(gòu)成訓(xùn)練集，共313 組強度積分值數(shù)據(jù)；余下的90 個油菜蜜樣品和80 個糖漿摻假蜂蜜樣品（5 種糖漿摻入量，每種各16 個）組成測試集，共170 組強度積分值數(shù)據(jù)。

1.4.3.2 OPLS法

油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品的類別變量值分別設(shè)為1和2，作為因變量（Y變量）。歸一化的強度積分值作為自變量（X變量）。將訓(xùn)練集數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P+ 14.0（Umetrics, Ume?, Sweden）軟件中，采用自適換算進行標準化。隨后進行OPLS計算，得到判別模型。采用排列實驗法對模型的可靠性進行檢驗。將測試集樣品的數(shù)據(jù)代入經(jīng)過檢驗的模型，計算得到各樣品的類別變量值。當類別變量Y在1±0.5之間時，樣品判斷為油菜蜜；當類別變量Y在2±0.5之間時，樣品判斷為糖漿摻假蜂蜜。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜜1H NMR譜圖分析

圖1 油菜蜜樣品的1H NMR譜圖Fig.1 Complete1H NMR spectrum with local enlargement of a rape honey

圖1a顯示了油菜蜜樣品的1H NMR譜圖，大致可以分成3 個區(qū)域，包括脂肪區(qū)（δ 0.00～δ 3.00）、糖類化合物區(qū)（δ 3.00～δ 6.00）和芳香區(qū)（δ 6.00～δ 9.50）。通過化學(xué)位移、J偶合常數(shù)、文獻數(shù)據(jù)對照[36-40]以及13C NMR譜、1H-1H化學(xué)位移相關(guān)譜、1H-13C異核單量子相干譜可以對其中大部分信號進行歸屬，鑒定出多個化合物。比較強的共振峰都集中在δ 3.00～δ 6.00之間，主要是蜂蜜中葡萄糖和果糖的信號。蜂蜜中存在α-吡喃葡萄糖（α-glucopyranose，α-Glu）和β-吡喃葡萄糖（β-glucopyranose，β-Glu）兩種葡萄糖構(gòu)型。δ 5.243的雙峰信號歸屬為來自α-吡喃葡萄糖的C（1）H，受到C（2）H的偶合而裂分，J偶合常數(shù)為3.75 Hz；β-吡喃葡萄糖C（1）H的化學(xué)位移為δ 4.654，受C（2）H的偶合而裂分成雙峰，J偶合常數(shù)為7.95 Hz。β-吡喃葡萄糖C（2）H的化學(xué)位移為δ 3.252，分別受到C（1）H和C（3）H的偶合，為雙二重峰形。果糖在蜂蜜中主要以β-吡喃果糖（β-fructopyranose，β-FP）、α-呋喃果糖（α-fructofuranose，α-FF）和β-呋喃果糖（β-fructofuranose，β-FF）3 種構(gòu)型存在。β-FP的含量最高，β-FF次之，α-FF最少。果糖的信號主要集中在δ 3.5～δ 4.2之間（圖1b），可以觀察到β-FP的C（6）H?為dd峰形，其中一個雙重峰的化學(xué)位移為δ 4.041，另一個雙重峰與α -FF 4（C）H、β-FPC（5）H的信號重疊（δ 4.028～δ 3.983）；δ 4.088～δ 4.15的信號來至α-FF C（4）H和β-FF C（3）H、C（4）H。葡萄糖、果糖的詳細1H NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1 油菜蜜中主要糖類化合物的1H NMR數(shù)據(jù)Table1 1H NMR data for carbohydrates present in rape honey

續(xù)表1

表2 油菜蜜中低含量化合物的1H NMR數(shù)據(jù)Table2 1H NMR data for minor compounds present in rape honey

脂肪區(qū)的共振峰主要來自氨基酸、有機酸以及乙醇等化合物。可以觀察到纈氨酸、乙醇、乳酸、丙氨酸和乙酸的CH3基團信號以及脯氨酸、谷氨酰胺、琥珀酸的CH2基團信號（圖1c），例如δ 1.188的三重峰信號來自乙醇的CH3基團；δ 1.483的雙峰信號歸屬為丙氨酸的CH3基團，J偶合常數(shù)為7.34 Hz；δ 2.408的單峰信號歸屬為琥珀酸的CH2基團。芳香區(qū)處于譜圖的低場區(qū)，可以鑒定出5-羥甲基糠醛、酪氨酸、苯丙氨酸以及甲酸（圖1d）。例如，可以觀測到酪氨酸苯環(huán)上的C（3）H、C（5）H和C（2）H、C（6）H兩組質(zhì)子的雙重峰信號，化學(xué)位移分別為δ 6.906、δ 7.197。以上化合物的共振峰都較弱，反映出其在蜂蜜中的含量較少。各化合物在油菜蜜1H NMR中出現(xiàn)的特征峰歸屬見表2。

2.2 果葡糖漿和果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜

果葡糖漿也稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿。工業(yè)上主要采用淀粉為原料，經(jīng)過液化、糖化轉(zhuǎn)化成葡萄糖，再經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶將其中的一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，形成果糖和葡萄糖的混合糖漿。按照國家標準[41]，果糖和葡萄糖的含量應(yīng)占糖漿干物質(zhì)的92%以上。本實驗共收集了18 種果葡糖漿，每種糖漿都采集了1H NMR譜。圖2顯示了其中一個果葡糖漿的1H NMR譜。與油菜蜜的1H NMR譜一致，強的共振峰都出現(xiàn)在δ 3.00～δ 6.00之間，主要是葡萄糖和果糖的信號。而在脂肪區(qū)與芳香區(qū)，分別可以觀察到乳酸、乙酸以及甲酸的共振峰，其他信號較少。油菜蜜1H NMR譜中出現(xiàn)的丙氨酸、脯氨酸等5 種氨基酸的特征峰并未在該果葡糖漿樣品的1H NMR譜中觀察到。同時，也沒有發(fā)現(xiàn)果葡糖漿自身獨有的共振峰。其余17 個果葡糖漿的1H NMR譜與之類似，限于篇幅未列出。

果葡糖漿成分單一，油菜蜜成分復(fù)雜。對于油菜蜜含有而果葡糖漿不含有的化合物，糖漿的摻入起著一種“稀釋”作用。隨著糖漿摻入量的增加，這些化合物的含量在降低。在1H NMR譜上可以觀察到其相應(yīng)的共振峰亦隨之下降。圖2顯示了果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜，糖漿配制比例分別為5%和50%。對于果葡糖漿摻入量樣品（5%），稀釋效應(yīng)不明顯，其1H NMR譜與油菜蜜樣品的1H NMR譜極為相似，很難區(qū)分。而果葡糖漿摻入量樣品（50%），稀釋效應(yīng)較明顯，觀察到丙氨酸、脯氨酸等5 種氨基酸，其特征峰的強度都有下降。

圖2 果葡糖和果葡糖漿摻假蜂蜜的1H NMR譜Fig.2 1H NMR spectra of high fructose syrup and adulterated honey samples

2.3 正交成分個數(shù)的確定

OPLS的最大特點是可以去除自變量X中與因變量Y無關(guān)的數(shù)據(jù)變異（即與Y正交的成分）。通過反復(fù)迭代，逐次增加去除的正交成分，可以有效地消除數(shù)據(jù)中的結(jié)構(gòu)噪聲和信息冗余。正交成分數(shù)的多少對模型的預(yù)測性能有一定影響。對于1.4.3節(jié)構(gòu)建的訓(xùn)練集和測試集數(shù)據(jù)（積分區(qū)間為δ 0.1～δ 9.5，積分間隔為δ 0.004），依次增加去除的正交成分數(shù)，分別建立OPLS模型。利用這些模型對訓(xùn)練集和測試集樣品進行判別，將發(fā)生誤判的樣品個數(shù)作為衡量模型優(yōu)劣的一個指標，誤判數(shù)越少，模型性能越好。正交成分數(shù)對模型的影響如圖3所示。

圖3 正交成分數(shù)對樣品誤判數(shù)的影響Fig.3 Effect of orthogonal components on misclassif i cation

從圖3可以看出，對訓(xùn)練集樣品的誤判數(shù)隨著正交成分數(shù)的增加而減少，例如正交成分數(shù)為1，誤判個數(shù)為29；正交成分數(shù)增加到11，則只有1例誤判。對于測試集樣品，誤判數(shù)隨著正交成分數(shù)的增加先減少后增加。正交成分數(shù)等于7時，誤判數(shù)最少（9 例）；正交成分數(shù)為11，誤判個數(shù)增加到17。這說明模型中去除的正交成分數(shù)過多會導(dǎo)致過擬合現(xiàn)象，即訓(xùn)練集判別正確率很高而測試集判別正確率較低。因此確定最佳的正交成分數(shù)不能僅僅依靠訓(xùn)練集的結(jié)果，還應(yīng)參考測試集的計算結(jié)果。在后面的計算中，正交成分數(shù)都確定為7。

2.41H NMR譜積分區(qū)間的選擇

在利用1H NMR譜建模過程中，需要選擇合適的化學(xué)位移區(qū)域，進行分段積分。如果選取的積分區(qū)間過小，將會因不能完整反映樣品的信息而導(dǎo)致模型預(yù)測準確度降低；如果選取的積分區(qū)間過大，引入的噪聲信號會增加，降低建模和預(yù)測效率。如有研究者在對啤酒1H NMR數(shù)據(jù)的主成分分析中，經(jīng)過比較只選擇了碳水化合物區(qū)間（δ 3.0～δ 5.5）的積分數(shù)據(jù)[38]。根據(jù)2.1節(jié)的分析，油菜蜜樣品的1H NMR譜圖可以分成3 個區(qū)域，因此建立了5 種積分區(qū)間。積分區(qū)間1（δ 0.1～δ 9.5）包括了脂肪區(qū)、糖類化合物區(qū)和芳香區(qū)，相當于全譜；積分區(qū)間2（δ 0.1～δ 6.0）由脂肪區(qū)、糖類化合物區(qū)組成；積分區(qū)間3（δ 3.0～δ 9.5）由糖類化合物區(qū)和芳香區(qū)組成。積分區(qū)間4去除了信號最強的糖類化合物區(qū)，只含脂肪區(qū)（δ 0.1～δ 3.0）和芳香區(qū)（δ 6.0～δ 9.5）。積分區(qū)間5 只包含糖類化合物區(qū)（δ 3.0～δ 6.0）。表3列出了采用不同積分區(qū)間建立的OPLS模型對訓(xùn)練集和測試集樣品進行判別的結(jié)果，包括訓(xùn)練集的交叉驗證均方根誤差（root mean square error of cross validation，RMSECV）和測試集的預(yù)測均方根誤差（root mean square error of predication，RMSEP）。從表3可以看出，選擇不同的積分區(qū)間確實會對模型的預(yù)測性造成一定影響?？疾煊?xùn)練集的交叉驗證誤判數(shù)，積分區(qū)間1和2的結(jié)果相接近，明顯低于其他3種積分區(qū)間。對測試集樣品進行判別，采用積分區(qū)間2建立的OPLS模型的誤判數(shù)為3，RMSEP為0.264 1，小于積分區(qū)間1的結(jié)果（誤判數(shù)為9，RMSEP為0.302 1）。因此積分區(qū)間2是最佳的選擇。這也可以從譜圖分析中得到解釋。芳香區(qū)的信號較少，并且強度比較弱。積分區(qū)間包含芳香區(qū)后反而增加了噪聲信號，導(dǎo)致模型性能下降。在以下的計算中均選擇積分區(qū)間2（δ 0.1～δ 6.0）進行分段積分。

表3 基于不同積分區(qū)間建立的模型對訓(xùn)練集和測試集的判別結(jié)果Table3 Results of discrimination of training and testing sets based on models with various integral regions

2.5 基于OPLS的蜂蜜摻假判別

構(gòu)建的訓(xùn)練集中包含313 個樣品（油菜蜜樣品213 個，糖漿摻假蜂蜜樣品100 個），選擇的積分區(qū)間為δ 0.1～δ 6.0，積分間隔為δ 0.004。剔除殘余的水信號，共獲得1 426 個強度積分變量，構(gòu)成313×1 426的數(shù)據(jù)矩陣。利用OPLS對其進行分析，建立模型。當去除7個正交成分后，模型的和Q2分別達到了0.852、0.783，其中和Q2分別表示模型對因變量Y的擬合能力以及模型的預(yù)測能力。以預(yù)測成分的得分值（tp[1]）和第1個正交成分的得分值（to[2]）分別作為橫縱坐標繪制得分散點圖。如圖4所示，油菜蜜樣品和糖漿摻假蜂蜜樣品可以在得分散點圖上明顯區(qū)分，即組內(nèi)聚集、組間分開，可視化效果明顯。

圖4 訓(xùn)練集樣品OPLS得分圖Fig.4 OPLS score plot of training set

為驗證模型的可靠性，采用排列實驗法。該方法保持X變量不變，通過隨機變化Y變量的順序，觀察多個Y變量的順序隨機排列的模型與原始Y變量模型之間的差異。然后對Y變量順序隨機排列模型的R2值、Q2值與原始鑒別模型的R2值、Q2值之間做回歸線?；貧w線的斜率越大，與縱軸的截距越小，提示有越多的數(shù)據(jù)用來解釋模型，因而模型的預(yù)測能力也比較好。若原始模型的預(yù)測能力（Q2值）大于任何一個Y變量隨機排列模型的預(yù)測能力，則模型質(zhì)量較好，反之此模型較差。判別模型可靠性的驗證如圖5所示，共進行160 次隨機排列，R2回歸線、Q2回歸線與縱軸的截距分別為0.301、-0.429。最右端原始鑒別模型的Q2值大于左邊任何一個Y變量隨機排列模型的Q2值。因此驗證結(jié)果顯示模型有效可靠。

圖5 排列實驗對OPLS模型的可靠性驗證Fig.5 Validation of OPLS model by permutation test

利用OPLS鑒別模型對訓(xùn)練集和測試集樣品的類別變量值進行計算。計算值在1±0.5之間的樣品為油菜蜜樣品，計算值在2±0.5之間的為糖漿摻假蜂蜜樣品。若計算值不在上述范圍內(nèi)，則判定樣品歸類不明確。圖6中以樣品類別變量的真實值為縱坐標，計算值為橫坐標，繪制散點圖，反映了訓(xùn)練集和測試集中樣品類別變量真實值與計算值之間的關(guān)系。從圖6a可以發(fā)現(xiàn)，訓(xùn)練集中共有5 個樣品發(fā)生了誤判，其中假陽性2 個（油菜蜜樣品判別為糖漿摻假樣品），假陰性3 個（糖漿摻假樣品判別為油菜蜜樣品）?？傮w正確率為98.40%。將測試集數(shù)據(jù)帶入訓(xùn)練集創(chuàng)建的OPLS模型中進行驗證，根據(jù)計算得到的類別變量值判斷樣品的真假。類別變量計算值與真實值之間的差異由RMSEP表示。測試集的總體正確率為98.24%，只有3 個樣品的判別結(jié)果為假陰性，RMSEP為0.264 1。上述計算結(jié)果可以說明OPLS模型對判斷蜂蜜摻假具有較高的可靠性。

圖6 訓(xùn)練集（a）和測試集（b）中樣品類別變量真實值與計算值之間的關(guān)系圖Fig.6 Relationship between real value and calculated values of training (a) and testing sets (b)

在上述判別分析中，共出現(xiàn)6 例假陰性（訓(xùn)練集樣品3 個，測試集樣品3 個）。經(jīng)檢查，發(fā)生誤判的這些樣品的果葡糖漿摻入量都較低，其中5%糖漿摻入量的樣品有4 個，10%糖漿摻入量樣品有2個。而糖漿摻入量在30%以上的樣品都得到正確判斷。表4列出了不同糖漿摻入量樣品的均方根誤差及判別結(jié)果。均方根誤差越小，代表判別的可靠性越高。從表4可以看出，較高糖漿摻入量樣品（30%以上）的均方根誤差明顯比低糖漿摻入量樣品（5%、10%）的小。說明不同的糖漿摻入量確實會對樣品的判別造成一定影響。

表4 OPLS模型對不同糖漿摻入量樣品的判別結(jié)果Table4 Results of discrimination of adulterated samples with various syrup concentrations based on OPLS model

3 結(jié) 論

本實驗采用1H NMR技術(shù)和OPLS分析結(jié)合的方法進行蜂蜜果葡糖漿摻假的判別分析，建立了數(shù)學(xué)模型，其結(jié)果能很好地區(qū)分油菜蜜樣品和果葡糖漿摻假蜂蜜樣品，并在譜圖分析、數(shù)據(jù)處理和模型驗證等方面進行了研究探討。對蜂蜜的主要成分葡萄糖、果糖的1H NMR信號進行了全部歸屬，發(fā)現(xiàn)了蔗糖、丙氨酸、酪氨酸等10 個低含量化合物的特征峰。討論了在建立OPLS判別模型中正交成分數(shù)以及1H NMR譜積分區(qū)間的選擇。經(jīng)過比較，最佳的正交成分數(shù)確定為7，譜圖積分區(qū)間為δ 0.1～δ 6.0。包含313 個樣品的訓(xùn)練集建立的OPLS判別模型對訓(xùn)練集和測試集樣品的判別正確率分別達到了98.40%和98.24%，表明模型對蜂蜜果葡糖漿摻假具有較高的判別能力?？傮w來講，1H NMR技術(shù)具有制備樣品簡單，采樣迅速，能夠獲得樣品全面的化學(xué)組成信息，與OPLS分析方法結(jié)合能夠方便、快捷、準確地判別蜂蜜糖漿摻假，為蜂蜜質(zhì)量評估鑒定提供了一條新途徑。

今后研究將會進一步收集各類蜂蜜樣品（包括摻假蜂蜜），不斷擴充數(shù)據(jù)庫的樣本數(shù)量，對本實驗建立的方法和模型進行考察；同時充分利用NMR中的各種技術(shù)，并結(jié)合化學(xué)計量學(xué)手段，尋找真假蜂蜜之間的化學(xué)差異成分，為蜂蜜質(zhì)量監(jiān)控提供參考。

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Detection of Honey Adulteration with High Fructose Syrups Using1H Nuclear Magnetic Resonance and Orthogonal Partial Least Squares

CHEN Lei, LIU Hongbing, LUO Liting
(National Center for Magnetic Resonance in Wuhan, State Key Laboratory of Magnetic Resonance and Atomic and Molecular Physics, Wuhan Institute of Physics and Mathematics, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China)

Combination of1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy and orthogonal partial least squares (OPLS) was successfully employed to detect rape honey adulteration with high fructose syrups. Three hundred and three authentic and 180 adulterated honey samples were analyzed. Glucose, sucrose and 13 minor components in honey samples were detected and identif i ed from their1H NMR spectra. The OPLS model based on NMR data was applied to detect adulteration in honey falsif i ed by intentional addition of different concentrations of high fructose syrups. A distinct discrimination between authentic and adulterated honey samples was achieved in OPLS score plot. Overall classif i cation rates of training set and testing set were 98.40% and 98.24%, respectively. Hence,1H NMR spectroscopy coupled with OPLS offered a rapid and accurate tool for honey adulteration detection. The method avoided the disadvantage of monocomponent analysis and provided a potential standard for quality control of honey.

honey; nuclear magnetic resonance (NMR); orthogonal partial least squares (OPLS); adulteration

10.7506/spkx1002-6630-201704045

TS207.3

A

1002-6630（2017）04-0275-08

陳雷, 劉紅兵, 羅立廷. 氫核磁共振結(jié)合正交偏最小二乘法對油菜蜜中果葡糖漿摻假的判別分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(4): 275-282. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201704045. http://www.spkx.net.cn

CHEN Lei, LIU Hongbing, LUO Liting. Detection of honey adulteration with high fructose syrups using1H nuclear magnetic resonance and orthogonal partial least squares[J]. Food Science, 2017, 38(4): 275-282. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201704045. http://www.spkx.net.cn

2016-06-15

中國科學(xué)院儀器設(shè)備功能開發(fā)技術(shù)創(chuàng)新項目（YG2011095）

陳雷（1977—），男，高級工程師，博士，研究方向為磁共振技術(shù)及應(yīng)用。E-mail：chenlei@wipm.ac.cn